小型化PCR儀溫度單元優化與實現

李建興，楊睿寧，蔡 聰，沈 亮，羅 堪

(福建工程學院電子電氣與物理學院，福建 福州 350117)

0 引言

1985年，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR[1-2])技術由美國Cetus公司的Kary Mullis發明。此后，其迅速發展成為一種能夠廣泛應用于擴增特定核酸片段的分子生物學技術[3-5]。PCR儀是通過控制樣品DNA在變性、退火與延伸三個步驟按預設的反應流程進行溫度循環控制后,將DNA片段成倍擴增的儀器。目前，市場上較為常見的實時定量PCR儀價格昂貴，且大多為固定實驗室科研使用。小型化PCR儀的研發對現場應急檢測及推進基礎醫療點建設有著深遠的意義[6]。因此，研發易操作、低成本、高精度的小型化PCR儀是當下的迫切需求。

針對小型化PCR設計，美國賓夕法尼亞大學的Liao[7]等采用全新的基于環介導等溫擴增技術 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP[8])方案，通過化學發熱的方法提供相對恒定的溫度環境(60～65 ℃)進行DNA擴增反應。但LAMP方法對引物有較高的要求，且LAMP的靈敏度反而大大低于PCR。VKD Oliveira[9]等為了降低儀器價格并簡化溫度單元結構，將傳統的印刷電路板(printed circuit board,PCB)作為加熱元件，使用計算機風扇進行制冷，設備成本約為350元，最大升/降溫速率可達到2.0 ℃/s，并可以完成對單個試管內DNA樣品的檢測。該方案雖然可以大幅降低PCR儀成本，但其溫度單元設計方案僅可對單個樣品進行反應且控制精度較低。PCR反應體積減小后，更容易受到外界波動的影響。因此，要保證高精確度快速控溫，在溫度單元優化以及控制算法設計等方面仍需進一步研究。

本文通過對PCR儀溫度單元進行小型化設計，并提出有限元結合遺傳算法對基座熱包覆結構進行優化。采用基于H橋驅動器的分段比例積分微分(proportional integral differential,PID)溫度控制方案實現小型化PCR溫度循環控制，搭建了圖形用戶界面(graphic user interface,GUI)以及小型化16孔PCR儀樣機。最終通過對樣機溫度單元性能指標(快速性，即升/降溫速率；準確性，即穩態誤差；均勻性即基座表面溫度均勻性)設計相應試驗，測試并驗證本文所采取優化方案成效，對該樣機性能通過致病疫霉菌DNA擴增試驗進行了表征。

1 小型化PCR系統設計

本文設計了一款小型化16孔PCR樣機系統。系統架構主要由溫度單元、控制器及GUI組成。

系統預制定指標為升/降溫速率分別達到2.5 ℃/s與2 ℃/s，穩態誤差在±0.4 ℃內且基座試管孔間溫度均勻性<0.4 ℃。所設計的小型化PCR溫度單元包含了PCR基座、PT1000熱電阻、半導體制冷片及散熱裝置。通過NI myRIO獲得PT1000熱電阻測得的基座溫度，并利用所設計的分段PID控制算法對H橋驅動器脈沖寬度調劑(pulse width modulation,PWM)輸入占空比進行整定，實現對半導體制冷片的工作功率及電流方向控制。同時，設計GUI實現對PCR循環參數及控制器參數的設定與實時數據的分析。

小型化PCR樣機系統架構如圖1所示。

圖1 小型化PCR樣機系統架構圖Fig.1 Miniaturized PCR prototype system architecture diagram

1.1 小型化PCR溫度單元設計

小型化PCR儀溫度單元設計如圖2所示。

圖2 小型化PCR儀溫度單元設計Fig.2 Design of miniaturized PCR instrument temperature unit

圖2(a)為基座與溫度循環部分的3D結構圖。該結構總體尺寸為120 mm×120 mm×90 mm，質量為0.5 kg，搭建成本約為600元,外接24 V電源進行工作。PCR儀基座選用傳熱性能良好、密度小、價格較低的鋁合金進行制造，尺寸為40 mm×40 mm×14 mm；于基座側壁中開相應孔位，安裝PT1000熱電阻；反應槽根據0.2 mL標準PCR反應試管尺寸進行設計，采用4×4陣列均勻分布于基座上表面，且反應槽之間對稱分布著盡可能大的菱形孔，以減小其體積及質量、獲得更小的熱容，最終使溫度單元的快速性得到提升。本系統選用由廣東偲瑞電子科技有限公司所研發的THC1-19912半導體作為執行元件。其最大工作功率為130 W，額定最高溫度為200 ℃，尺寸為40 mm×40 mm×3.5 mm(與基座尺寸一致)，可避免因使用多片半導體制冷片所帶來的匹配誤差。半導體制冷片的制冷效率取決于其冷熱端溫度差，而高性能的散熱裝置[10]將對制冷速率的提升發揮關鍵作用。本文根據制冷片尺寸設計一鰭片式熱管散熱器，通過將制冷片熱量經均熱板由六根鋁制熱管快速傳遞至高密度鋁制散熱鰭片中，由下方轉速約為1 600 r/min的風扇強制對流實現快速散熱。溫度單元之間各相應傳熱單元間均需涂抹導熱硅脂，以確保傳熱效率。

本文所設計的基座熱包覆部分結構如圖2(b)所示。熱蓋是防止試管內試劑反應過程中蒸發后遇冷再液化，對其溫度控制精度要求不高。因此，本文通過在鋁制熱蓋表面開凹槽放置空燒表面溫度穩定在約105 ℃陶瓷加熱片可滿足樣機反應需求。為提升所設計的小型化PCR溫度單元內部環境穩定性，使儀器可面向更多工作場景，應杜絕溫度單元與外部對流換熱[11]。本文通過在基座側壁包覆硅酸鋁棉作為保溫材料，并令熱蓋覆蓋于保溫材料四周，構建穩定熱場。但如基座熱包覆結構厚度選取不適，反而會導致溫度單元動態性能變差。因此，需要對其進行優化。

1.2 基座熱包覆優化

為得到最優基座熱包覆厚度，傳熱計算分析難以得到精確的結果，而采用試驗逐一測量將產生過大的時間成本與資源浪費。為此，本文采用有限元仿真結合遺傳算法，對基座熱包覆厚度進行參數尋優，并使用有限元軟件Comsol Multiphysics對本系統所設計的溫度單元建立相應的有限元模型。PCR溫度單元與包覆保溫材料屬性如表1所示。

表1 PCR溫度單元與包覆保溫材料屬性

通過小型化PCR溫度單元性能指標 (快速性：升/降溫速率vup、vdown；準確性，即穩態誤差△Tw；均勻性，即基座上表面中心溫度減去基座上表面邊緣溫度差△Tb)制定相應適應度函數ξ，如式(1)所示。各系數對應權重根據系統預制定指標比例進行修正。

0.2vdown+ΔTw+ΔTb

(1)

通過使用有限元軟件COMSOL Multiphysics中的MATLAB接口構建溫度單元有限元模型，并使用內置遺傳算法工具箱[12]完成對基座熱包覆結構厚度的優化。遺傳算法優化流程如圖3所示。

圖3 遺傳算法優化流程圖Fig.3 Genetic algorithm optimization flowchart

設置種群大小為20、最大迭代次數為100，并將預制定指標vup≥2.5、vdown≤2、ΔTw≤0.4、ΔTb≤0.4作為約束條件，以1 mm步長在0～100 mm間進行仿真求解運算。最終得到的最優熱包覆厚度為19 mm，其適應度函數值為1.207 97。

1.3 分段PID溫度控制策略與實現

PCR反應的實質是根據預設循環過程使樣品DNA在變性(94 ℃)、退火(55 ℃)、延伸(72 ℃)三溫區進行循環控制。溫度控制的精確性和穩定性不足會導致擴增效率降低、非特異性擴增等問題，從而影響試驗結果。而升溫和降溫速率若過慢，會導致整個PCR過程的反應時間大大延長。這在現場快速檢測等應用場合是不能被接受的。本文通過控制H橋驅動器PWM輸入與占空比D，實現對PCR溫度單元溫度循環的控制，完成對半導體制冷片電流方向及工作功率控制的過程。因此，本文根據所設計的PCR溫度單元特性，對工程實際中廣泛應用的PID控制方法進行改進。本文設計的小型化PCR分段PID控制原理如圖4所示。

圖4 小型化PCR分段PID控制原理圖Fig.4 Schematic diagram of miniaturized PCR segmented PID control

本文基于半導體制冷片工作原理，設置分段控制功能開關。其工作原理是：當循環過程中輸入溫度與PT1000測得溫度誤差ΔT在2 ℃內時切換到升/降溫PID控制器，其余時間令H橋驅動器PWM輸入占空比D為0.9，即此時半導體制冷片以90%最大工作功率進行工作，從而獲得更快的升/降溫速率。由于半導體制冷片升/降溫最大工作功率存在差別，因此需要對升/降溫過程進行控制器切換。此時采用的PID控制規律如式(2)所示。

(2)

式中：Kp、Ki、Kd分別為比例、積分、微分參數；Tblock為PT1000測得基座實時溫度；Tset為設定溫度。

2 試驗與樣機性能測試

基于上述設計工作，完成小型化16孔PCR系統的樣機搭建，并設計相應的GUI界面。樣機通過USB連接到計算機，可外接24 V電源進行工作。用戶可通過GUI完成對PCR循環及控制參數的設定，并可對運行過程中實時數據進行導出分析。通過設計結合有限元仿真溫度場與紅外熱成像儀測試樣機實時熱場對比、試管內50 μL試劑實時溫度測試、小鼠基因組鑒定等試驗，分別對樣機優化后溫度單元性能指標、樣機性能進行驗證。

2.1 優化模型準確性驗證

對基座熱包覆優化前后的有限元模型進行仿真。基座變性(94 ℃)仿真穩態熱場如圖5所示。優化前，基座表面最高溫為93.733 ℃、最低溫為92.845 ℃。通過對基座熱包覆進行優化設計，最高溫為94.022 ℃、最低溫為93.835 ℃。該結果表明，優化設計后樣機溫度單元均勻性及穩定性均得到大幅提升。

圖5 基座變性(94 ℃)仿真穩態熱場圖Fig.5 Steady-state thermal field diagram of basedenaturation (94 ℃) simulation

使用Flir E6-xt紅外熱成像儀，對樣機在相同參數下優化前后的情況進行采集。基座變性(94 ℃)樣機穩態熱場如圖6所示。

圖6 基座變性(94 ℃)樣機穩態熱場圖Fig.6 Steady-state thermal field diagram of base denatured(94 ℃) prototype

基于所測得優化前后各孔溫度與設定值94 ℃的方差進行計算，結果分別為1.379 3與 0.006 2，孔內溫度與設定值偏離程度得到大幅降低，且基座穩態熱場圖與圖5有限元仿真結果基本一致。該結果表明，本文所構建的溫度單元有限元模型及優化方法是正確且能夠有效提升溫度單元性能指標的。

2.2 試劑溫度性能指標驗證

本文通過用移液槍加入50 μL水代替試劑，在0.2 mL標準試管蓋處開孔插入PT1000熱電阻測量試管內液體溫度。循環過程中，94 ℃、55 ℃和72 ℃這3個溫區的維持時間分別設置為30 s、30 s和60 s。循環試管內液體溫度曲線如圖7所示。

圖7 循環試管內液體溫度曲線Fig.7 Circulating liquid temperature curves in test tube

該結果表明，樣機試管內液體穩態誤差可保持在±0.2 ℃，與有限元分析及紅外熱場結果相對應。升/降溫速率分別可達到2.7 ℃/s及2.2 ℃/s，僅需170 s即可完成一次循環，符合預制定指標且能大幅縮短PCR反應所需時間。

2.3 致病疫霉菌DNA擴增試驗

為驗證樣機性能，本文在該樣機分別放置15個裝有20 μL小鼠DNA樣本進行基因組鑒定，并在反應完成后進行凝膠電泳。樣機凝膠電泳結果如圖8所示。該結果表明，15份DNA樣品在瓊脂糖凝膠上均有顯示亮帶，證明所開發樣機可成功實現對DNA樣品的擴增與鑒定，為該樣機的后續實時化以及商業化開發奠定堅實的基礎。

圖8 樣機凝膠電泳結果示意圖Fig.8 Sample gel electrophoresis results

3 結論

本文針對所設計的小型化PCR儀溫度單元進行熱包覆結構優化，采用基于H橋驅動器的分段PID控制方法，搭建了GUI以及16孔PCR儀樣機。樣機溫度單元成本約600元，可外接24 V電源進行工作。該樣機在50 μL反應體系下升/降溫速率可分別達到2.7 ℃/s及2.2 ℃/s，穩態誤差小于±0.2 ℃，基座表面溫度均勻性小于0.1 ℃，并可成功對小鼠基因組DNA樣品完成鑒定。該結果表明，本文所研發的小型化PCR儀樣機具有低成本、便攜帶、易操作、高性能的特點，能夠為后續實時化和商業化的開發奠定基礎，并對現場快速檢測與推進基礎醫療點建設提前部署作好應急準備。