表阿霉素納米粒聯合生育三烯酚的抗肝癌作用及心臟毒性研究

王躍武 張 琦

寧波市醫療中心李惠利醫院藥劑科 (浙江 寧波， 351000)

肝細胞癌(HCC)是最常見的原發性肝癌，也是第三大常見的癌癥死亡原因，5年生存率低，對現有藥物療法反應不良且耐藥性強[1]。鹽酸表阿霉素(EPI)是一種蒽環類抗腫瘤抗生素，是治療肝癌的主要藥物之一，但心肌病和充血性心力衰竭等嚴重副作用限制了其作為肝癌患者的長期用藥[2]。因此，開發針對HCC副作用小且有效的治療策略至關重要。納米載體因其能夠選擇性靶向癌細胞對健康細胞影響較小而受到廣泛關注[3]，在可生物降解的納米載體中，殼聚糖修飾的PLGA納米粒子(NP)被證明具有增強細胞吸收藥物的潛力[4,5]。當前研究主要集中在納米載體介導的藥物的傳遞[3]，而關注有效且安全的應對HCC的EPI治療藥物較少。生育三烯酚(Ts)對神經退行性疾病、動脈粥樣硬化和癌癥是一種有效的抗氧化劑[6]，有報道顯示Ts對癌細胞分泌的血管生成因子具有抑制作用，并具有抗細胞增殖活性[7]，其通過苯甲酚環上清除過氧自由基的能力可防治蒽環類藥物誘導的心臟毒性。因此，本研究將EPI封裝在可生物降解的殼聚糖PLGA納米顆粒中，探討EPI-NPs單獨或與Ts組合后的抗腫瘤活性和心臟毒性，以期建立一種更有效、更安全的HCC化學治療策略。

1 材料和方法

1.1 材料 EPI從武漢德美凱生物科技有限公司獲得，Ts由四川省維克奇生物科技有限公司提供。二乙基亞硝胺(DEN)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)購自Sigma Aldrich公司。聚乳酸-羥基乙酸共聚物70∶30(PLGA)購自上海雅吉生物科技有限公司。殼聚糖氯化物(Protasan CL 113)購自挪威NovaMatrix公司。聚乙烯醇(Mowiol 4-88)購自北京海德創業生物科技有限公司。乙酸乙酯和二氯甲烷購自溫州吉康化工有限公司。三乙胺購自溫州市太行聚氨酯有限公司。杜氏改良版Eagle培養基(DMEM)和胎牛血清(FBS)購自上海連橋生物科技有限公司。

1.2 細胞系 人肝癌細胞HepG2細胞系購自美國LGC Promochem公司。采用含10%熱滅活FBS的DMEM，37℃、95%相對濕度和5% CO2環境培養細胞。

1.3 動物 SPF級雄性BALB/c小鼠(6～8 周齡，體重20～25 g)購自常州卡文斯實驗動物有限公司，在光照、相對濕度和溫度可控的條件下飼養，允許隨意獲取食物和水。

1.4 EPI納米粒子的制備和表征 用三乙醇胺和二氯甲烷將鹽酸EPI沉淀到基底后，參考文獻[8]通過乳液擴散法制備EPI-NPs。EPI基底(0.33 mg/ml)與PLGA在乙酸乙酯溶液中混合，在攪拌的同時將有機相滴加到等體積的PVA和殼聚糖氯化物的水溶液中，然后將預乳液在13 500 rpm下均化10 min，在攪拌下逐步添加去離子水至50 ml，同時去除有機溶劑，所得的膠態分散體包含0.2% w/v PLGA、0.2% w/v PVA和0.03% w/v殼聚糖。用離心超濾法純化產生的EPI負載的脫乙酰殼多糖PLGA納米顆粒，使用3 250 g的Centrisart I(MWCO 300 KDa)，3℃超濾離心20 min除去過量的藥物和聚合物，在4℃下保存。使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments，Malvern，UK)測定負載EPI的NP性質(平均粒徑、多分散系數和Zeta電位)。

通過分別測定NP和上清液中被包封的和游離的EPI的濃度來確定包封效率(EE)。將EPI-NP在3 250 g的Centrisart I(MWCO 10 KDa)中離心20 min，然后通過HPLC測定上清液中的游離EPI。此外，純化的NP被溶解在乙腈中，然后采用C18反相柱(美國安捷倫科技公司)進行HPLC分析，對封裝的EPI進行定量。流動相為乙腈-0.02 M磷酸二氫鈉-三乙胺(體積比34∶66∶0.3，pH 4)，流速為1 ml/min。紫外分光光度計檢測240 nm波長的峰值。實驗進行3次。記錄平均值和標準差。

1.5 體外釋放EPI EPI-NPs置于透析袋(MWCO 10 kDa)，浸于磷酸緩沖液(5 ml，pH 7.4)中，100 rpm，37℃下搖勻，在預定的時間點通過HPLC測定釋放的EPI的濃度。

1.6 體外細胞存活率測定 通過MTT法測定游離EPI，EPI-NP以及EPI-NP結合Ts(10 μmol/L)在不同EPI濃度(0.25～2 μg/ml)下對HepG2細胞的細胞毒性。HepG2細胞(106個細胞/ml)接種于96孔板(0.2 ml/孔)中，并在37℃、5% CO2、95%相對濕度條件下孵育48 h。各組HepG2細胞分別加入不同藥物孵育3 h，并研究不同Ts濃度(10、20、30 μmol/L)對藥物作用的影響，以含空白NP、2% Triton X-100的DMEM孵育的HepG2細胞作為對照組。各組HepG2細胞用PBS洗滌兩次，加入0.5% MTT溶液再孵育3 h后，按0.5 ml/孔加入酸化的異丙醇溶解甲瓚晶體，并測量540 nm吸光度。細胞存活率用平均值和標準差表示。根據劑量反應曲線確定半數最大抑制濃度(IC50)值。實驗設置4復孔。

1.7 在小鼠體內的研究

1.7.1 HCC誘導 每周腹膜內注射75 mg/kg DEN持續3周，然后注射100 mg/kg DEN持續3周誘導HCC。在最后一次注射DEN后2周，通過肝組織切片的病理組織學檢查證實誘導腫瘤成功。將小鼠隨機分為8組(每組8只小鼠)，4組為藥物治療組，即游離EPI組(1.25 mg/kg EPI-PBS溶液)、EPI-NPs組(1.25 mg/kg EPI-NPs溶液)、EPI-NPs/低劑量Ts組(14.6 mg/kg EPI-NPs/Ts橄欖油溶液)、EPI-NPs/高劑量Ts組(62.5 mg/kg EPI-NPs/Ts橄欖油溶液)，其中EPI/PBS溶液和EPI-NPs溶液分別在第4 d和第6 d進行腹腔內注射，而Ts是通過灌胃橄欖油溶液給藥；4組為對照組，包括正常對照組、HCC對照組、空白NPs對照組和橄欖油對照組。實驗期結束時，處死動物。

1.7.2 抗腫瘤活性評估 將切除的小鼠肝臟切成切片用于組織病理學，免疫組織化學檢查以及血管內皮生長因子(VEGF)測定。將小鼠肝臟的組織標本固定在10%的中性福爾馬林緩沖液中，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明化，石蠟包埋，制備4～5 μm石蠟切片進行常規HE染色進行組織病理學分析。

1.7.3 心臟毒性評估 采集實驗小鼠心臟組織，制備組織勻漿用于心臟毒性評估。

1.7.3.1 谷胱甘肽(GSH)的測定：將200 ml三氯乙酸(TCA)心臟組織勻漿加到4.7 ml 0.1 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 8)中，然后加入100 ml 0.01 mmol/L 5,50-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)并立即渦旋，25 min后分光光度法檢測412 nm處吸光度。

1.7.3.2 硫代巴比妥酸反應性物質(TBARS)的測定 將0.1 ml心臟組織勻漿與等體積的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液混合，然后添加0.75 ml乙酸、0.75 ml硫代巴比妥酸(TBA)和1 ml蒸餾水，渦旋混合后沸水溫浴1 h，冷卻后在正丁醇中萃取。在535 nm下檢測分離的有機層的吸光度，以確定MDA的濃度(nmol/ml)。

1.7.3.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定 通過鄰苯三酚法檢測SOD活性，即SOD活性抑制超氧陰離子自由基的產生、抑制鄰苯三酚自氧化，導致420 nm處吸光度的增加。1個單位的SOD活性定義為可將鄰苯三酚的自氧化率抑制50%的酶量。

1.7.3.4 硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度的測定 通過Griess方法測定硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度。首先亞硝酸鹽在酸性介質中用重氮化試劑(磺酰胺)處理以形成瞬態重氮鹽，然后使該中間體與偶聯劑N-(1-萘基)乙二胺反應，形成穩定的偶氮化合物，分光光度法測定540 nm吸光度。

1.7.3.5 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的測定 根據酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，使用ELISA試劑盒(eBioscience)并根據制造商說明測量上清液中的TNF-α。

1.8 統計學方法 使用Kolmogorov-Smirnov檢驗對定量變量的分布進行了正態檢驗。對于正態分布的數據，單向方差分析和事后檢驗(Scheffe's)進行多重比較。對于非正態分布的數據，使用KruskalWallis檢驗比較，使用Mann-Whitney檢驗對兩組間比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPI-NPs的特性 EPI在殼聚糖包被的PLGA NP中粒徑從135 nm增大至283 nm，并且PDI由0.14增加到0.23，Zeta電位顯著降低。NPs性質見表1。NPs的EPI體外釋放可分為兩個階段：在初始階段，EPI在最初的6 h釋放率低(<15%)，隨后為持續釋放期，見圖1。

表1 納米粒結構特點

圖1 NPs的EPI體外釋放

2.2 體外培養細胞存活率測定 游離EPI的細胞存活率>90%，EPI-NP導致細胞存活率顯著下降(P<0.05)，IC50為0.9 μg/ml；而EPI-NPs中添加Ts后(10 μmol / L)細胞存活率上升，IC50約為2 μg / ml，見圖2A。使用EPI-NP(0.25 μg / ml)的Ts(10、20、30 μmol / L)研究了Ts濃度對細胞活力的影響，觀察到細胞存活率呈濃度依賴性地從93.9%降低至60.4%，見圖2B。

2.3 EPI在HCC小鼠體內的抗腫瘤活性 EPI組小鼠肝組織出現點狀壞死，而EPI-NPs治療組出現輕度細胞凋亡和大面積壞死；在EPI-NPs/Ts聯合治療中，含濃縮染色質的凋亡肝細胞變得更加明顯，尤其是在較高的Ts劑量下。相比之下，正常對照組、HCC組、空白NPs組和橄欖油組未檢測到凋亡細胞。各組實驗小鼠肝組織病理情況見圖3。游離EPI治療顯著降低實驗小鼠肝組織VEGF水平(P<0.001)，EPI-NPs治療組小鼠肝組織VEGF水平進一步降低(P<0.001)，使用Ts輔助治療時小鼠肝組織VEGF水平顯著協同下降(P<0.001)。各組實驗小鼠肝組織VEGF水平見圖4。

圖2 體外細胞活力測定(A.與游離EPI、EPI-NPs以及EPI-NPs/Ts孵育后HepG2的細胞活力，B.不同濃度Ts對細胞活力的影響)

圖3 各組實驗小鼠肝組織病理圖(HE染色，400×；A.正常對照組；B.HCC組；C.空白NPs組；D.橄欖油組；E.EPI組；F.EPI-NPs組；G.EPI-NPs/低劑量Ts組；H.EPI-NPs/高劑量Ts組)

圖4 各組實驗小鼠肝組織VEGF水平

2.4 HCC小鼠的心臟毒性 心臟/體重比值(HW/BW)降低是出現心臟毒性的常見標志，游離EPI治療組小鼠HW/BW比值最低，在62.5 mg/kg EPI-NPs/Ts組小鼠HW/BW比值幾乎恢復到對照組水平，見圖5。與對照組比較，游離EPI治療后實驗小鼠心臟組織MDA水平增加；與游離EPI治療組比較，EPI-NPs治療組MDA水平顯著降低(P<0.001)，而結合Ts共同給藥使其進一步降低；見圖6A。游離EPI處理后實驗小鼠心臟組織GSH水平最低，EPI-NPs治療后GSH水平與HCC組水平一致，且GSH水平隨Ts劑量增加顯著增加(P<0.001)，見圖6B。與HCC組相比，EPI顯著降低了實驗小鼠SOD活性；與游離EPI治療組相比，EPI-NPs治療顯著升高SOD活性(P<0.001)，且SOD活性也隨Ts劑量增加而顯著增加，高劑量Ts使SOD活性恢復到HCC組水平，見圖6C。游離EPI治療后實驗小鼠體內測出了高濃度的硝酸鹽/亞硝酸鹽，而EPI-NPs組水平顯著降低(P<0.001)，Ts結合EPI-NPs可使濃度恢復到HCC組的水平，圖6D。與游離EPI組比較，EPI-NPs的使用以及與Ts的進一步組合均可降低TNF-α水平，見圖6E。

圖6 各組實驗小鼠心臟毒性指標比較(A.MDA；B.谷胱甘肽；C.SOD活性；D.硝酸鹽或亞硝酸鹽；E.TNF-α)

圖5 各組實驗小鼠HW/BW比值

3 討論

蒽環類藥物治療HCC等耐藥性癌癥所呈的劑量依賴性會增加心力衰竭風險，從而限制其臨床應用。本研究使用強效抗氧化劑(生育三烯酚)作為輔助治療降低蒽環類藥物產生的心臟毒性，并選擇殼聚糖修飾的PLGA納米粒子作為載體。據報道，殼聚糖-PLGA NPs給藥可延長其在血液中的循環，從而顯示出比游離藥物更好的體內治療效果[9]。殼聚糖-PLGA NPs表現出高包封率，并能使EPI在3 d內受控釋放，從而使腫瘤持久地暴露于藥物中。EPI由于具有疏水性蒽環和親水糖基團，因此是兩親性弱堿(pHa=7.7)。先前研究發現EPI的釋放與pH有關，在pH>7.4時慢，在酸性pH中更快，這提示其較高的細胞內釋放率[10]。該研究還表明，在聚氰基丙烯酸丁酯納米粒(PBCA-NPs)中包封的EPI，在最初的3 h內最大包封效率為50%，藥物的50%迅速釋放，其余藥物在整個過程中均與顆粒緊密結合[10]。

EPI在靶向肝細胞的NP中的封裝增強了其對HepG2細胞的抗增殖作用，這很可能是由于細胞攝取藥物能力的增強和EPI在肝細胞中的大量積累所致。相對于游離EPI(細胞存活率>90%)，EPI-NP與Ts共同給藥后，細胞存活率顯著降低。本研究還觀察了Ts作為靶向肝細胞的NPs的輔助抗癌治療手段的效果。在EPI-NP中添加10 μmol/L Ts導致IC50略有增加。盡管Ts具有強大的抗血管生成活性，但其為強抗氧化劑，可中和自由基并破壞脂質過氧化的鏈反應，從而保護細胞膜[7]。之前有報道稱，Ts對包含EPI在內的化學治療劑治療的腫瘤細胞具有增敏作用，并證實Ts的安全性和耐受性[11]。 Postescu等[12]發表了類似的結果，表明Ts降低了阿霉素的細胞毒性。用靶向的EPI-NP孵育HepG2細胞并提高Ts的濃度會導致細胞毒性潛能的濃度依賴性增加，從而揭示Ts的協同抗增殖作用。我們對HCC小鼠的體內測定結果與對HepG2細胞的體外測定結果是一致的。肝臟的組織病理學檢查顯示，在游離EPI處理的小鼠中，HCC分化良好，有斑點壞死，在EPI-NPs處理組中壞死更為顯著。據報道，在乳腺癌大鼠模型中，負載EPI的丙二醇脂質體的觀察結果相似[13]。此外，通過增加Ts濃度，小體的凋亡更為頻繁。Ts顯著增強了EPI-NPs治療組的細胞凋亡，但抑制了壞死。

血管生成對于腫瘤生長和轉移的傳播是必不可少的，VEGF是血液中內皮細胞的生存因子，其升高提示腫瘤血管生成的促進[7]。未經治療的HCC小鼠的肝VEGF水平高于正常水平。與其他蒽環類藥物一樣，EPI治療后VEGF表達下調。EPI-NPs給藥下，VEGF水平進一步降低，提示EPI-NP對腫瘤血管形成具有強效抑制作用，并通過長時間釋放藥物使血管平滑肌細胞增殖被完全抑制。Ts與EPI-NPs并用導致肝VEGF水平嚴重下降，這與先前研究Ts在體外及體內對VEGF作用的報道相吻合[11,14]。Ts通過下調VEGF和VEGF受體的表達來抑制VEGF依賴性腫瘤血管生成。VEGF信號傳導途徑的配體和受體的同時減少可能解釋了Ts對炎癥或與腫瘤相關的血管生成的嚴重抑制。

在蒽環類化療中，心臟毒性依舊是一個值得重視的問題。盡管其機制尚未明確，但可能與EPI產生自由基所引起的氧化應激有關，該反應導致了內皮細胞凋亡。在本研究中，氧化應激反應通過EPI治療后GSH的降低和TBARS的升高體現。在肝細胞靶向的NP中封裝EPI會限制藥物進入其他組織(如心臟)。因此，EPI-NP的使用可保護心臟組織免于脂質過氧化，并降低了EPI對SOD活性的抑制作用。根據先前報道，Ts輔助治療可抑制TBARS水平并改善GSH水平[15]。除本身具有抗氧化性能外，Ts通常還可以通過與抗過氧化物酶(包括SOD)相互作用而影響氧化應激。

在mRNA和蛋白質水平上，重復給予蒽環類藥物均會通過增加誘導型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表達而不影響組成型一氧化氮合酶(cNOS)的表達來誘導心肌內一氧化氮的產生。本研究中NP的靶向特性以及Ts的抗氧化潛力降低了硝酸鹽/亞硝酸鹽水平，從而降低了EPI引起的心臟毒性。TNF-α與心臟肥大和功能障礙有關，我們的體內研究表明，用EPI治療后，HCC小鼠心臟中的TNF-α水平升高，而用EPI-NPs與Ts聯合治療的小鼠的TNF-α水平則明顯降低了。如先前報道，Ts通過抑制脂多糖誘導下產生的一氧化氮、前列腺素E(2)和炎癥前細胞因子(TNF-α、IFN-c、IL-1b和IL-6)表現出強大的抗炎活性[16]。因此，Ts的抗氧化和抗炎機制有助于抵抗EPI誘導的心臟毒性，起到心臟保護作用。

總之，這項研究為肝癌化療的兩個重要方面提供了明確的證據：首先，在肝癌化療中，使用基于靶向納米技術的治療方案比游離藥物治療更有效，通過降低癌細胞耐藥性和提高藥物效率，在小鼠模型中對抑制HCC中起了重要作用。第二，納米顆粒/生育三烯酚的聯合療法減輕了藥物心臟毒性的副作用。該治療方案在抗腫瘤活性和安全性的雙重改善可能可以為HCC的臨床治療帶來更多希望。