基于重組酶介導擴增-側流層析試紙條的褐飛虱快速鑒定方法

羅舉 唐健 王愛英 楊保軍 劉淑華

基于重組酶介導擴增-側流層析試紙條的褐飛虱快速鑒定方法

羅舉 唐健 王愛英 楊保軍 劉淑華*

(中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；*通信聯系人，E-mail: liushuhua@caas.cn)

【】針對測報燈下褐飛虱鑒定費時費力這一問題，建立褐飛虱快速定性鑒定技術。以褐飛虱、偽褐飛虱及擬褐飛虱為材料，篩選褐飛虱特異性引物對，優化基于重組酶介導擴增和側流層析試紙條檢測方法的快速鑒定體系(RAA-LFD)，并分析其溫度及模板魯棒性。本研究建立的RAA-LFD方法操作簡單、速度快、不依賴于任何精密儀器、體溫可觸發擴增反應，且對粗組織液模板具有很好的魯棒性。盲樣檢測結果表明，56個樣本從樣本獲取到結果輸出的整個過程可在45 min內完成，準確率可達100%。本研究建立的褐飛虱RAA-LFD鑒定技術可以用于褐飛虱及其近似種的快速區分，適用于基層植保站或田間地頭對樣本的現場即時檢測。

褐飛虱；偽褐飛虱；擬褐飛虱；RAA-LFD；現場即時檢測

褐飛虱[(St?l)]是亞洲稻區危害最嚴重的水稻害蟲之一，不僅可以刺吸汁液為害，還可以傳播病毒病[1-4]。準確的蟲情預測預報是害蟲防治的關鍵，褐飛虱測報主要依賴于人工下田調查和地面燈誘捕監測。人工下田調查存在勞動強度大、效率低、時效性差、主觀性強等缺點。隨著基層植保工作人員的流失，地面燈誘監測受到了植保站及種糧大戶的青睞。測報燈下褐飛虱的始見日、遷入量、遷入峰是預測預報的關鍵依據，也是褐飛虱防治策略制定的關鍵信息依據。目前市場上的智慧型測報燈，可實現自動收集、烘干、傳輸、識別與計數，大大提高了測報的準確度和時效性，節省了人力物力。然而，所有的基于RGB圖像識別原理的智慧型測報燈對昆蟲同屬近似種的分類鑒定無能為力，后期仍需大量人力介入。

偽褐飛虱[China]和擬褐飛虱[(Muir)]是褐飛虱的同屬近似種，屬于半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)褐飛虱屬(Distant)。偽褐飛虱和擬褐飛虱并不取食水稻，而是以禾本科的游草()和秕谷草()為最適宜寄主[5]。在人為干預下，兩者雖可在水稻上完成世代發育，但種群趨勢指數分別為0.2和0.02，不能持續繁衍[5]。然而，偽褐飛虱、擬褐飛虱與褐飛虱具有廣泛的共同分布區域，發生季節也有交叉(4月－10月)，且都具有撲燈習性，對預測預報的準確性造成了嚴重影響[6, 7]。褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱形態、體色和外部特征均非常相似，肉眼難以區分，需專業人員借助于顯微鏡才能鑒別[8]。顯微鏡下的分類特征主要有3個方面，分別為顏面、雌性外生殖器和雄性外生殖器[9]。人工進行褐飛虱屬近似種鑒定耗時費力，對人員專業技能要求高，且不能鑒別殘缺的飛虱個體。因此，亟需研發快速、簡便、準確的分類鑒定方法。

基于聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術的核酸檢測為物種的鑒定提供了新的手段，彌補了傳統形態學鑒定的諸多不足，可以檢測物種間及同種個體間的細微差別。崔亞麗[10]曾利用核糖體間隔區基因(Ribosomal intergenic spacer, ITS)設計引物，初步建立了褐飛虱、擬褐飛虱和偽褐飛虱的多重PCR檢測技術(需PCR儀+電泳儀)，由于是以純基因組DNA為模板，具有耗時長、耗費大等缺點。Liu等[11]在此基礎上，重新設計引物對，以加水研磨的粗組織液為模板建立了三種飛虱的直接多重PCR檢測方法，該方法不需要提取DNA，將檢測時間大大縮短。這兩種方法雖然都能準確鑒定褐飛虱，但都依賴于昂貴的儀器設備(PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀)，不易推廣應用。重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是Piepenburg等[12]于2006年提出的一種新型的恒溫核酸擴增技術，無需昂貴精密的儀器，在37℃～42℃恒溫下即可完成指數級擴增，與側流層析試紙條(lateral flow dipstick, LFD)結合應用能實現裸眼可視化檢測，非常適用于臨床以及室外的檢測與分析。重組酶介導的擴增(Recomninase Aided Amplification, RAA)技術與RPA擴增原理相似，是國內公司開發的一種技術，兩者的區別在于重組酶的來源不同，RPA重組酶來源于T4噬菌體，RAA重組酶來源于細菌或真菌[13]。近幾年，RAA技術也逐漸被大眾所認知和應用[14-16]。

本研究通過篩選常見的條形碼基因，建立了以線粒體細胞色素b基因(Mitochondrial cytochrome b,)為檢測靶標的褐飛虱RAA+LFD快速鑒定方法，評價了其特異性與靈敏度，分析了其溫度適用范圍與模板質量魯棒性，并對隨機盲樣進行了檢測體系效果評估。該方法簡單、快速、靈敏，將很大程度上減輕植保工作人員工作量，提高褐飛虱預測預報工作的準確度及時效性，為精準綠色防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本準備

本實驗室收集保存的2017－2018年度廣西昭平、湖南邵東、江西萬安和浙江富陽的褐飛虱、擬褐飛虱和偽褐飛虱干蟲樣本。粗組織液制備方法：取單頭待測飛虱放入1.5 mL離心管中，加入200 μL ddH2O，手動研磨或自動研磨機研磨，自動研磨機的參數為8 HZ×60 s。

1.2 儀器設備與試劑

研磨機(LC-TG-48，上海力辰邦西儀器科技有限公司)；恒溫金屬浴；凝膠電泳儀(DYCP-31DN，中國六一公司)；凝膠成像系統(V140130，美國Bio-Rad公司)；酶試劑盒(KME-101，日本TOYOBO公司)；電泳法RAA擴增試劑盒(RAA-basic)(B00000，江蘇奇天基因公司)；試紙條法RAA擴增試劑盒(RAA-nfo)(T00001，江蘇奇天基因公司)；試紙條法RPA擴增試劑盒(RPA-nfo) (TANFO02kit，英國TwistDx公司)；LFD試紙條(MGHD 1，德國Milenia Biotec公司)。

1.3 引物探針設計與篩選

根據NCBI中登錄的褐飛虱(JX880069.1)、偽褐飛虱(NC_024627.1)和擬褐飛虱(NC_033388.1)的線粒體基因組序列，參照文獻尋找并提取COI及Cytb基因序列[17]，使用Vector NTI 11.5.1軟件進行序列比對，在種間變異區及種內保守區設計RPA/RAA引物及探針。參考Liu等[11]報道的ITS序列以同樣的方法設計引物和探針。因為RPA技術還沒有成熟的引物設計輔助軟件，本研究中引物和探針主要是參照英國TwistDx公司網站(http://www.twistdx. co.uk)的注意事項進行人工設計。本研究所用的引物及探針序列見表1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RPA引物設計原則為：引物長度30～35 bp；避免5＇端長的G序列，否則會影響重組酶與引物結合；推薦3＇端用G、C序列；自由能應＜4 kcal /mol。以褐飛虱基因組DNA(10 ng /μL)為模板，參照電泳法RAA試劑盒(RAA-basic)說明書的體系及方法進行檢測。具體如下：ddH2O 17.5 μL、正向引物(10 μmol/L)2.0 μL、反向引物(10 μmol/L)2.0 μL、不含引物的水化緩沖液(Primer Free Rehydration buffer )25.0 μL、DNA 1 μL，最后加入乙酸鎂2.5 μL觸發擴增反應。反應條件：37℃下恒溫擴增30 min。反應結束后，加入等體積的苯酚/氯仿混合液(1∶1)，劇烈渦旋混勻后12000 r/min下離心3 min，取上清液進行電泳檢測。

表2 樣本收集地點

篩選出引物對后，設計RAA探針，設計原則為：長46～52 bp；在距5＇端最短30 bp，距3＇端最短15 bp處堿基由四氫呋喃(THF)替代；5＇端標記FAM熒光基團。另外，需重新合成有生物素標記的下游引物，以用于后續基于三明治法原理的側向流試紙條檢測[18]。以褐飛虱基因組DNA(10 ng /μL)為模板，參照RAA-nfo試劑盒說明書的體系及方法進行檢測。具體如下：ddH2O 16.7 μL、正向引物(10 μmol/L)2.1 μL、反向引物(10 μmol/L)2.1 μL、探針(10 μmol/L)0.6μL、不含引物的水化緩沖液(Primer Free Rehydration buffer )25.0 μL、DNA 1 μL，最后加入乙酸鎂2.5 μL觸發擴增反應。反應條件：39℃恒溫擴增20 min。反應結束后，取2.5 μL反應液與97.5 μL試紙條擴展緩沖液(Milenia GenLine Dipstick Aassay Buffer)混合，再將試紙條垂直放置于此混合液中，室溫放置2 min后觀察結果。剩余的反應液亦可參照上述方法進行電泳檢測。RPA-nfo試劑盒加樣體系及反應條件與RAA-nfo試劑盒大致相同。

1.4 特異性檢測

分別以褐飛虱、偽褐飛虱、擬褐飛虱的基因組DNA(10 ng /μL)為模板，參照1.3的體系及方法進行RAA擴增，并用電泳法和試紙條法檢測以評價反應體系的特異性。

1.5 靈敏度測定

將褐飛虱基因組DNA 10×梯度稀釋為100 fg/μL、1 pg/μL、10 pg/μL、100 pg/μL、1 ng/μL，在39℃×20 min擴增條件下評價所建立RAA-LFD反應體系的靈敏度。

1.6 檢測條件適用范圍分析

分別以33℃、35℃、37℃、39℃和41℃為反應條件，以褐飛虱基因組DNA(50 ng/μL)和粗組織液為模板，評價所建立RAA-LFD方法的適用溫度范圍及模板魯棒性，并分析了體溫觸發擴增的可行性。在39℃下，以褐飛虱粗組織研磨液為模板，分別擴增4 min、8 min、12 min及16 min，在保證檢出率的情況下評價所建立RAA-LFD方法的最短擴增時長。

1.7 盲樣測試評價

使用優化的RAA-LFD方法對取自2017與2018年度不同地區的褐飛虱及其他飛虱共56個樣本(表2)進行測試，并與專家形態學鑒定結果比較，驗證方法的準確度及實用價值。另外，粗略對比評估了RPA-nfo與RAA-nfo試劑的擴增活性。

A－RAA-LFD擴增引物篩選；B－RAA-LFD檢測探針驗證。+代表褐飛虱基因組DNA；-代表ddH2O。

Fig. 1. Primer and probe selection for RAA-LFD method.

Nl－褐飛虱；Nm－偽褐飛虱；Nb－擬褐飛虱。粗字體序列代表P4引物位置，下劃線序列代表探針位置。

Fig. 2. Multiple alignment ofgenes fromand its two sibling species.

2 結果與分析

2.1 引物與探針的確定

根據RAA引物設計原則，針對褐飛虱ITS1、COI及Cytb條形碼基因保守區段共設計了4組引物(表1)，分別為P1～P4。以RAA-basic試劑盒進行引物篩選，結果表明(圖1-A)，4組引物都能擴增出單一特異條帶，但P1/P2/P3的空白對照雜帶較亮，因此選定P4引物對進行后續驗證。參照探針設計原則，人工設計了試紙條法檢測用探針，同時重新合成帶有生物素標記的P4下游引物Cytb-326-R30-Bio(表1)。在39℃×20 min擴增條件下，基于P4引物對的RAA-LFD法可以出現明顯的檢測線(圖1-B)，說明探針設計正確。P4引物對與三種飛虱的基因序列多序列比對結果及引物探針位置如圖2。

Nl－褐飛虱；Nm－偽褐飛虱；Nb－擬褐飛虱；F－雌成蟲；M－雄成蟲。

Nl,; Nm,; Nb,; F, Female adult; M, Male adult.

圖3 基于P4引物對的RAA-LFD方法特異性分析結果

Fig. 3. Specificity analysis of the RAA-LFD method based on P4 primer.

2.2 RAA-LFD法檢測特異性的確定

因為本研究目的是篩選近似種快速鑒定定性引物，所以首先驗證了P4引物對的特異性。以褐飛虱、偽褐飛虱及擬褐飛虱的基因組DNA為模板(10 ng/μL)，RAA-LFD試劑在39℃×20 min擴增條件下，褐飛虱雌、雄蟲都有明顯檢測線與質控線，偽褐飛虱和擬褐飛虱都只有質控線(圖3)。以上結果表明，P4引物對具有物種特異性，可以很好地區分褐飛虱及其近似種。

2.3 RAA-LFD法檢測靈敏度的分析

在39℃×20 min擴增條件下，以10×稀釋的褐飛虱基因組DNA為模板測定P4引物對的靈敏度。結果表明，當模板濃度為10 pg/μL時試紙條上可見明顯的檢測線，且模板濃度越高，檢測帶顏色越深(圖4)，說明所建立的RAA-LFD法最低檢測線為10 pg/μL。因為本研究的目的是篩選快速簡便的定性鑒定引物，所以對其靈敏度要求不高，10 pg/μL的檢測靈敏度足可滿足物種鑒定要求。

2.4 RAA-LFD法檢測條件范圍的確定

本研究目的是建立可用于實驗室外的、簡單快速的定性鑒定技術，因此評估了所建立RAA-LFD方法的適用范圍，包括擴增溫度、模板質量和擴增時長。以基因組DNA(50 ng/μL)為模板，測定了RAA-LFD法在不同溫度下的檢測能力，包括33℃、35℃、37℃、39℃和41℃。溫度范圍篩選結果表明，基于P4引物對建立的RAA -LFD法在33～41℃都具有較好的檢測效果(圖5-A)。不借助任何加熱模塊，本實驗室兩名工作人員通過將PCR管握在手心20 min，亦可高效完成擴增與準確檢測。為了提高檢測效率，以褐飛虱粗組織液(2017年雄成蟲樣本)為模板測定了RAA-LFD法在39℃下擴增4 min、8 min、12 min及16 min后的檢測效果。擴增時長實驗表明，RAA -LFD試劑在擴增4 min時有模糊檢測線，8 min時檢測線即清晰可見(圖5-B)。

圖4 基于P4引物對的RAA-LFD方法靈敏度實驗結果

Fig. 4. Sensitivity analysis of the RAA-LFD method based on P4 primer.

2.5 盲樣測試評價結果

為評估該RAA-LFD檢測體系的實際應用效果，對取自2017、2018年度4個不同省份的共56個飛虱盲樣進行檢測(表2)。結果表明，其中19個樣本檢測為褐飛虱，37個樣本為非褐飛虱，與人工鑒定結果完全一致，檢出率與準確率均達到100%。本研究中，利用高通量組織研磨儀制備樣本粗組織液1～2 min，39℃下恒溫擴增8 min，試紙條檢測2 min，單樣本從樣本獲取到結果輸出的整個過程可在20 min內完成，56個樣本可在45 min內完成。為了篩選更優的試劑，本研究粗略對比了國產RAA-nfo試劑與進口RPA-nfo試劑的擴增活性。結果表明，在相同的擴增溫度與時長下，RAA-nfo試劑擴增活性略低于RPA-nfo試劑。采用RPA-LFD法，單樣本檢測時間可在15 min內完成，56個樣本可在40 min內完成，部分對比結果見圖6。

3 討論

本研究以條形碼基因為遺傳標記，建立了基于恒低溫核酸擴增及可視化檢測的褐飛虱快速鑒定方法，即RAA-LFD法(重組酶聚合酶擴增-側流層析試紙條法)。該方法在33～41℃溫度范圍內對褐飛虱都有很好的檢測效果，且可以脫離加熱模塊由體溫觸發擴增；具有較好的模板魯棒性，可高效擴增樣本粗組織液；檢測迅速，56個樣本可在45 min內完成；大樣本盲樣檢測結果表明，該方法對褐飛虱的檢出率及準確率均為100%；最低檢測限為10 pg/μL。該檢測方法特異性強、靈敏度高、易操作、反應快速，能擺脫對大型專業儀器、專業操作人員及實驗室的依賴，在基層植保站或種糧大戶，尤其在野外及現場檢測中具有應用潛力。

A－擴增溫度分析；B－擴增時長分析。Nl－褐飛虱，Nm－偽褐飛虱，Nb－擬褐飛虱。

Fig. 5. Applicability analysis of the RAA-LFD method based on P4 primer.

Nl－褐飛虱；Nm－偽褐飛虱；Nb－擬褐飛虱。

Fig. 6. Amplification ability analysis between RPA-nfo and RAA-nfo reagents.

近年來，恒溫PCR法在現場即時檢測(Point of Care Testing, POCT)領域得到了廣泛應用，主要包括醫療衛生、食品安全及環境檢測領域[19-24]。目前，恒溫PCR技術也逐漸應用于農業領域，如環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)和RPA/RAA技術。RPA/RAA擴增后一般有3種檢測方法，有瓊脂糖凝膠電泳法、熒光定量法和試紙條法[18]。馮黎霞等[25]建立了基于RPA-電泳檢測技術的玉米褪綠斑駁病毒速測方法；謝實龍等[26]建立了轉基因大豆MON89788品系的實時熒光檢測方法；王燕等[27]建立了基于RPA-LFD技術的櫻桃病毒A(CVA)的速測方法。一般情況下，實時熒光定量與試紙條法檢測靈敏度高于電泳法。本研究目標是建立簡單快速、適用于田間地頭的褐飛虱現場鑒定技術，因此選擇了可裸眼觀察的試紙條法。RPA/RAA結合LFD或熒光實時檢測系統，最低檢測線可達到8～10拷貝/反應[21, 28]或20 fg/μL[29]。近年來，科學家們創新性地引入了CRISPR檢測技術，將基因檢測靈敏度提高到了單分子水平。張鋒實驗室建立了檢測登革熱和寨卡病毒的SHERLOCK系統[30]；Jennifer Doudna實驗室建立了檢測人乳頭瘤病毒的DETECTR系統[31]。SHERLOCK和DETECTR分別利用Cas13和Cas12a對鄰近ssRNA和ssDNA的切割降解來激活報告基團。隨后通過對報告基團產生的信號進行測定，即可確定感興趣的DNA、RNA或突變是否存在[30, 31]。王永明團隊在此基礎上，進一步將RPA擴增與結果檢測環節整合，建立了一步法支原體的可視化檢測Cas12aVDet系統，降低了操作復雜度及交叉污染風險[32]。本研究目標是建立褐飛虱的快速定性檢測方法，即使是殘缺蟲體也含有足夠的模板DNA。本研究所建立方法的最低檢測限為10 pg/μL，雖然低于SHERLOCK、DETECTR及Cas12aVDet系統，但亦能保證檢出率及準確率均達100%。

RPA/RAA引物長度一般要求30～35 bp，但有多項研究表明19～29 bp長度的引物也有較好的擴增效果。趙巧雅等[33]建立了兔源肺炎克雷伯氏菌的RPA檢測方法，其上下游引物分別為21 bp、19 bp，檢測靈敏度為8.3×101CFU/mL，是傳統PCR的100倍；王秋平等[34]應用RPA建立了煙曲霉菌速測方法，其上下游引物分別為25 bp、26 bp。由此可見，某些情況下可用普通PCR引物進行RPA/RAA擴增。本研究所篩選的引物長度分別為29 bp和30 bp，具有較高的擴增活性及特異性，未進行其他長度引物特性的比較分析。相對于LAMP方法需要4～6條引物不同，RPA/RAA方法只需要2條引物，因此更容易進行多重檢測體系的建立。Crannell等[35]建立了基于多重LFD試紙條的糞便病原體的多重RPA核酸擴增體系，可同時檢測鞭毛蟲、隱孢子蟲和內阿米巴原蟲；Lau等[36]基于表面增強拉曼散射檢測技術，建立了植物病原體的多重RPA核酸擴增體系，可同時檢測灰霉病菌、丁香假單胞菌和尖孢鐮刀菌。本研究所建立的褐飛虱單重檢測方法為基于RPA/RAA技術的褐飛虱、偽褐飛虱、擬褐飛虱三重檢測系統的開發奠定了基礎。

綜上所述，本研究建立的RAA-LFD法檢測體系，提高了褐飛虱鑒定準確性、縮短了鑒定時間、脫離了對精密儀器的依賴，擺脫了對分類專業技能的要求，突破了核酸檢測在植保領域大范圍推廣的技術瓶頸，可為褐飛虱的精準綠色防控提供技術支撐。唯一不足是RAA試劑及LFD試紙條價格昂貴，不利于大范圍推廣，且存在氣溶膠污染風險。目前，本團隊正在開發基于RAA+微流控紙基芯片的褐飛虱速測技術及配套產品，有望解決成本高及交叉污染問題。

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A Rapid Detection Assay ofBased on Recombinase Aided Amplification-lateral Flow Dipstick Technology

LUO Ju, TANG Jian, WANG Aiying, YANG Baojun, LIU Shuhua*

(,,,;Corresponding author, E-mail: tangjian@caas.cn)

【】To solve the time- and labor-costing problem for accurate identification oftrapped by light, we aim to establish a fast and convenient qualitative identification method.】At first, we selected a couple of primers which are species specific for. Then, we established an identification method based on Rapid Aided Amplification-Lateral Flow Dipstick (RAA-LFD) technology. Finally, we analyzed the temperature and template robustness of this method. 【】The RAA-LFD method developed in the present study is convenient and fast, and it does not depend on any sophisticated instrument. Furthermore, this method can amplify effectively with crude tissue fluid as template, and it can be triggered by body temperature. The entire process for 56 specimens, including the crude tissue liquid preparation, isothermal amplification, and LFD detection, can be completed in 45 min with an accuracy of 100%. 【】This RAA-LFD method is a time-saving and easy-to-apply molecular diagnostic method forugens identification from its two sibling species. It is really suitable for Point of Care Test (POCT) in plant protection station or in field.

;China;(Muir); RAA-LFD; Point of Care Test

10.16819/j.1001-7216.2022.210314

2021-03-29；

2021-05-18。

浙江省自然科學基金資助項目（LGN21C140002）；中國水稻研究所重點研發項目（CNRRI-2020-03）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（CPSIBRF-CNRRI-202123）；中國農業科學院科技創新工程資助項目。