地夸磷索鈉滴眼液在肉毒桿菌毒素B誘導(dǎo)的干眼模型中的應(yīng)用研究

冀杰 呂佳 龐龍 林斌武

干眼(Dry eye)是一種由多種致病因素(眼表的病理改變，炎癥反應(yīng)，性激素水平改變等等)所導(dǎo)致的，可以威脅到視力的常見眼表疾病。其特征性的表現(xiàn)主要為眼部不適，視力下降，淚膜不穩(wěn)定并伴隨淚液滲透壓的增加和眼表的炎癥狀態(tài)[1]。目前對于干眼的治療手段包括用眼習(xí)慣的改善、物理療法、藥物療法與必要時的手術(shù)干預(yù)。而藥物療法，是目前干眼的主要治療方法。治療干眼的滴眼液主要有人工淚液、皮質(zhì)類固醇激素、非甾體類抗炎藥以及免疫抑制劑等[2]。其中0.3%玻璃酸鈉滴眼液是目前應(yīng)用最廣泛且最具代表性的干眼治療藥物，可以單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合使用。而3%濃度的地夸磷索鈉(diquafosol tetrasodium，DQS)是一種P2Y2受體激動劑，P2Y2受體激動劑是一種治療干眼癥的新型藥物,它能夠通過激動位于眼表的P2Y2受體[3-4]，促使結(jié)膜上皮細(xì)胞淚液的分泌以及結(jié)膜杯狀細(xì)胞對黏蛋白的分泌，從而增強(qiáng)淚膜穩(wěn)定性，改善干眼癥狀，同時也有研究表明，3%DQS滴眼液可以改善干眼大鼠眼表炎癥因子水平[5]。因此，本研究通過對比0.3%玻璃酸鈉滴眼液，3%地夸磷索鈉滴眼液以及二者聯(lián)合以后對于干眼小鼠治療作用，從而進(jìn)一步探索3%地夸磷索鈉滴眼液在干眼中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級CBA/J小鼠40只，雌性，6～8周齡，體重13～18 g。全部購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于SPF級標(biāo)準(zhǔn)動物房，自由取食飲水。本實驗中所有小鼠喂養(yǎng)和研究過程均遵循《實驗動物管理條例》，符合動物倫理學(xué)要求。

1.2BTX-B干眼動物模型的建立[6]參考文獻(xiàn)中所報道的方法：(1)配制20mU/50uL的BTX-B溶液，造模前30分鐘配制，4℃保存。(2)4.3%水合氯醛腹腔注射(10mL/kg)麻醉小鼠。(3)將小鼠置于顯微操作臺上，手術(shù)顯微鏡下檢查所有鼠眼無炎癥及其它病變，選取右眼為實驗眼，0.5%丙美卡因滴眼液行表面麻醉。(4)在顯微鏡下，用棉簽拭去結(jié)膜囊內(nèi)多余的液體，用顯微無齒鑷輕輕將眼球向下?lián)荛_，透過球結(jié)膜觀察淚腺位置。(5)將帶有33G針頭的注射器，吸取50ul BTX-B溶液。(6)透過球結(jié)膜將50ul BTX-B溶液注入小鼠淚腺中，妥布霉素眼膏涂眼。

1.3實驗方法 將40只造模完成后小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：生理鹽水組：給予生理鹽水治療,1 滴/ 次,4 次/天，連續(xù)28天。玻璃酸鈉滴眼液組：給予0.3%玻璃酸鈉滴眼液[參天制藥( 中國) 有限公司,國藥準(zhǔn)字J20070064,]治療,1滴/次,4 次/天，連續(xù)28天。地夸磷索鈉滴眼液組：給予3%地夸磷索鈉滴眼液[參天制藥( 中國) 有限公司,國藥準(zhǔn)字J20180008] 治療,1 滴/ 次,4次/天，連續(xù)28天。聯(lián)合組：同時給予玻璃酸鈉滴眼液及地夸磷索鈉滴眼液治療，1 滴/ 次,4次/天，連續(xù)28天。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1淚液分泌量的檢測及角膜上皮熒光素染色 分別在造模前1天，造模后第3天，滴用眼藥水后第3，7，14和28天進(jìn)行檢測。用酚紅棉線法測量小鼠淚液分泌量。具體如下：小鼠在未麻醉狀態(tài)下，將小鼠固置于手術(shù)顯微鏡下，用鑷子夾持一根酚紅棉線，輕輕放置在小鼠的內(nèi)眥部，注意不要刺激角膜，持續(xù)15s，游標(biāo)卡尺測量淚液分泌長度。用熒光素鈉法評估小鼠角膜上皮的缺損情況。具體如下：小鼠處于未麻醉狀態(tài)，0.5%熒光素染色，裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察角膜上皮愈合情況，上皮缺損處顯示綠色，裂隙燈拍照并評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：將角膜分為5個區(qū)域，每個區(qū)域分別評分。0分，無染色；1分，散在點狀染色；2分，彌漫點狀染色；3分，片狀染色。5個區(qū)域評分完畢后將其總和。

1.4.2角結(jié)膜組織中炎癥因子的表達(dá) 在滴用滴眼液28天后，處死小鼠，收集角結(jié)膜組織檢測IL-1 β和TNF-α的mRNA及蛋白表達(dá)水平。采用實時定量PCR反應(yīng)檢測角結(jié)膜中IL-1 β和TNF-α的mRNA表達(dá)水平，采用SYBR?Platinum?Green qPCR SuperMix-UDG with ROX(Invitrogen 公司)試劑盒在ABI PRISM 7000中完成反應(yīng)。每個樣品做3個復(fù)孔。(引物見表1)。 以GAPDH為內(nèi)參相對定量各組樣品目的基因的表達(dá)水平，用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Invitrogen)檢測小鼠角結(jié)膜組織中IL-1 β和TNF-α的蛋白水平。

表1 小鼠定量PCR反應(yīng)引物

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差( Mean±SD) 表示,根據(jù)數(shù)據(jù)的分布模式及方差齊性采取t檢驗或者秩和檢驗；計數(shù)資料以率(%) 表示,采用2檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1各組小鼠淚液分泌和角膜熒光素鈉染色評分的改變情況 通過對造模前1天，造模后第3天，給藥后第3，7，14和28天的淚液分泌量(酚紅棉線法，圖1和表2)和角膜熒光素鈉染色評分(圖2和表3)分析可得：相對于造模前(pre-injection)，造模后第3天(baseline)淚液分泌量明顯降低(P<0.05)。給予不同滴眼液干預(yù)以后，對比生理鹽水組(saline)，聯(lián)合用藥組(0.3%HA +3%DQS)于2周時(week 2)(P<0.05)，淚液分泌量開始明顯增加(P<0.05)，并有統(tǒng)計學(xué)意義，用藥4周后 (week 4)，玻璃酸鈉組(0.3%HA)和地夸磷索鈉組(3%DQS)才產(chǎn)生具有統(tǒng)計學(xué)差異的淚液分泌增加(P<0.05)，玻璃酸鈉組和地夸磷索鈉組之間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，聯(lián)合用藥組的淚液分泌量明顯多于玻璃酸鈉組和地夸磷索鈉組(P<0.05)。

圖1 淚液分泌

表2 各組小鼠淚液分泌量的變化

圖2 角膜熒光素染色

表3 各組小鼠角膜熒光素鈉染色評分變化情況

相對于造模前(pre-injection)，造模后第3天(baseline)角膜熒光素鈉染色評分明顯升高(P<0.05)。給予不同滴眼液干預(yù)以后，對比生理鹽水組(saline)，聯(lián)合用藥組(0.3%HA+3%DQS)、玻璃酸鈉組(0.3%HA)和地夸磷索鈉組(3%DQS)于4周時(P<0.05)，角膜熒光素鈉染色評分明顯改善(P<0.05)，并有統(tǒng)計學(xué)意義，玻璃酸鈉組和地夸磷索鈉組之間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，聯(lián)合用藥組的角膜熒光素鈉染色評分明顯低于玻璃酸鈉組和地夸磷索鈉組(P<0.05)。

2.2各組小鼠角結(jié)膜組織中炎癥因子表達(dá)情況 在滴用滴眼液4周后，處死小鼠，收集角結(jié)膜組織檢測IL-1 β和TNF-α的mRNA及蛋白表達(dá)水平(圖3和表4)。結(jié)果顯示：相對于生理鹽水組(saline)，聯(lián)合用藥組(0.3%HA+3%DQS)、玻璃酸鈉組(0.3%HA)和地夸磷索鈉組(3%DQS)小鼠角結(jié)膜組織和淚腺組織炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)，且玻璃酸鈉組和地夸磷索鈉組之間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，聯(lián)合用藥組的角膜熒光素鈉染色評分明顯低于玻璃酸鈉組和地夸磷索鈉組(P<0.05)。

圖3 眼表炎癥因子

表4 各組小鼠角結(jié)膜炎癥指標(biāo)表達(dá)情況

3 討論

干眼癥流行病學(xué)研究顯示： 30～40歲干眼癥發(fā)病率超過20%,70歲以上發(fā)病率則達(dá)到36.1%，其中女性的發(fā)病率較高，約為22.18%；男性的發(fā)病率較低，約為14.9%[7]，并且近年來干眼癥的發(fā)病率有逐年增高的趨勢，故對干眼癥發(fā)病機(jī)制以及治療方法的研究具有十分重要的意義。同時越來越多的證據(jù)顯示，炎癥在干眼的發(fā)病以及疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。盡管引起干眼的起始病因以及參與的因素不同(如炎癥，細(xì)胞凋亡、神經(jīng)調(diào)節(jié)及性激素等)，但一旦進(jìn)入進(jìn)展階段，炎癥將成為干眼癥發(fā)病機(jī)制中最關(guān)鍵的因素,從而使不同類型的干眼癥表現(xiàn)出相似的病理生理改變，目前對于炎癥在干眼發(fā)病機(jī)制中的作用的研究，其主要觀點為：各種病理因素的損傷導(dǎo)致干眼后直接或間接的引起眼表炎癥，眼表炎癥再進(jìn)一步導(dǎo)致眼表上皮或淚腺功能的障礙，從而加重干眼的癥狀[8-9]。因此，我們在研究中初步探討了玻璃酸鈉滴眼液、地夸磷索鈉滴眼液以及二者聯(lián)合使用，對干眼小鼠的臨床指標(biāo)(淚液分泌以及角膜熒光素鈉染色評分)以及眼表炎癥水平的改善情況。

迄今為止，干眼相關(guān)的動物模型種類很多，按動物種類來分，有兔，鼠和狗。以造模方式來分則有，手術(shù)摘除淚腺和副淚腺，肌肉注射阿托品，破壞眼表的神經(jīng)支配，環(huán)境誘導(dǎo)干眼模型(暴露于高流量的空氣中)，皮下注射東莨菪堿，環(huán)境與皮下注射東莨菪堿相結(jié)合等等。在這些誘導(dǎo)方法中，皮下注射東莨菪堿或環(huán)境與皮下注射東莨菪堿相結(jié)合的干眼模型，是目前較為經(jīng)典也較為常用的干眼模型，然而該兩種方法所誘導(dǎo)的干眼狀態(tài)，通常持續(xù)的時間較短，干眼的狀態(tài)也不是很穩(wěn)定[10]。而本研究所采用的干眼動物模型為：小鼠淚腺內(nèi)注射肉毒桿菌毒素B(BTX-B)誘導(dǎo)的干眼模型，此模型是2006年Olan Suwan-apichon最早報道的一種模擬非干燥綜合征性干眼的干眼模型[6]，相比于其他的經(jīng)典干眼模型，此模型持續(xù)時間更久，持續(xù)時間可達(dá)30～60天，也更加穩(wěn)定，更加符合干眼這一慢性疾病的病理過程。因此我們選擇該種動物模型作為此次研究的干眼模型。

地夸磷索鈉滴眼液是一種P2Y2受體激動劑，于2010年在日本上市。P2Y2受體在全身表達(dá)，并存在于角膜及結(jié)膜上皮細(xì)胞、結(jié)膜杯狀細(xì)胞以及瞼板腺中[11]。當(dāng)?shù)乜淞姿麾c與位于結(jié)膜杯狀細(xì)胞膜上的P2Y2受體結(jié)合后，可以刺激杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白， 同時開結(jié)膜上皮細(xì)胞膜上的Ca2+依賴性Cl-通道，產(chǎn)生滲透壓差，促進(jìn)結(jié)膜上皮液體的分泌，從而增加淚液的分泌[12-13]，由此可見，地夸磷索鈉可同時增加淚膜中水分和黏蛋白的含量，在質(zhì)和量兩方面改善淚液的分泌，從而增強(qiáng)淚膜穩(wěn)定性[14-15]。在實驗中，單獨(dú)使用地夸磷索鈉或玻璃滴眼液都可以增加干眼小鼠的淚液分泌，降低眼表熒光素染色評分以及改善眼表炎癥因子的表達(dá)情況，但和玻璃酸鈉滴眼液相比，地夸磷索鈉滴眼液未表現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性。經(jīng)聯(lián)合使用后，對干眼小鼠的治療效果以及對眼表炎癥情況的改善明顯好于單獨(dú)使用，這可能和二者的互補(bǔ)性有關(guān)。根據(jù)最近日本干眼協(xié)會提出的一種全新的干眼治療方法，淚膜定向療法[16]，該方法基于干眼的淚膜的逐層診斷，通過各種診斷技術(shù)，將干眼的病因精確的定位于淚膜的不同層次，然后針對不同淚膜的層次從而有針對性的治療，其中，玻璃酸鈉滴眼液就是主要用于改善水液層，地夸磷索鈉滴眼液則可以同時改善脂質(zhì)層，水液層和黏蛋白層，但由于結(jié)膜上皮自分泌增加的淚液量較主淚腺和副淚腺所分泌的淚液量明顯偏少，所以地夸磷索鈉滴眼液對水液層的治療作用有限，而玻璃酸鈉滴眼液正好彌補(bǔ)了地夸磷索鈉滴眼液之一不足之處，因此，二者聯(lián)合以后對干眼的治療作用明顯好于單獨(dú)使用。另外，如前所述，炎癥在干眼中的作用越來越被重視，地夸磷索鈉滴眼液聯(lián)合玻璃酸鈉滴眼液滴眼液可以有效的抑制眼表炎癥因子的分泌，可增強(qiáng)其對干眼的治療作用。

綜上所述，單獨(dú)地夸磷索鈉滴眼液和玻璃酸鈉滴眼液均能對肉毒桿菌毒素B誘導(dǎo)的干眼小鼠起一定的治療作用，并且二者聯(lián)合使用以后，會產(chǎn)生一定的互補(bǔ)作用，使治療作用大大加強(qiáng)，并能明顯改善眼表的炎癥狀態(tài)，從而更加有效的治療干眼。