全胃腸外營養對幼鼠心肌的損傷作用及其機制

孫曉東，沈蕾蕾，鄭瑞雪，趙慶寧，陳盛*

1陸軍軍醫大學第一附屬醫院兒科，重慶 400038；2陸軍軍醫大學第一附屬醫院病理科，重慶 400038

全胃腸外營養(total parenteral nutrition，TPN)已廣泛應用于臨床。極低或超低出生體重兒的早期腸內喂養困難，常需給予TPN治療；患有壞死性小腸結腸炎、喂養不耐受、自發性腸穿孔、短腸綜合征及胃腸道手術后等的患兒，也需要長時間的TPN治療。因此，TPN已成為挽救患兒生命的重要營養支持手段。但TPN也可引起多種并發癥，如肝損傷、感染、血栓形成和代謝紊亂等，其中較為常見的是胃腸外營養相關性肝疾病(PNALD)。有研究發現，長時間TPN可導致40%～60%的患兒肝功能異常，嚴重者可誘發肝纖維化、門脈高壓甚至死亡[1]。近年來，TPN對心血管系統的影響已引起國內外學者的高度關注[2]。臨床上長期TPN可引起心輸出量降低和肺毛細血管楔壓增高，QT間期延長[3-4]，且心功能的下降程度與脂肪乳劑呈劑量依賴性[5]。Demircan等[6]發現，TPN動物模型在放置PICC導管之外的血管中存在內皮損傷，提示TPN可能損傷心血管系統。但是，目前國內尚未見TPN對心臟損傷作用的報道，因此，本研究通過構建TPN動物模型，探討TPN對心臟的損傷作用及其可能機制，旨在為臨床防治TPN相關心臟并發癥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級Sprague-Dawley雄性幼鼠24只，體重220～240 g，購自陸軍軍醫大學實驗動物中心[合格證號：SCXK(渝)20170002]，并飼養于陸軍軍醫大學第一附屬醫院實驗動物中心。本研究已通過動物倫理委員會的批準(AMUWEC20201551)，研究過程符合醫學動物實驗的倫理要求。

1.2 主要試劑 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(C1090)、MDA檢測試劑盒(S0131S)、H2O2檢測試劑盒(S0038S)、DAPI(C-1005)(上海碧云天生物技術有限公司)，MPO抗體(22225-1-AP，中國武漢Proteintech公司)，β-actin(SC-8432，美國Santa Cruz公司)，Total RNA Kit Ⅰ(R6834-01，美國Omega公司)，ReverTra Ace-α-反轉錄試劑盒(FSK-101，日本TOYOBO公司)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201，日本TOYOBO公司)?；蛞镉芍袊ど锕こ坦煞萦邢薰竞铣伞?/p>

1.3 主要儀器 低溫離心機(德國Sigma公司)，酶標儀(美國Thermofisher公司)，Bio-Rad 3000微量光度計、CFX96 Software PCR儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(法國Evolution-Capt Edge公司)，自動染色機(德國Leica公司)，激光共聚焦系統(德國Carl Zeiss公司)，新生兒1.9F PICC管(美國MediBeacon公司)，單雙通道微量動物輸液泵(東莞恒豐醫療科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物模型 將24只SPF級雄性Sprague-Dawley幼鼠隨機分為4組(n=6)：正常組、對照組、TPN-7 d組及TPN-14 d組，各組幼鼠周齡及體重差異無統計學意義(P＞0.05)。對照組、TPN-7 d和TPN-14 d組提前禁食1 d，經腹腔注射麻醉后消毒鋪巾，在幼鼠右頸做一0.5 cm長切口，分離出右頸靜脈，將肝素化的1.9F PICC管插入1.0～1.5 cm，進入上腔靜脈后固定，關閉切口，PICC末端經皮下隧道自幼鼠背部引出，經皮縫合固定于幼鼠背側。對照組幼鼠經頸靜脈置管后在輸液泵控制下持續輸入生理鹽水，術后24 h內以1 ml/h輸注，24 h后以2 ml/h輸注，可自由進食進水；TPN-7 d和TPN-14 d組幼鼠經頸靜脈置管后持續輸入靜脈營養液，術后24 h內以1 ml/h輸注，24 h后以2 ml/h輸注，并禁食禁水；正常組不做處理，正常喂食標準鼠糧，自由飲水。正常組、對照組、TPN-7 d組、TPN-14 d組幼鼠分別在建模第14、14、7、14天處死，獲取心肌組織。

1.4.2 TPN營養液的配制 參照文獻[7-8]報道的方法配制TPN營養液：TPN組幼鼠經中心靜脈導管連續避光輸注TPN營養液[205 kcal/(kg.d)]，每升TPN溶液中包含450 ml復方氨基酸(華潤雙鶴制藥公司，中國)，360 ml 50%葡萄糖(中國大冢制藥有限公司)，140 ml脂肪乳(中國費森尤斯卡比華瑞制藥有限公司)，同時添加微量元素、維生素和電解質。

1.4.3 HE染色觀察各組幼鼠心肌組織的病理學變化 將幼鼠心臟新鮮樣品剪成小塊，用4%多聚甲醛固定24 h，經不同濃度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚度3 μm)，切片放入自動染色機中染色、封片，然后在光學顯微鏡下觀察各組心肌組織的病理學變化。

1.4.4 TUNEL法檢測各組幼鼠心肌組織的細胞凋亡情況 切片脫蠟后按照TUNEL試劑盒說明書檢測各組幼鼠心肌組織的細胞凋亡情況，在200倍光鏡下隨機觀察5個視野，計算每個視野的凋亡指數。凋亡指數(%)=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.4.5 ELISA法檢測各組幼鼠心肌組織中丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量 將幼鼠心臟新鮮樣品剪碎，加液氮研磨成粉，加入裂解液，4 ℃ 下12 000×g離心，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書用分光光度計檢測心肌組織MDA和H2O2含量。

1.4.6 qRT-PCR檢測各組幼鼠心肌組織MPO mRNA的表達情況 將幼鼠心臟新鮮樣品剪碎，加液氮研磨成粉，加適量Trizol裂解液提取總RNA，使用ReverTra Ace-α-反轉錄試劑盒合成cDNA。反應條件為：42 ℃ 10 min，30 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。再將合成的cDNA作為熒光定量模板，以β-actin為內參照。反應體系：2×SYBR Green 10 μl+cDNA模板2 μl+上下游引物各0.3 μl，加去離子水至總體積20 μl。反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環。引物序列：MPO，正義5‘-CCAGCCAGATTTCCTGTCT CC-3‘，反義5‘-TGAGCGTCCCAATTCCTTTGA-3‘，片段長度211 bp；β-actin，正義5‘-GAGAGGGAAAT CGTGCGT-3‘，反義5‘-GGAGGAAGAGGATGCGG-3‘，片段長度250 bp。結果以相對表達倍數表示。

1.4.7 Western blotting檢測幼鼠心肌組織MPO蛋白的表達情況 將幼鼠心臟新鮮樣品剪碎，加液氮研磨成粉，冰上裂解30 min。離心后取上清，加入適量5×loading Buffer，取等量蛋白樣品上樣，電泳、轉膜。PVDF膜封閉浸于一抗溶液中，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，化學發光法顯影。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，蛋白相對表達水平以MPO/β-actin的比值表示。

1.4.8 免疫熒光檢測幼鼠心肌組織MPO的表達情況 石蠟切片脫蠟復水后置于抗原修復液中(92 ℃15 min)，自然冷卻后用5% BSA封閉15 min，滴加一抗4 ℃過夜(12 h以上)，滴加二抗37 ℃ 1 h，滴加DAPI工作液室溫1 min，封片，熒光顯微鏡拍片，ImageJ軟件分析熒光強度。

1.5 統計學處理 采用SPSS 27.0軟件進行統計分析，采用GraphPad Prism 8.0作圖。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組幼鼠心肌組織的病理學變化 HE染色結果顯示，正常組、對照組幼鼠心肌纖維形態正常，排列整齊，未見明顯出血、腫脹和壞死，未見明顯炎性細胞浸潤，肌原纖維結構完整(圖1A、B)；TPN-7 d組有3只幼鼠(50%)心肌組織可見輕微間質出血和少量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主(圖1C)；TPN-14 d組所有幼鼠的心肌組織均出現了輕到重度損傷，重度損傷可表現為間質出血和水腫、血管擴張、心肌間隙增寬、少許壞死和大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞、漿細胞、淋巴細胞為主(圖1D)。

圖1 各組幼鼠心肌組織病理學變化(HE ×200)Fig.1 Pathological changes of myocardial tissue in each group (HE ×200)

2.2 各組幼鼠心肌細胞凋亡情況比較 TUNEL染色結果顯示，正常組、對照組、TPN-7 d組及TPN-14 d組幼鼠心肌細胞凋亡率分別為3.34%±2.91%、3.48%±1.06%、10.97%±5.16%、23.24%±4.20%，與正常組、對照組相比，TPN-7 d組、TPN-14 d組心肌細胞凋亡指數明顯升高(P＜0.05)，且TPN-14 d組凋亡指數明顯高于TPN-7 d組(P＜0.05)(圖2)。

圖2 各組幼鼠心肌細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of myocardial cells in each group

2.3 各組幼鼠心肌組織MDA及H2O2含量比較 與正常組、對照組比較，TPN-7 d組MDA含量未見明顯升高，差異無統計學意義(P＞0.05)，而TPN-14 d組較正常組、對照組及TPN-7 d組均明顯升高(P＜0.05)；與正常組、對照組比較，TPN-7 d組、TPN-14 d組幼鼠H2O2含量明顯升高(P＜0.05)，且TPN-14 d組明顯高于TPN-7 d組(P＜0.05)(表1)。

表1 各組幼鼠心肌組織MDA、H2O2含量比較(，n=6)Tab.1 Comparison of MDA and H2O2 levels in myocardium of young rats in each group (, n=6)

表1 各組幼鼠心肌組織MDA、H2O2含量比較(，n=6)Tab.1 Comparison of MDA and H2O2 levels in myocardium of young rats in each group (, n=6)

與正常組、對照組比較，(1)P＜0.05；與TPN-7 d組比較，(2)P＜0.05。

項目 正常組 對照組 TPN-7 d組 TPN-14 d組 F P MDA(μmol/mg) 1.97±0.19 3.88±0.60 4.37±0.32 7.00±0.69(1)(2) 88.380 0.000 H2O2(μmol/L) 0.61±0.27 1.20±0.18 2.22±0.28(1) 3.43±0.48(1)(2) 74.450 0.000

2.4 各組幼鼠心肌組織MPO mRNA表達情況比較與正常組、對照組比較，TPN-7 d組MPO mRNA表達無明顯升高，差異無統計學意義(P＞0.05)，而TPN-14 d組較正常組、對照組及TPN-7 d組均明顯升高(P＜0.05)(圖3)。

圖3 各組幼鼠心肌組織MPO mRNA表達情況Fig.3 Relative expression level of MPO mRNA in myocardial tissue of young rats in each group

2.5 各組幼鼠心肌組織MPO蛋白表達情況比較Western blotting檢測結果顯示，與正常組、對照組比較，TPN-14 d組及TPN-7 d組MPO蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)，且TPN-14 d組明顯高于TPN-7 d組(P＜0.05)(圖4)。

圖4 各組幼鼠心肌組織MPO蛋白表達情況Fig.4 Expression of MPO protein in myocardial tissue of each group

2.6 各組幼鼠心肌組織MPO免疫熒光表達情況比較 正常組、對照組、TPN-7 d組及TPN-14 d組幼鼠心肌組織MPO的熒光強度分別為8.28±2.09、10.35±3.07、17.48±1.77、32.54±6.08，與正常組、對照組比較，TTPN-7 d組及TPN-14 d組幼鼠MPO熒光強度明顯升高(P＜0.05)，且TPN-14 d組明顯高于TPN-7 d組(P＜0.05)(圖5)。

圖5 各組幼鼠心肌組織MPO免疫熒光表達情況Fig.5 MPO immunofluorescence expression in myocardium of each group

3 討 論

TPN作為重要的營養支持及治療措施，已成為腸內喂養困難或禁食患兒不可缺少的治療手段，但長時間TPN導致的并發癥可影響患兒的生活質量及治療結局。TPN對心血管系統也存在不同程度的影響，有研究表明，TPN配方中的脂肪乳劑可減輕局部麻醉劑、氟哌啶醇和三環類抗抑郁藥對心臟的毒性作用，其機制與增加心肌細胞內鈣離子水平從而增強心肌的收縮力有關[9]；也有研究證實，脂肪乳劑可改善心肌組織的缺血再灌注損傷[10]。然而，由TPN導致的心血管系統不良事件日益增多[2,11]，研究發現，TPN可引起置管以外的血管內皮細胞損傷[6]；有報道接受不到2周標準TPN治療的嬰兒死于心臟驟停，而尸檢并未發現心臟器質性病變，推測與TPN致心肌損傷有關[12]；Marfella等[3]發現，靜脈輸入脂肪乳劑后，隨時間延長，血液兒茶酚胺水平升高，心臟復極期延長。有文獻報道，即使在導管放置位置無誤的情況下，經中心靜脈置管輸注TPN也可能會出現心包積液和心臟壓塞等嚴重情況[13]。因此，探討TPN對心血管系統尤其是心肌的損傷作用及其機制對預防相關并發癥具有重要的臨床意義。

本研究通過構建TPN動物模型發現，經過7 d的TPN后，50%的幼鼠心肌組織出現了輕度的病理損傷，而經過14 d的TPN后，所有幼鼠的心肌組織均出現輕到重度損傷。TUNEL染色發現，TPN 1周后心肌細胞凋亡增加，且TPN-14 d組多于TPN-7 d組，提示1周的TPN即可引起心肌損傷，且隨TPN時間的延長，心肌損傷加重，與Gürünlüo?lu等[14]的報道一致，他們通過建立10 d TPN兔模型發現心肌組織在病理上出現了空泡變性、壞死和水腫，在電鏡下肌纖維變性和喪失，細胞質水腫、線粒體固縮、脂滴明顯。一項針對健康受試者進行的臨床隨機交叉試驗發現，與鹽水輸入組比較，TPN組QT間期延長，表明TPN可能破壞了心肌的電化學信號[3]。胃促生長素(ghrelin)具有保護心血管系統的生物學作用，可通過特定的受體介導心臟血管舒張，增強心肌收縮力。Hagiwara等[15]利用大鼠動物模型發現，TPN組的胃促生長素水平較完全腸內營養組明顯降低，心功能明顯降低。以上研究均證實TPN可導致心肌損傷，根據現有的文獻，其病理機制可能與以下幾個方面有關：(1)光能破壞TPN營養液中具有抗氧化作用的維生素，導致機體氧化-抗氧化系統失衡，誘導脂質過氧化，從而損傷心肌細胞[16]。(2)由于缺乏腸道營養的刺激，腸道蠕動減少，腸道內微生物群的組成和功能發生改變，從而誘導腸道炎癥及促進腸道通透性增加，易致細菌或內毒素(LPS)移位。有研究發現，1周的TPN即可引起門靜脈部位的LPS水平升高[17]；筆者團隊的研究也發現，持續2周的TPN可導致幼鼠先天性及獲得性免疫功能受損，IL-1β、TNF-α水平升高，而IL-10、IL-4水平降低(待發表)。(3)TPN營養液經導管通過右側頸靜脈輸入，首先到達的部位即為右心房，使心肌長期處于高濃度脂質和高濃度葡萄糖的局部環境中，影響了心肌細胞的正常代謝。(4)TPN營養液配方中高比例的ω-6脂肪乳劑可使線粒體功能紊亂，從而誘導死亡受體的表達，導致細胞凋亡[18]。(5)由于腸內營養缺失，腸促胰島素分泌減少，使高血糖的發生率增高，也是心肌損傷的重要機制之一[19]?？傊?，TPN可導致心肌受損，成為臨床上心輸出量降低、肺毛細血管楔壓增高[4]、心功能下降[5]、QT間期延長[3]的重要原因；此外，超過2周的TPN是院內感染的獨立危險因素，部分患兒院內感染表現為以右心衰竭為主要的膿毒癥癥狀，但鑒于大多數患兒血液培養結果為陰性，且心力衰竭時促炎因子呈過度激活狀態，因此，此類臨床癥狀究竟是由感染所致還是TPN介導的心肌損傷所致，往往很難鑒別，需引起高度重視。

TPN導致心肌損傷的分子機制目前尚不清楚。本研究發現，TPN組幼鼠心肌組織H2O2含量及MPO蛋白表達水平升高，且隨TPN時間的延長更為明顯；MDA含量及MPO mRNA在7 d時雖未升高，但14 d時升高明顯。H2O2是活性氧(ROS)家族的組成成分，是細胞生長、炎癥、氧化應激在內的各種病理生理過程中的關鍵信號分子。MDA是脂質過氧化的最終產物，脂質過氧化是一種連鎖反應，可持續提供氧自由基。MPO是血紅素過氧化物酶超家族的一員，主要在中性粒細胞和單核細胞中表達，存在于嗜藍顆粒中。白細胞激活時可分泌MPO，通過酶促反應產生次氯酸(HOCl)和其他活性物質，通過損傷內源性抗氧化防御機制導致心肌損傷[20-21]，中性粒細胞是主要的心肌損傷早期反應細胞，而MPO則可作為中性粒細胞的功能標志和激活標志，在心肌損傷24 h內出現，早于心肌酶譜的變化，是反映心肌早期炎性損傷的重要指標之一[22]。H2O2、MDA及MPO均是反映心肌氧化應激的標記物，因此本研究結果也表明氧化應激介導了TPN導致的心臟損傷。Gürünlüo?lu等[14]也發現，10 d的TPN兔模型心肌組織中的MDA、過氧化氫酶、氧化應激指數(OSI)等均出現升高，同時反映慢性心肌損傷和氧化應激指標的相對端粒長度明顯降低。此外，有臨床研究發現，經過5 d的TPN后，新生兒血液中MDA的含量較TPN前反而降低了，推測與營養液中維生素C的抗氧化作用有關[23]。而本研究結果表明，長時間的TPN后，即使在使用維生素C的情況下仍不能完全消減對心肌的氧化損傷。TPN對心肌的氧化損傷可能與ROS的過量生成有關，TPN相關性高血糖破壞線粒體功能可能是其重要原因之一[19]。物質代謝產生的電子在線粒體中經過電子傳遞鏈傳遞給O2，此過程受到質子電化學梯度的嚴格控制，而高血糖使三羧酸循環過度活躍，進而產生大量的電子流，破壞正常的質子電化學梯度，使電子不經過復合體Ⅲ的傳遞而直接經輔酶Q傳遞給O2，最終導致ROS的大量生成[24]。高血糖還可通過活化甘油二酯(DAG)、蛋白激酶C(PKC)和NADPH氧化酶等信號途徑促進ROS的大量釋放[25-26]。此外，TPN溶液受到光的影響導致抗氧化維生素的損失和包括脂質過氧化物在內的多種過氧化物的過量產生，也是機體過量ROS的重要來源[16]。脂肪乳劑中的ω-6多不飽和脂肪酸是否可促進炎癥尚存爭議，但ω-6/ω-3比例較高時，炎癥狀態較明顯，因此不當的ω-6/ω-3比例可能也是促進ROS過量產生的重要原因[27]。

綜上所述，本研究結果顯示，1周的TPN即可引起心肌損傷，且隨著時間的延長而加重，氧化應激可能是其重要的機制之一。因此，盡可能縮短TPN使用時間，盡早開始腸內營養，對防治TPN的心肌并發癥具有重要的臨床意義。但本研究也存在一些局限性，如設置的時間點為第7天、第14天，而在TPN第7天時心肌損傷已經發生，且隨時間延長而加重，但目前尚未找到TPN造成心肌損傷的起始時間點，需在后續研究中進一步細化時間點。