內質網自噬及其與疾病的關系研究進展

張慧芳，黃自能，陳蔚，孫林，劉伏友，肖力

1中南大學湘雅二醫院腎內科，長沙 410000

自噬是消除聚集的蛋白質及受損細胞器的過程，對于緩解應激、維持細胞穩態及細胞分化等至關重要[1-2]。既往研究認為，自噬對細胞內各種組分的降解是非選擇性的，但目前研究發現，自噬可特異性吞噬多種細胞器，如線粒體、脂滴及內質網等[3-5]。內質網是細胞內最大的內膜系統，在機體的基本生命活動中發揮重要作用。一方面，內質網參與了蛋白質和脂質的生物合成、離子穩態、新生蛋白的質量控制以及細胞器之間的交流，維持細胞的基本功能；另一方面，多種因素可誘發內質網穩態失衡，啟動細胞凋亡程序。內質網持續更新可適應不同的細胞需求，而自噬在這個過程中起著重要作用。在細胞應激狀態下，內質網通過未折疊蛋白反應誘導分子伴侶和相關酶的表達，促進蛋白質折疊，維持內質網穩態。一方面，內質網相關降解途徑可識別錯誤折疊蛋白，促進其轉位至胞質被蛋白酶體降解；另一方面，某些無法轉運至胞質的錯誤折疊蛋白質需要通過內質網自噬降解。內質網自噬的主要生理功能是通過溶酶體降解未折疊蛋白質、錯誤折疊蛋白質和應激的內質網，維持細胞穩態[6]。2005年有研究報道，在酵母中，饑餓可促進內質網通過自噬傳遞至液泡[7]。2015年，Khaminets等[8]發現了內質網自噬受體FAM134B后，內質網自噬相關研究有所進展。越來越多的研究表明，內質網的清除是一個特異性的過程，目前已發現多種內質網自噬受體，但其調控機制仍需進一步研究。內質網自噬與多種疾病密切相關，如神經退行性疾病、感染和腫瘤等。研究內質網自噬的分子調控機制有助于了解疾病的發病機制，尋找新的治療策略。本文對內質網自噬的機制及其與疾病的關系展開綜述。

1 內質網自噬及其機制

1.1 內質網自噬受體介導自噬體對內質網的特異性識別 內質網自噬可分為大自噬、小自噬和囊泡傳遞三種類型。大自噬是指內質網片段和其他內質網腔內成分被自噬體包裹，當自噬體的外膜與溶酶體融合后，自噬體的內膜及其內容物如內質網片段被溶酶體降解。小自噬指部分內質網片段直接被溶酶體或晚期內體吞噬降解[9]。囊泡傳遞指包含未折疊蛋白質或錯誤折疊蛋白質的囊泡從內質網出芽，直接與溶酶體融合[10]。目前研究以大自噬為主，本文主要介紹由自噬相關蛋白(autophagy-related gene，Atg)和內質網自噬受體介導的大自噬。

多種自噬相關蛋白在自噬的不同階段發揮著重要作用，如自噬體的形成和成熟、自噬體對貨物的識別以及自噬體與溶酶體的融合等。研究發現，Atg8在自噬體對內質網的特異性識別中發揮重要作用。自噬體膜上的Atg8與內質網自噬受體結合，促進自噬體沿著降解靶標擴展，最終實現對受損內質網碎片的包裹。目前發現，哺乳動物有6種Atg8家族蛋白：微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3)亞家族LC3A(兩種異構體)、LC3B和LC3C，以及GABA A型受體相關蛋白(GABA type A receptorassociated protein，GABARAP)亞家族GABARAP、GABARAPL1和GABARAPL2[11]。

哺乳動物中內質網自噬受體通過LC3相互作用區域(LC3-interacting region，LIR)或GABARAP相互作用區域(GABARAP-interacting motif，GIM)直接募集自噬體上的LC3或GABARAP。酵母中內質網自噬受體通過Atg8相互作用區域(Atg8-interacting motif，AIM)與自噬體上的Atg8結合，促進內質網與自噬體的融合。相互作用蛋白組學研究發現，有8種內質網跨膜蛋白可作為內質網自噬受體，包括FAM134B、Sec62、長鏈RTN3(RTN3 long isoform，RTN3L)、CCPG1、ATL3、TEX264、Atg39和Atg40(前6種存在于哺乳動物，后2種存在于酵母)(圖1、表1)。最新研究發現，可溶性蛋白質CALCOCO1和Epr1也可作為內質網自噬受體(前者存在于哺乳動物，后者存在于酵母)。這些內質網自噬受體在不同的組織、細胞亞區域、生理和病理條件下發揮作用，其多樣性和潛在機制有待進一步深入研究。

圖1 哺乳動物和酵母中內質網自噬受體的結構Fig.1 Structure of reticulophagy receptors in mammals and yeast

表1 哺乳動物中內質網自噬受體的特點Tab.1 Characteristics of reticulophagy receptors in mammals

FAM134B是FAM134蛋白家族成員，通過羧基端的LIR結構域與LC3B或GABARAP結合，誘導片狀內質網的降解。FAM134B跨膜區域的漿膜蛋白同源結構域(reticulon-homology domain，RHD)有兩個楔形的跨膜螺旋夾和兩個兩親性的螺旋結構，通過寡聚化誘導膜彎曲及蛋白分選[12]。內質網應激條件下，活化的鈣調蛋白激酶-2(calcium/calmodulindependent protein kinase 2，CAMK2)磷酸化RHD，增強FAM134B在內質網發生碎片化時的寡聚化和活性，促進內質網自噬[13]。RHD結構域被破壞和FAM134B缺失可引起片狀內質網大量擴展[8]。饑餓可通過激活CCATT增強子結合蛋白β(CCATT enhancer binding proteins，C/EBPβ)誘導FAM134B-2表達，促進FAM134B-2與自噬體及溶酶體的融合[14]。FAM134B介導的內質網自噬具有重要的生理功能。成纖維細胞生長因子18(fibroblast growth factor 18，FGF18)可通過轉錄因子TFEB/TFE上調FAM134B的表達，特異性激活內質網自噬，促進青鳉魚軟骨細胞蛋白分泌、軟骨生長和骨鈣化[15-16]。Forrester等[17]發現，FAM134B和內生內質網駐留的鈣聯蛋白(calnexin，CANX)參與了原骨膠原的質量控制：CANX與FAM134B相互作用，同時作為共受體識別內質網腔內錯誤折疊的原骨膠原，然后FAM134B與自噬體膜上的LC3結合，將包含CANX和原骨膠原的內質網傳遞至溶酶體降解。然而，內質網自噬過度也可引起細胞損傷和相關疾病。FAM134B過表達可導致HeLa細胞內質網應激、未折疊蛋白反應和細胞死亡[18]。

Sec62是哺乳動物轉位復合物Sec61/Sec62/Sec63的成分之一，可羧基端胞質區含有一個LIR結構域，可作為內質網自噬受體參與內質網應激的恢復過程，特異地傳遞過量的內質網片段至自噬體，恢復內質網的穩態[19]。球形脂聯素通過激活AMPK上調Sec62介導的內質網自噬，減輕慢性間斷性低氧引起的內質網應激和H9C2心肌細胞凋亡[20]。在惡性瘧原蟲和植物中，Sec62的AIM結構域也可與Atg8相互結合，參與內質網自噬。擬南芥Sec62突變體生長受限、授粉異常、繁殖能力下降[21-22]。

漿膜蛋白RTN3L(the long isoform of RTN3，RTN3L)塑造了內質網的管狀區域，其氨基端有6個AIM結構域，跨膜區域有一個RHD結構域，可作為特異性受體與LC3/GABARAP結合。RTN3L的寡聚化足以觸發內質網的碎片化，協助管狀內質網傳遞至溶酶體，且不依賴同樣具有RHD結構域的FAM134B[23]。玉米胚乳中存在RTN1和RTN2的表達，可以劑量依賴的方式重塑內質網結構。內質網應激可促進RTN1和RTN2與Atg8相互作用，調節大自噬，維持內質網穩態[24]。

作為一種內質網駐留的跨膜蛋白(無其他已知的生理功能)，CCPG1有一個LIR結構域和兩個FIP200相互作用結構域(FIP200 interacting region，FIR)，對GABARAP和LC3具有雙重親和力。Smith等[25]發現，CCPG1是內質網應激的效應子，可通過與Atg8和FIP200相互作用參與內質網自噬，維持胰腺腺泡細胞內質網蛋白穩態，防止蛋白質聚集和未折疊蛋白反應過度激活引起的細胞死亡。

Atlastins(ATL1、ATL2、ATL3)是一類膜結合、動力蛋白樣GTP酶，參與了管狀內質網的融合。饑餓狀態下，ATL3通過氨基端的兩個GABARAP互作結構域特異性結合自噬體的GABARAP，介導管狀內質網的降解[26]。Liang等[27]發現，ATL2位于內質網自噬受體FAM134B的下游，其缺失可抑制FAM134B過表達引起的片狀內質網自噬。目前研究發現，FAM134B主要介導片狀內質網的自噬，表明ATL2也可能參與片狀內質網的重塑，協助分離FAM134B標記的內質網，促進自噬體與內質網的融合。

內質網膜蛋白TEX264有一個跨膜結構域和一個LIR結構域，參與管狀內質網的降解。與其他自噬受體相比，TEX264與LC3和GABARAP家族蛋白的相互作用更高效，表達更廣泛。TEX264約占饑餓狀態下自噬流量的50%[28]。單獨敲除TEX264可導致內質網自噬顯著減弱；同時敲除TEX264、FAM134B和CCPG1時，內質網自噬基本完全消失[29]。

Atg39和Atg40可作為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)特異性的內質網自噬受體和核自噬受體。Atg39定位在核周內質網和核被膜，誘導部分核的自噬隔離。Atg39的氨基端含有一個AIM和一個Atg11互作結構域，以及一個跨膜結構域。在氮剝奪的情況下，Atg39依賴的核周內質網自噬和核自噬可促進細胞存活。Atg40在皮層和胞質內質網中含量豐富，其氨基端含有一個AIM結構域和兩個跨膜結構域[30]。在饑餓條件下，自噬體的Atg8與Atg40多價結合，誘導Atg40的漿膜蛋白樣結構域產生高度彎曲的內質網，并且包裝這些結構域進入自噬體[31]。

CALCOCO1是一種可溶性的內質網自噬受體，參與毒性蛋白質和饑餓應激引起的管狀內質網降解，其羧基端含有一個FFAT[two phenylalanines(FF) in an acidic tract (AT)，FFAT]樣結構域和一個UIM(ubiquitin-interacting motif，UIM)結構域，氨基端含有一個LIR結構域。CALCOCO1通過FFAT樣結構域與內質網膜蛋白VAPA和VAPB相互作用，通過LIR和UIM結構域與Atg8直接結合，觸發大自噬。與LC3相比，CALCOCO1傾向于與GABARAP結合。敲除CALCOCO1可導致應激狀態下的內質網自噬受損[32-34]。

Epr1是可溶性的內質網自噬受體，由內質網應激誘導產生。Epr1的羧基端含有一個AIM和一個FFAT結構域。Epr1通過FFAT結構域與內質網膜蛋白VAP相互作用定位在內質網上。同時，Epr1通過AIM結構域與Atg8相互作用。內質網應激時，Epr1可被未折疊蛋白反應調節因子肌醇依賴酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)上調。Epr1缺失可導致細胞對內質網應激的耐受力下降，死亡率上升[35]。

1.2 Lst1/Sec24C-Sec23介導自噬體對內質網的隔離 COPII貨物銜接復合物Lst1/Sec24C-Sec23除具有分泌功能外，還可靶向管狀內質網特定區域進行降解[36](圖2)。Lst1/Sec24C-Sec23通過與內質網跨膜蛋白(內質網自噬受體或分泌蛋白)的細胞質結構域相互作用來分選不同的貨物，引導貨物進入分泌途徑或內質網自噬途徑，這兩種不同的內質網運輸途徑由各自的應激反應調節。Lst1/Sec24C介導的內質網自噬由營養剝奪或易聚集蛋白質介導。在酵母中，上調內質網自噬受體Atg40可誘導Lst1-Sec23與Atg40的胞質結構域相互作用，并包裝內質網進入自噬體，介導自噬體對內質網的隔離。在Torin2處理的U2OS細胞中，Lst1的哺乳動物同源類似物Sec24C參與了FAM134B和RTN3L介導的內質網自噬，表明Lst1的功能可能是保守的。但哺乳動物中Sec24是否直接與FAM134B或RTN3L結合而介導自噬體對內質網的隔離仍需進一步研究。包含Lst1/Sec24C-Sec23的內質網自噬位點需要內質網跨膜蛋白Lnp1穩定管狀內質網的連接，其缺失可阻礙Atg40與Atg11(參與自噬體的形成)結合以及內質網進入自噬體[37]。

1.3 泛素化參與內質網自噬 Liang等[38]通過全基因組測序發現泛素化基因參與了內質網自噬(圖2)。內質網膜蛋白三重基序蛋白13(tripartite motif，TRIM13)(E3泛素連接酶)可自身泛素化并募集p62，同時，內質網駐留的分子伴侶通過精氨酰轉移酶1實現精氨酰化，這些精氨酰化的分子伴侶誘導p62的寡聚化，寡聚化的p62與自噬體上的LC3相互作用，表明p62可能作為一種內質網自噬受體。

圖2 哺乳動物和酵母中內質網自噬的機制Fig.2 Mechanisms of reticulophagy in mammals and yeast

類泛素化Ufm1修飾也參與了內質網自噬[38]。與泛素化修飾類似，Ufm1修飾由E1樣活化酶(Uba5)、E2樣結合酶(Ufc1)和E3樣連接酶(UFL1)催化完成。DDRGK1是Ufm1修飾的重要調節因子，調控并維持UFL1的活性[39]。饑餓條件下，內質網膜蛋白DDRGK1將UFL1連接酶攜帶到內質網表面，類泛素化修飾內質網上的RPN1和RPL26(兩者均為核糖體結合蛋白)，促進內質網自噬，抑制IRE1α的表達和未折疊蛋白反應。此外，RPN1可與Sec61/62/63轉位復合物相互作用，但Ufm1修飾是否影響內質網自噬受體Sec62的表達水平與活性，以及促進內質網自噬的具體機制有待研究。上述研究結果提示泛素化在內質網自噬中發揮了重要作用。

2 內質網自噬與疾病的關系研究進展

2.1 內質網自噬與糖尿病 最近一系列研究發現，內質網自噬參與了胰腺胰島部和外分泌部正常功能的維持。胰島素基因突變所致的青少年糖尿病(mutant INS-gene-induced diabetes of youth，MIDY)與胰腺胰島部功能障礙有關。突變產生的Akita胰島素原在內質網中形成聚合物并包被正常的胰島素原，阻止其從內質網中分泌。Cunningham等[40]發現，上調RTN3可促進Akita胰島素原的清除，從而保證內質網輸出正常胰島素原，具有潛在的治療價值。胰腺外分泌部內質網腔內蛋白聚集可導致未折疊蛋白反應過度激活及組織損傷，而未折疊蛋白反應可同時誘導CCPG1介導的內質網自噬，維持胰腺內質網蛋白質穩態。CCPG1敲除會導致小鼠胰腺外分泌部的粗面內質網過度膨脹，且腔內濃縮的包含物顆粒增多，炎性細胞浸潤增加，內質網應激分子BiP、Chop、Grp94和sXBP1的表達水平升高[25]。

2.2 內質網自噬與腎臟損傷 內質網自噬可介導碲化鎘引起的腎臟損傷。體內研究發現，小鼠靜脈注射碲化鎘后，腎臟是碲化鎘分布最多的器官之一，并出現功能障礙，且腎臟存在未折疊蛋白反應和FAM134B介導的內質網自噬。體外實驗發現，碲化鎘可破壞HEK細胞內質網的超微結構，使用抑制劑或siRNA阻斷未折疊蛋白反應可緩解碲化鎘觸發的內質網自噬。此外，抑制未折疊蛋白反應或FAM134B依賴性的內質網自噬可恢復HEK細胞的活力[41]。

2.3 內質網自噬與神經系統疾病 內質網自噬對于神經系統的發育和功能維持非常重要。神經細胞依賴自噬來控制蛋白的質量并清除應激的內質網。正常情況下，內質網自噬對神經細胞有保護作用，其缺陷會導致神經系統疾病。遺傳性感覺和自主神經病Ⅰ型(hereditary sensory and autonomic neuropathy type Ⅰ，HSANⅠ)患者存在ATL3突變(Y192C和P338R)，導致ATL3與GABARAP的相互作用受阻，引起內質網自噬缺陷[25]。C型尼曼-匹克氏病是一種致命的、進行性的神經退行性疾病，由NPC1突變(突變產物I1061T NPC1)導致的功能缺失引起，可能存在自噬功能障礙[42]。與野生型相比，NPC1突變小鼠FAM134B mRNA水平無顯著差異，但FAM134B由內質網轉移至自噬體，自噬溶酶體和溶酶體增多，表明尼曼-匹克病雖然自噬流量升高，但可能存在底物降解障礙[43]。在大鼠脊髓神經疼痛模型中，鞘內注射雷帕霉素可促進FAM134B和LC3的表達，增強內質網自噬，緩解內質網應激，減少caspase-3的表達，減輕神經疼痛；相反，鞘內注射自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)可使神經疼痛加重。缺乏有效的自噬時，胞質內有毒的蛋白聚集物可導致內質網應激水平升高，細胞凋亡增加[44]。

2.4 內質網自噬與腫瘤 內質網自噬可促進腫瘤的發展。在異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)突變的膠質瘤中，2-羥戊二酸(由IDH1突變產生)抑制了膠原-4-輔氨酰羥化酶的活性，導致錯誤折疊膠原Ⅳ在內質網中積累，觸發內質網應激，促進FAM134B的表達及其介導的內質網自噬，導致內質網面積減小。由于內質網是磷脂合成的位點，因此，內質網自噬可導致卵磷脂和腦磷脂合成減少。抑制內質網自噬可恢復IDH突變的神經膠質瘤細胞中的磷脂合成，觸發細胞凋亡，抑制腫瘤生長，延長IDH突變的神經膠質瘤小鼠的壽命[45]。

內質網自噬還可促進腫瘤細胞凋亡。對于惡性膠質母細胞瘤，洛哌丁胺可觸發轉錄因子ATF4及其他內質網應激標志物的表達上調，誘導FAM134B和TEX264介導的內質網自噬，引起自噬性細胞死亡[46]。內質網自噬亦可促進腫瘤耐藥。布吉他濱通過誘導持續的內質網應激促進結直腸癌細胞凋亡，具有顯著的抗癌作用。然而，布吉他濱在介導內質網應激的同時也可促進FAM134B介導的內質網自噬，作為對內質網應激的保護機制。聯合使用內質網自噬抑制劑3-MA/氯喹可增強布吉他濱對結直腸癌的抗腫瘤作用[47]。目前，腫瘤領域與內質網自噬相關的研究局限于膠質瘤、膠質母細胞瘤及結腸癌。內質網自噬在不同類型腫瘤中發揮不同的作用，但具體機制有待進一步研究，以實現腫瘤的靶向治療。

2.5 內質網自噬與微生物感染 內質網自噬與細菌、病毒感染有關系。固有感受器TMEM173/STING可檢測內在化的G+細菌產生的c-di-AMP，迅速調動相互依賴的細胞免疫反應，包括內質網應激、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)失活和內質網自噬。內質網自噬可恢復巨噬細胞穩態和促進Ⅰ型干擾素反應[48-49]。自噬在病毒感染中發揮雙重作用——抗病毒或促進病毒感染，這取決于病毒種類以及病毒的復制階段。在人類胎兒的神經干細胞中，Zika病毒可抑制Akt-mTOR信號通路，誘導自噬，促進病毒感染，抑制神經發生。自噬也具有抑制病毒復制的作用[50]。蟲媒病毒包括Dengue病毒和Zika病毒可利用內質網膜促進自身裝配及成熟，內質網膜的降解會限制蟲媒病毒的復制。BPIFB3缺失可促進FAM134B依賴的內質網自噬，導致內質網降解增加，抑制Dengue病毒和Zika病毒的復制[51-52]。然而多種蟲媒病毒，如Dengue病毒、Zika病毒和West Nile病毒可利用其NS2B3蛋白酶在RHD結構域直接剪切FAM134B，阻止富含內質網及病毒蛋白的自噬體的形成[53]。

3 總結與展望

內質網自噬通過溶酶體降解未折疊蛋白質、錯誤折疊蛋白質和應激的內質網，維持細胞穩態。目前已發現10種內質網自噬受體，然而，不同應激條件下激活的內質網自噬受體不同，新的內質網自噬受體也有待發現。內質網自噬的生理功能、分子調控機制及其與疾病的關系仍需進一步研究。雖然內質網自噬的研究仍處于新興階段，但其參與多種疾病的發生發展，有望成為新的治療靶點。