血液嗜堿性粒細胞CD16和CD32在慢性氣道炎癥性疾病中的表達及其臨床意義

吳久純，耿詩洋，谷芳秋，何韶衡，張慧云，劉敬禹*

1錦州醫科大學附屬第三醫院呼吸與危重癥醫學科，遼寧錦州 121001；2錦州醫科大學附屬第一醫院變態反應與臨床免疫研究中心，遼寧錦州 121001；3錦州醫科大學護理學院，遼寧錦州 121001

支氣管哮喘(簡稱哮喘)和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)都屬于慢性氣道炎癥性疾病，也是臨床上常見的呼吸系統疾病。流行病學研究顯示，哮喘與COPD的發病率分別為17.6%和47.1%，但哮喘合并COPD的發病率則高達35%并呈逐年上升趨勢[1]。全球哮喘防治倡議(global asthma initiative，GINA)/慢性阻塞性肺疾病全球倡議(global initiative on chronic obstructive pulmonary disease，GOLD) (2017版)指出，哮喘-慢性阻塞性肺疾病重疊(asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap，ACO)表現為氣道持續性氣流受限，同時表現出哮喘和COPD的癥狀，可能是由不同病理生理基礎導致的不同臨床表現的氣道炎癥反應[2]。截至目前，ACO的病因尚未明確，早期便有荷蘭假說、英國假說對ACO的發病機制做了詳盡闡述，但這些假說的有效性仍存在爭議[3]。遺傳、肺發育不全、病毒感染、氣道高反應性等可能是ACO的高危因素。起初，哮喘癥狀即反復發作的喘息、氣急是ACO的主要癥狀，而后隨即出現COPD癥狀，表明ACO的一般特征是先出現哮喘癥狀而后出現COPD癥狀[4]。哮喘多數是由過敏原引起的IgE介導的變態反應性疾病，哮喘晚期，嗜堿性粒細胞迅速滲入受影響的肺組織中，然后被內源性激動劑激活，從而釋放相關細胞因子及炎性介質[5]。嗜堿性粒細胞和組織中的肥大細胞是參與變態反應性疾病的核心效應細胞[6]，但嗜堿性粒細胞在健康人外周血中含量極低[7]，易被忽視。研究發現，人嗜堿性粒細胞的特異性表面標志物包括CD203c、CD13、CD63、CD164等，其在疾病發病過程中起著關鍵作用[7]。然而，目前對人嗜堿性粒細胞CD16和CD32在呼吸系統疾病中的作用研究甚少。本研究探討了血液嗜堿性粒細胞CD16和CD32在ACO、COPD中的表達及其臨床意義，以期為臨床尋找新的治療靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 PE標記小鼠抗人CCR3抗體、FITC標記小鼠抗人CD123抗體、PerCP標記小鼠抗人HLA-DR抗體、APC/Cy7標記小鼠抗人CD16抗體、APC標記小鼠抗人CD32抗體、APC/Cy7標記小鼠IgG1 κ同型抗體、APC標記小鼠IgG2b κ同型抗體、去死細胞染料、FcR受體阻斷劑、紅細胞裂解液購自美國Biolegend公司；人TNF-α ELISA試劑盒購自美國Invitrogen公司。FACS Verse流式細胞儀購自美國BD公司；水浴恒溫振蕩器購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 研究對象 選取2019年12月－2020年12月就診于錦州醫科大學附屬第三醫院的COPD、ACO患者以及招募的健康志愿者作為研究對象，分別設為COPD組、ACO組和健康對照組。研究對象納入標準：年齡≥18歲；至少1個月內未發生過呼吸道感染，未使用全身糖皮質激素、支氣管擴張劑、抗生素及免疫抑制劑。排除標準：病情較重，因呼吸衰竭等疾病無法完成肺功能檢測；患有肝炎、結核等傳染性疾病及其他嚴重全身性疾病。COPD診斷標準符合2017年GOLD指南[8]，即有長年咳嗽、咳痰及喘息等癥狀，吸煙、職業粉塵接觸等相關風險因素，肺功能提示吸入支氣管舒張劑后第1秒用力呼氣末容積(forced end-expiratory volume at 1 second，FEV1)/用力肺活量(forced vital capacity，FVC)固定比率＜0.7。ACO診斷標準參照2017年西班牙發布的COPD指南(Spanish COPD Guidelines，GesCOPD)[9]，符合COPD相關診斷標準且支氣管舒張試驗為陽性[10]，即有咳、痰、喘等相關呼吸道癥狀，肺功能提示吸入支氣管舒張劑后FEV1/FVC＜0.7、FEV1較用藥前增高≥12%且其絕對值增高≥200 ml。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究獲得錦州醫科大學附屬第三醫院倫理委員會審批(JYDSY-KXYJIEC-2020-012)。

1.3 資料收集 收集研究對象的性別、年齡、病史、發病年齡、體重指數(body mass index，BMI)及吸煙史等一般資料，并采集10 ml外周血于EDTA抗凝真空采血管中。

1.4 流式細胞儀檢測外周血嗜堿性粒細胞富集群中CD16和CD32的表達 取外周血2 ml，1500 r/min離心10 min，血漿用于ELISA檢測，然后用含2%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基補全，吹打混勻，取120 μl于流式管中，加入1 μl去死細胞染料及3 μl人FcR受體阻斷劑，室溫避光孵育15 min；加入5 μl FITC標記小鼠抗人CD123抗體(1:4)、PerCP標記小鼠抗人HLA-DR抗體(1:4)、PE標記小鼠抗人CCR3抗體(1:4)、APC/Cy7標記小鼠抗人CD16抗體(1:4)、APC標記小鼠抗人CD32抗體(1:4)，室溫避光孵育15 min；加入1.5 ml紅細胞裂解液吹打混勻，室溫避光孵育12 min；1200 r/min離心6 min，棄上清；加入1 ml PBS，用移液槍吹打混勻；1200 r/min離心6 min，棄上清，加入300 μl PBS，流式細胞儀上機檢測嗜堿性粒細胞富集群中CD16和CD32細胞的比例及平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)，采用Flowjo 10.0軟件分析數據。

1.5 ELISA檢測血漿中TNF-α含量 根據TNF-α ELISA試劑盒說明書步驟檢測血漿中TNF-α含量。

1.6 統計學處理 使用SPSS 13.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗或方差分析(F檢驗)或非參數Kruskal-WallisH分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗；計數資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組一般資料比較 共納入13名健康志愿者、11例COPD患者和28例ACO患者。三組性別、年齡、病史、發病年齡、BMI及吸煙史等一般資料比較，差異均無統計學意義(P＞0.05，表1)。

表1 三組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data among three groups

2.2 三組外周血嗜堿性粒細胞富集群中CD16和CD32的表達情況 采用3種方法標記嗜堿性粒細胞，分別檢測CD16和CD32在粒細胞群和單個核細胞群中的表達，結果顯示，三組外周血粒細胞群中3種方法標記的CD16+嗜堿性粒細胞比例差異無統計學意義(P＞0.05，圖1)。與健康對照組相比，ACO組、COPD組外周血單個核細胞群中CD16+CCR3+細胞比例分別增高2.18倍和1.68倍(Z=-2.998，P=0.002；Z=-2.637，P=0.007)，CD16+CD123+HLA-DR細胞比例分別增高1.13倍和0.96倍(Z=-3.026，P=0.002；Z=-2.868，P=0.003)，CD16+CCR3+CD123+HLADR-細胞比例分別增高3.67倍和2.26倍(Z=-3.278，P=0.001；Z=-2.521，P=0.011，圖1)。

圖1 三組不同標記方法下外周血粒細胞群和單個核細胞群中CD16+細胞比例Fig.1 Proportion of CD16+ cells in peripheral blood granulocyte population and mononuclear cell population in three groups with different labeling methods

與健康對照組相比，COPD組外周血粒細胞群中CD32+CCR3+細胞、CD32+CCR3+CD123+HLADR-細胞比例分別增高4.67倍和3.79%(Z=-3.187，P=0.001；Z=-2.498，P=0.011)，單個核細胞群中CD32+CD123+HLA-DR-細胞、CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細胞比例分別增高3.70%和3.33%(Z=-2.871，P=0.003；Z=-2.180，P=0.030)，ACO組外周血粒細胞群中CD32+CD123+HLA-DR-細胞和CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細胞比例分別下降18.57%和20.89%(Z=-2.311，P=0.019；Z=-2.144，P=0.031，圖2)。

圖2 三組不同標記方法下外周血粒細胞群和單個核細胞群中CD32+細胞比例Fig.2 Proportion of CD32+ cells in peripheral blood granulocyte population and mononuclear cell population in three groups with different labeling methods

2.3 三組外周血嗜堿性粒細胞中CD16和CD32 MFI比較 流式細胞儀檢測結果顯示，在粒細胞群和單個核細胞群中，COPD組3種標記方法標記的CD16和CD32 MFI與健康對照組相比，差異無統計學意義(P＞0.05，圖3－4)。ACO組外周血粒細胞群中CCR3+細胞和CCR3+CD123+HLA-DR-細胞的CD32 MFI分別較健康對照組降低30.7%和37.31%(Z=-2.718，P=0.006；Z=-1.975，P=0.047，圖4)。

圖3 三組不同標記方法下外周血單個核細胞群中嗜堿性粒細胞中CD16和CD32 MFIFig.3 MFI of basophil granulocyte CD16 and CD32 in peripheral blood mononuclear cell population of three groups with different labeling methods

圖4 三組不同標記方法下外周血粒細胞群中嗜堿性粒細胞中CD16和CD32 MFIFig.4 MFI of basophil granulocyte CD16 and CD32 in peripheral blood granulocytes population in three groups with different labeling methods

2.4 三組血漿TNF-α表達水平比較 ELISA檢測結果顯示，與健康對照組比較，ACO組血漿TNF-α表達水平增高2.02倍，差異有統計學意義(Z=-2.078，P=0.036)；COPD組與健康對照組血漿TNF-α表達水平差異無統計學意義(P＞0.05，圖5)。

圖5 三組血漿TNF-α表達水平比較Fig.5 Expression level of plasma TNF-α in ACO, COPD patients and healthy control subjects

3 討 論

嗜堿性粒細胞由骨髓造血多能干細胞分化而來，逐漸成熟后進入血液循環，雖然所占比例不到1%，但在過敏性疾病中發揮至關重要的作用[7]。據報道，嗜堿性粒細胞可以表達多種受體，如補體、白細胞介素受體、前列腺素(prostaglandin，PG)受體、趨化因子以及免疫球蛋白Fc受體[11]。但目前對于嗜堿性粒細胞表面CD16和CD32的表達情況了解較少。本研究采用CCR3+[12]、CD123+HLADR-[13]和CCR3+CD123+HLA-DR-[14]3種方法標記嗜堿性粒細胞：其中CCR3+CD123+HLA-DR-標記的細胞為嗜堿性粒細胞[14]；CCR3+在粒細胞群中標記嗜堿性粒細胞，在單個核細胞群中可標記少部分淋巴細胞[15]；CD123+HLA-DR-在單個核細胞群中僅標記嗜堿性粒細胞[16]，但在粒細胞群中可標記髓源性抑制細胞(MDSCs)[17]。最近研究發現，CD16是由兩個同源亞單位ζ和γ通過二硫鍵連接形成的二聚體，與高親和力的CD16受體特異性結合，從而介導炎癥反應，清除免疫復合物[18]。本研究結果顯示，ACO、COPD患者血液中CCR3+、CD123+HLA-DR-、CCR3+CD123+HLA-DR-單個核細胞群中CD16+細胞比例升高，而在粒細胞群中3種方法標記的CD16+細胞比例無明顯差異。ACO、COPD患者單個核細胞群中CD16+CCR3+細胞比例分別增高2.18倍和1.68倍，可能源于淋巴細胞(而非嗜堿性粒細胞)CD16表達升高，但CD16+CD123+HLADR-和CD16+CCR3+CD123+HLA-DR-細胞比例明顯升高，表明ACO、COPD兩種疾病很可能通過嗜堿性粒細胞表達CD16而誘導發病，提示嗜堿性粒細胞可能是CD16拮抗劑發揮作用的靶細胞，這為后續ACO、COPD的臨床治療提供了新的方向。

嗜堿性粒細胞源的CD32是一種低親和力的IgG受體(FcγRⅡ)，包括FcγRⅡA、FcγRⅡB和FcγRⅡC 3個亞型，其中FcγRⅡA、FcγRⅡC為激活受體，FcγRⅡB為抑制受體[19]，可以抑制IgE介導的過敏反應[20]。本研究結果顯示，COPD患者血液中CD32+CD123+HLA-DR-細胞、CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細胞比例在單個核細胞群中增高，CD32+CCR3+細胞、CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細胞比例在粒細胞群中增高；ACO患者血液中CD32+CD123+HLA-DR-細胞和CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細胞比例在粒細胞群中降低，表明CD32在ACO、COPD中差異性表達，考慮原因為嗜堿性粒細胞可能通過表達不同亞型的CD32而致病。在粒細胞群和單個核細胞群中，COPD患者3種方法標記的嗜堿性粒細胞CD32 MFI與健康對照組比較無明顯差異，而ACO患者血液粒細胞群中CCR3+細胞和CCR3+CD123+HLA-DR-細胞的CD32 MFI降低，進一步證實嗜堿性粒細胞CD32在不同疾病中的表達不同。因此，檢測血液嗜堿性粒細胞CD32的表達可能有助于ACO、COPD的鑒別診斷，利于指導臨床治療。此外，ACO起初出現哮喘癥狀，而哮喘癥狀多因接觸過敏原、冷空氣后發生變態反應所致，考慮嗜堿性粒細胞通過表達CD32可能抑制該過敏反應，提示哮喘可能在ACO中占主導作用，本研究結果有助于理解嗜堿性粒細胞參與ACO、COPD發病的機制，進一步研究可建立小鼠模型探討具體致病通路。

TNF-α是一種可以對炎癥、感染和損傷迅速做出反應的細胞因子，早期參與細胞因子網絡的啟動進程，產生炎癥反應的級聯放大效應[21]。遲春天等[22]的研究發現，TNF-α是預測慢性炎癥性疾病嚴重程度的潛在標志物，高水平的TNF-α可導致體內炎癥加劇。ACO發病可能是由氣道炎癥反應、氣道高反應性及氣道結構破壞等多種因素共同導致的，其主要表現是同時具有COPD和哮喘相關的特征，但ACO患者較單純COPD、哮喘患者臨床癥狀重、合并癥多且急性加重頻繁[23]。本研究結果顯示，ACO患者血漿中TNF-α水平明顯升高，考慮ACO相關臨床表現與血漿中TNF-α水平升高有關，從而導致機體發生嚴重的炎癥反應，這對ACO的早期診斷與治療具有重要意義。

本研究存在一定的局限性：受新冠肺炎疫情的影響，樣本收集困難，實驗進展緩慢，研究對象相對較少，研究結果有待進一步擴大樣本量加以驗證；CD16和CD32參與ACO、COPD發病的機制尚不明確，后續需建立動物模型進行深入研究。

綜上所述，本研究結果表明，嗜堿性粒細胞源的CD16和CD32以及TNF-α等生物標志物可能在ACO、COPD發病中起著重要作用，且CD16和CD32可作為預防和治療ACO、COPD的重要靶點，為慢性氣道炎癥性疾病的預防與治療提供了新方向。