lncRNA NEAT1激活PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

翟志恒，田楊，周玉妮，宋玉成

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院濟(jì)寧市精神病防治院，山東濟(jì)寧 272051

阿爾茨海默病(Alzheimer‘s disease，AD)，又稱老年性癡呆，是一種不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，臨床主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙等神經(jīng)精神癥狀，嚴(yán)重影響患者的社交、工作與生活功能[2]。目前，AD的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，尚無(wú)有效的治療方法[3]。因此，開(kāi)發(fā)潛在的精準(zhǔn)AD生物標(biāo)志物具有重要意義[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在神經(jīng)退行性疾病中的作用近年逐漸受到重視[5]。核富集轉(zhuǎn)錄本1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)是一種廣泛表達(dá)的lncRNA，在神經(jīng)退行性疾病中的表達(dá)發(fā)生了明顯變化[6]。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細(xì)胞中，NEAT1可以激活pro-caspase-1，促進(jìn)炎性小體NLRP3聚集，穩(wěn)定cleaved-caspase-1，并提高caspase-1的活性。本研究探討了lncRNA NEAT1激活PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)新的AD生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院；胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、青/鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Invigentech公司；Lipofectamine 2000、質(zhì)粒孵育培養(yǎng)基Opti-MEM及Aβ25-35購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒、TB Green Premix EXTaqⅡ試劑盒、CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗以及羊抗兔二抗購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；pcDNA3.1 lncRNA NEAT1質(zhì)粒及相應(yīng)空載體購(gòu)自廣州吉賽生物科技股份有限公司；小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)及相應(yīng)陰性對(duì)照(siRNA NC，si-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-18和腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；PI3K通路抑制劑LY294002(HY-10108)購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司。酶標(biāo)儀(Imark)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7700)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)購(gòu)自美國(guó)BD公司；Western blotting檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 AD細(xì)胞模型構(gòu)建 PC12細(xì)胞于含0.1 ml/ml胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，加入不同濃度的Aβ25-35(0、5、10、20 μmol/L)作用24 h，建立AD細(xì)胞模型。考慮到Aβ25-35對(duì)P12細(xì)胞毒性的影響，選擇5 μmol/L Aβ25-35處理PC12細(xì)胞，并于24、48、72 h檢測(cè)lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平按照Trizol說(shuō)明書步驟提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，測(cè)定cDNA濃度，利用TB Green Premix EXTaqⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μl)：1 μl cDNA、上下游引物各0.5 μl、10 μl SYBR Premix ExTaq、8 μl ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。lncRNA NEAT1：上游引物5‘-GGCAGGTCTAGTTTGGGCAT-3‘，下游引物5‘-CCTCATCCCTCCCAGTACCA-3‘；GAPDH：上游引物5‘-CCCTTCATTGACCTCAACTACA-3‘，下游引物5‘-ATGACAAGCTTCCCGTTCTC-3‘。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA NEAT1的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4 lncRNA NEAT1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將5 μl Lipofectamine 2000加入250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫靜置5 min；分別取5 μg siRNA-lncRNA (si-lncRNA)NEAT1、si-NC、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-lncRNA NEAT1加入250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫靜置5 min；將含Lipofectamine 2000的Opti-MEM培養(yǎng)基分別與含si-lncRNA NEAT1、si-NC、pcDNA3.1-NC或pcDNA3.1-lncRNA NEAT1的Opti-MEM培養(yǎng)基混勻，室溫靜置25 min。取PC12細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置對(duì)照組、敲降lncRNA NEAT1組、si-NC組、空載體組及過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組。敲降lncRNA NEAT1組、si-NC組、空載體組及過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組每孔加入質(zhì)粒混合液混勻并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染8 h后更換為新鮮常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后分別加入20 μmol/L Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換為新鮮常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；對(duì)照組不做處理，培養(yǎng)方法同其余各組。

1.4.1 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平按照1.3中的步驟檢測(cè)各組lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集各組細(xì)胞，接種于96孔板中(5×103個(gè)/孔)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的吸光度(A450)值。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 收集各組細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化，1000 r/min離心6 min，棄上清；用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并用無(wú)水乙醇在-20 ℃條件下過(guò)夜固定細(xì)胞；去除固定液，用PBS重懸細(xì)胞，1000×g離心5 min，重復(fù)2次；PBS清洗細(xì)胞，用含RNase A的溶液消化1 h；加入PI溶液終止消化并避光染色8 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.4.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中炎性因子水平 使用IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的水平。將各組細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)48 h，洗滌4次，加入生物素標(biāo)記的抗體工作液、酶偶聯(lián)物，室溫孵育30 min；洗滌，加入顯色底物顯色，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的吸光度(A450)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5 Western blotting檢測(cè)p-PI3K、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)水平 收集對(duì)照組、空載體組及過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組細(xì)胞，接種于96孔板中(5×103個(gè)/孔)，加入RIPA裂解液，將96孔板于0 ℃振蕩30 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取25 μg蛋白上樣，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(90 V 30 min，120 V至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部)，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗兔抗p-PI3K(1:1000)、PI3K(1:1000)、Akt(1:1000)、p-Akt(1:1000)及內(nèi)參GAPDH(1:1000)，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:10 000)，室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，用ECL顯色液顯色，ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取PC12細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種于無(wú)菌96孔板中，設(shè)置對(duì)照組、si-NC組、敲降lncRNA NEAT1組、空載體組、過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組及過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1+LY294002組，對(duì)照組、si-NC組、敲降lncRNA NEAT1組、空載體組、過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組處理同1.4，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1+LY294002組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-lncRNA NEAT1后，加入10 μmol/L PI3K通路抑制劑LY294002處理。培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化并于室溫下孵育，制備細(xì)胞懸浮液。取5×104個(gè)細(xì)胞，加入緩沖液懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至流式管中，然后加入5 μl Annexin V-FITC混勻，于室溫避光條件下孵育15 min，上機(jī)前5 min加入5 μl PI進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布者以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，0、5、10、20 μmol/L Aβ25-35作用24 h后，PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平降低(依次為0.90±0.05、0.67±0.07、0.53±0.03、0.34±0.09)，且呈濃度依賴性(F=110.51，P=0.001，圖1A)。與對(duì)照組(0.99±0.10)相比，5 μmol/L Aβ25-35作用PC12細(xì)胞24、48、72 h后，lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低(依次為0.49±0.05、0.27±0.05、0.18±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=109.42，P=0.002，圖1B)。根據(jù)圖1A的結(jié)果，20 μmol/L Aβ25-35處理24 h后，lncRNA NEAT1的表達(dá)最低，建模效果最好。因此，選擇20 μmol/L Aβ25-35進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 Relative expression level of lncRNA NEAT1 in PC12 cells induced by Aβ25-35

2.2 lncRNA NEAT1載體構(gòu)建效果 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組(0.93±0.09)相比，空載體組(0.54±0.12)與si-NC組(0.52±0.09)lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P=0.008，P=0.001)；與空載體組相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平增高(2.21±0.16，P=0.001)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)水平降低(0.23±0.02，P=0.000)，表明lncRNA NEAT1的過(guò)表達(dá)和敲降載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 lncRNA NEAT1載體構(gòu)建效果(qRT-PCR)Fig.2 Construction effect of lncRNA NEAT1 vector detected by qRT-PCR

2.3 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞活力的影響CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(116.33%±5.51%)相比，Aβ25-35刺激后，空載體組(53.85%±5.57%)與si-NC組(55.18%±8.50%)細(xì)胞增殖率明顯降低(P=0.000，P=0.000)；與空載體組相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組細(xì)胞增殖率明顯增高(142.85%±5.00%，P=0.013)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組細(xì)胞增殖率明顯降低(21.18%±4.93%，P=0.003，圖3)。

圖3 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of lncRNA NEAT1 on cell viability of AD model cells

2.4 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(4.50%±0.10%)相比，Aβ25-35刺激后，空載體組(8.10%±0.10%)與si-NC組(7.40%±0.26%)細(xì)胞凋亡率明顯升高(P=0.001，P=0.001)；與空載體組相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組細(xì)胞凋亡率降低(5.07%±0.15%，P=0.012)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組細(xì)胞凋亡率明顯升高(14.70%±0.20%，P=0.000，圖4)。

圖4 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of lncRNA NEAT1 on apoptosis of AD model cells

2.5 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(G1期：60.15%±1.00%；G2期：6.56%±0.95%)相比，Aβ25-35刺激后，空載體組(G1期：61.81%±1.53%；G2期：9.81%±1.53%)與si-NC組(G1期：60.15%±4.58%；G2期：10.70%±0.73%)G1和G2期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與對(duì)照組和空載體組相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組G1期(52.15%±1.00%)細(xì)胞比例明顯降低(P=0.001，P=0.003)，G2期(21.15%±1.00%)細(xì)胞比例明顯升高(P=0.000，P=0.001)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組G1期(68.81%±1.53%)細(xì)胞比例明顯升高(P=0.012)，G2期(5.48%±1.53%)細(xì)胞比例明顯降低(P=0.021，圖5)。

圖5 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of lncRNA NEAT1 on cell cycle of AD model cells

2.6 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞上清中炎性因子水平的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Aβ25-35刺激后，空載體組和si-NC組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯升高(P＜0.05)；與空載體組相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯降低(P＜0.05)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯升高(P＜0.05，表1)。

表1 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞上清中炎性因子水平的影響(pg/ml，，n=3)Tab.1 Effect of lncRNA NEAT1 on the inflammatory factor levels of AD model cells (pg/ml, , n=3)

表1 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞上清中炎性因子水平的影響(pg/ml，，n=3)Tab.1 Effect of lncRNA NEAT1 on the inflammatory factor levels of AD model cells (pg/ml, , n=3)

AD. 阿爾茨海默病；IL. 白細(xì)胞介素；TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；與對(duì)照組比較，(1)P＜0.05；與空載體組比較，(2)P＜0.05；與si-NC組比較，(3)P＜0.05。

組別 IL-1β IL-6 IL-18 TNF-α對(duì)照組 42.45±1.98 14.54±0.68 54.76±2.11 213.59±11.58空載體組 117.19±4.97(1) 83.91±4.87(1) 187.61±5.64(1) 529.67±22.30(1)過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組 76.23±5.78(2) 60.31±4.45(2) 127.45±5.71(2) 342.33±9.29(2)si-NC組 117.00±5.57(1) 85.00±3.00(1) 182.67±6.81(1) 550.00±39.36(1)敲降lncRNA NEAT1組 159.67±15.50(3) 118.33±7.64(3) 215.00±5.00(3) 734.67±20.53(3)

2.7 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路活性的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Aβ25-35刺激后，空載體組信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-Akt相對(duì)表達(dá)水平明顯下降(p-PI3K：0.15±0.02vs. 1.02±0.05，P=0.005；p-Akt：0.11±0.04vs. 0.95±0.07，P=0.000)；與空載體組相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組(p-PI3K：0.86±0.05；p-Akt：0.86±0.06)信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-Akt相對(duì)表達(dá)水平明顯增高(P=0.003，P=0.000，圖6)。

圖6 lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路活性的影響Fig.6 Effect of lncRNA NEAT1 on the PI3K/Akt signaling pathway activity of AD model cells

2.8 通路抑制劑LY294002對(duì)AD模型細(xì)胞凋亡的影響 為了證實(shí)PI3K/Akt通路與AD模型細(xì)胞凋亡的關(guān)系，向Aβ25-35處理的PC12細(xì)胞中分別加入pcDNA3.1-lncRNA NEAT1與pcDNA3.1-lncRNA NEAT1+LY294002，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AD模型細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Aβ25-35刺激后，空載體組細(xì)胞凋亡率明顯升高(8.20%±0.26%vs. 4.4%±0.21%，P=0.002)；與空載體組相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組細(xì)胞凋亡率明顯降低(5.13%±0.21%，P=0.011)；與過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1組相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1+LY294002組細(xì)胞凋亡率明顯升高(9.00%±0.10%，P=0.004，圖7)。

圖7 PI3K/Akt通路抑制劑LY294002對(duì)AD模型細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effect of PI3K/Akt pathway inhibitor LY294002 on apoptosis of AD model cells

3 討 論

AD是一種不可逆的進(jìn)行性、持續(xù)性神經(jīng)退行性疾病，影響大腦皮質(zhì)和海馬的廣泛區(qū)域，也是最常見(jiàn)的癡呆類型(60%～80%)[8]。Aβ過(guò)量產(chǎn)生被認(rèn)為是AD患者突觸和神經(jīng)元丟失的主要原因。AD的病因非常復(fù)雜，目前其分子病理機(jī)制尚不清楚[9]。為此，本研究建立了體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，為lncRNA NEAT1抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性提供了理論依據(jù)。

lncRNA NEAT1的表達(dá)變化與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)上調(diào)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF9)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞(OC)增殖和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的血管生成[10]。lncRNA NEAT1與細(xì)胞凋亡也密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除lncRNA NEAT1可顯著抑制肝癌細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[11]；在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)中，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1可促進(jìn)WI-38細(xì)胞凋亡[12]。此外，敲低lncRNA NEAT1可減輕腦缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡[13]；下調(diào)lncRNA NEAT1可抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1在Aβ25-35刺激后的PC12細(xì)胞中呈低表達(dá)，且過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1后，AD模型細(xì)胞凋亡率明顯降低，而敲降lncRNA NEAT1的表達(dá)時(shí)，AD模型細(xì)胞凋亡率升高。另有研究發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA NEAT1可導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)細(xì)胞周期發(fā)生停滯，阻止視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1可促進(jìn)AD模型細(xì)胞由G1期快速進(jìn)入G2期，激發(fā)了細(xì)胞周期的進(jìn)展；而敲降lncRNA NEAT1時(shí)，G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，G2期細(xì)胞比例明顯降低，表明敲降lncRNA NEAT1可使更多的AD模型細(xì)胞停留在G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入G2期，造成了細(xì)胞周期的停滯。

已知lncRNA NEAT1可調(diào)控AD細(xì)胞的增殖和凋亡，但其具體作用機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，在HeLa細(xì)胞中，敲降lncRNA NEAT1會(huì)抑制p-Akt、p-PI3K的表達(dá)[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1可通過(guò)影響miR-211/PI3K/Akt軸調(diào)節(jié)膿毒癥的炎癥反應(yīng)[17]。由此可見(jiàn)，在疾病發(fā)展過(guò)程中，lncRNA NEAT1與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA NEAT1對(duì)AD模型細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，本研究將lncRNA NEAT1進(jìn)行高表達(dá)處理，利用Western blotting檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1過(guò)表達(dá)可增加AD模型細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)，抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而加入PI3K通路抑制劑后則可逆轉(zhuǎn)上述效果，證實(shí)lncRNA NEAT1可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的活性而影響AD模型細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Aβ25-35刺激后，PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)明顯降低；而過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1可明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，lncRNA NEAT1可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路而激活A(yù)D模型細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AD的進(jìn)展。但該結(jié)論未在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，后續(xù)將建立AD小鼠模型，以進(jìn)一步探索lncRNA NEAT1對(duì)AD發(fā)生發(fā)展的影響。