AMPK在心肌纖維化相關疾病中的作用及機制研究進展

李晨霏，樊迪，楊政，唐其柱

武漢大學人民醫院心血管內科/代謝與相關慢病湖北省重點實驗室，武漢 430060

心肌纖維化指細胞外基質生成與降解失衡，間質膠原生成過多且分布異常，是多種心血管疾病的共同病理基礎，與心肌重構、缺血再灌注等多種病理變化相關[1-2]。臨床現有的治療手段并不能阻斷或逆轉心肌纖維化的進展。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在機體內廣泛表達且高度保守，被稱為能量代謝的開關，且與多種疾病過程相關[3-4]。目前，AMPK與糖尿病、肥胖、癌癥等的關系已被廣泛研究。

AMPK是一種三聚體復合物，包括1個催化亞基α和兩個調節亞基β、γ，每個亞基均有不同基因編碼的亞型，不同亞型的分布具有一定的組織特異性。AMPK在很多生理和病理條件下均可被激活，最常見的方式為變構激活，呈能量相關性，即當細胞內的ATP減少時，AMP隨之升高并與AMPK上游位點結合，使AMPK三聚體結構改變，產生激活效應。激活后的AMPK進一步磷酸化下游靶點，直接或間接地調節限速酶、轉錄因子、生長因子等的活性，進而參與到代謝等生命活動的調控中。越來越多的證據顯示，AMPK在心肌纖維化中也扮演了重要角色，AMPK可通過調節細胞自噬、抑制氧化應激、改善內質網應激等多種途徑減輕細胞損傷，發揮抗纖維化作用，同時，AMPK還可激活或抑制其他信號分子，起到抑制肌成纖維細胞分化、改善心功能等作用[5-9]，因此，深入研究AMPK在心肌纖維化中的作用就顯得非常重要。

近年的研究表明，AMPK也參與了心肌纖維化的發生發展過程[5]，因此，干預AMPK信號通路對心肌纖維化的防治提供了新的思路。本文圍繞AMPK在心肌纖維化相關疾病中的作用、與纖維化信號通路的交叉機制及臨床藥物治療的研究進展進行綜述，旨在為心肌纖維化相關疾病的治療提供新的思路。

1 AMPK與心肌纖維化疾病模型

1.1 壓力負荷誘導的心力衰竭 在長期應激狀態下，心臟各信號通路與基因表達之間的協調變化可維持正常的心臟功能，包括AMPK的激活。在左心室壓力過載之前AMPK的短暫激活可減少不良重塑并保留左心室功能[10]。有研究對野生型和AMPK基因敲除型小鼠行主動脈弓縮窄術(TAC)后發現，AMPK缺失小鼠的心臟明顯增大，心功能明顯受損，提示AMPK可能對壓力超載誘導的心肌肥厚具有保護作用[11]。在此過程中，可能還涉及AMPK與其他信號的相互作用，如PKD2L1缺陷可通過抑制AMPK活性，增加p300介導的鈉鈣交換體1啟動子上組蛋白3賴氨酸27的乙酰化，導致NCX1過表達和線粒體Ca2+超載，從而加重病理性心肌肥厚[12]。此外，Alesutan等[13]在對AMPK亞型進行研究時發現，AMPK α2激活后對衰竭心臟具有保護作用，AMPK α2型缺陷小鼠在TAC后表現出能量代謝相關基因表達功能障礙，使心肌重構加劇；而當壓力過載后，AMPK活性增強，但主要表現為AMPK α1亞型的表達升高，而非AMPK α2的減少，因此AMPK α1可能在此心臟損傷模型中起著更重要的作用。

1.2 肥厚型心肌病(HCM) HCM在人群中的患病率約為0.2%，是常見的遺傳性心肌病。左室舒張功能障礙是HCM最重要的病理生理改變，可致患者出現活動時胸悶、氣促等癥狀，甚至發生惡性心律失常、猝死等終點事件。有研究發現，AMPK可提高心肌肥厚小鼠的射血分數，降低心肌細胞的蛋白合成率，并提出AMPK激活后可通過SIRT1信號通路來調控心肌能量代謝，進而抑制心肌肥厚[14]。另一項研究表明，SIRT2的表達和活化在心肌肥厚期間降低，而SIRT2缺乏可加重老年小鼠的心肌肥厚，并降低心臟射血分數；進一步研究發現，SIRT2通過去乙酰化激酶LKB1來維持AMPK信號的激活，進而促進SIRT2在心肌細胞肥大過程中的保護作用[15]。AMPK還可通過激活SIRT3抑制氧化應激引起的心肌肥厚，并改善心功能障礙[16]。此外，近年來關于自噬的研究顯示，自噬在心肌肥厚中發揮雙重作用，適當的自噬是一種適應性的保護反應，而失去平衡后的過度自噬則會產生負面影響，AMPK可通過抑制mTORC1信號通路而增強自噬[6]。但目前尚不明確是否可利用AMPK來調控自噬的平衡。

1.3 缺血性心肌病 在心肌缺血期間，AMPK的激活是一種重要的心肌細胞應激適應性反應，其激活調節涉及多個方面，包括代謝調節、能量穩態和細胞自噬等。當心肌發生缺血時，AMP生成增加，激活AMPK，進而使激活的AMPK通過刺激葡萄糖攝取和無氧糖酵解來促進葡萄糖的利用，這是在無氧條件下產生ATP的唯一途徑，通過糖酵解產生的ATP對維持細胞功能和膜離子梯度至關重要。同時，AMPK可誘導心肌細胞自噬，清除損傷的細胞器[17]。在應激情況下，AMPK轉運進入細胞核，進而抑制核糖體RNA(rRNA)的轉錄及核糖體的生物合成，從而改善內質網應激和細胞死亡[7]。還有研究者觀察到在氧糖剝奪的情況下，內皮細胞同時發生了細胞凋亡和自噬誘導[8]。因此，尚不清楚當缺血再灌注發生時AMPK介導的細胞自噬是促進還是抑制細胞死亡。到目前為止，AMPK在細胞自噬及凋亡中的矛盾作用已被多次報道與探討。此外，Quan等[18]發現年齡也是一個影響因素，與青壯年心臟相比，老齡心臟在缺血應激情況下，AMPK激活的保護作用明顯受損，可能的原因是Sesn2作為缺血誘導的支架蛋白與AMPK上游激酶LKB1相互作用，進而啟動AMPK磷酸化，然而，在衰老過程中LKB1與Sesn2-AMPK復合物的相互作用受損，最終表現出與年齡相關的現象。

有研究發現，當再灌注發生、氧輸送恢復時，AMPK會加速脂肪酸氧化，過多的脂肪酸氧化可能會減弱葡萄糖氧化，導致在葡萄糖攝取和糖酵解增加的情況下乳酸產量增加，這在一定程度上增加了細胞內酸中毒的風險，導致有害的鈣超載[19]。但現有的研究無法推斷是否一定發生鈣超載及其嚴重程度，而更多的觀點認為，AMPK在缺血再灌注過程中扮演的角色利大于弊。因此，AMPK在缺血時對心肌的保護作用引起了廣泛的關注。近年來，針對這方面的治療研究正在成為熱點。如褪黑素可通過減少線粒體裂變，重新激活SIRT6和AMPKPGC-1α-AKT信號傳導通路，增強線粒體的合成，進而抑制糖尿病心肌病的發展及隨后的心肌缺血/再灌注損傷[20]；曲美他嗪可通過將再灌注過程中的脂肪酸氧化轉化為葡萄糖氧化，調節底物代謝，從而改變AMP/ATP比值，觸發AMPK信號級聯，導致缺血再灌注時心肌氧化應激的降低，同樣有助于保護心臟免受缺血/再灌注損傷[21]；而鳶尾素可通過AMPK途徑減輕糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷，改善線粒體功能，抑制線粒體凋亡[9]。

1.4 糖尿病心肌病 心肌纖維化是糖尿病患者發生心肌重構的一個重要標志。糖尿病心肌病是一種病理性描述，最初表現為心臟僵硬、心肌纖維化、心室肥厚和重塑，進一步發展則出現舒張及收縮功能障礙，最終導致心力衰竭的發生[22]。

有研究對糖尿病模型動物心臟進行解剖，并采用非侵入性T1mapping對糖尿病患者心臟進行檢查，均發現了心肌纖維化，提示在人和動物的糖尿病心肌病中，纖維化為共同的病理改變[23]。有研究通過小鼠實驗發現，在心臟中AMPK可能是線粒體相關內質網膜(MAM)的主要調節因子，血糖過高會抑制AMPK，啟動Fundc1介導的MAM形成、線粒體功能障礙和心肌病變；相反，心肌細胞中持續激活的AMPK可防止高糖誘導的MAM形成、線粒體Ca2+增加和線粒體功能障礙，提示AMPK誘導的Fundc1抑制是治療糖尿病心肌病的有效靶點[24]。此外，AMPK也參與了其他代謝反應的調節。AMPK激活在哺乳動物心臟脂質代謝的調節中發揮了重要作用。有研究發現，磷酸化AMPK可通過調控限速酶肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ(CPTⅠ)，調節脂肪酸進入線粒體進行脂肪酸氧化的步驟[25]。還有研究發現，在高脂飲食喂養的肥胖小鼠模型中，激活AMPK對肥胖和相關代謝功能障礙具有保護作用。脂肪細胞AMPKα的消融則會損害在寒冷和β-腎上腺素能刺激條件下的適應性產熱和能量消耗，從而誘導高脂血癥的發生，最終導致肥胖和代謝功能障礙[26]。

AMPK正逐漸成為治療糖尿病心肌病和其他代謝疾病的靶點，為這類疾病的治療提供了新思路，如部分抗糖尿病藥物可通過激活心肌AMPK磷酸化來減輕心肌纖維化。

2 AMPK與纖維化信號通路的交叉作用

2.1 AMPK與轉化生長因子β(TGF-β) TGF-β作為細胞超家族的一員，廣泛分布在人體各組織中。目前已發現5個亞型，其中活性最強、表達最多的是TGF-β1。有研究表明，TGF-β參與了多種纖維化疾病的發生發展，可促進心肌成纖維細胞的生成，是調節心肌纖維化的重要因子之一[27]。

Juban等[28]構建了肌營養不良模型，通過免疫熒光等方法，發現此種環境可刺激促炎性巨噬細胞分泌更多的TGF-β，直接作用于成纖維細胞，進而促進纖維化；而在給予AMPK激動劑處理后，TGF-β表達被抑制，且觀察到肌肉壞死和纖維化區域減少，提示在纖維化的肌肉中，AMPK可通過結合蛋白LTBP4而減少LTBP4的生成，而抑制LTBP4則可使TGF-β分泌減少。Pan等[29]用二甲雙胍處理氣道平滑肌細胞6 h后，通過酶聯免疫吸附實驗檢測出AMPK磷酸化水平明顯升高，同時TGF-β誘導的細胞增殖水平降低，進一步沉默AMPKα2后發現，AMPK活性降低，二甲雙胍對TGF-β的作用也減弱，提示AMPK參與介導了此反應。接著，Pan等[29]重復上述實驗思路，利用蛋白定量的方法分別分析Smad2/3、miR-206、HDAC4、cyclin D1的變化，發現miR-206、HDAC4、cyclin D1蛋白參與了TGF-β誘導的脂肪間充質干細胞增殖，而AMPK參與介導了這一增殖過程，其中，HDAC4磷酸化和活化發揮了較為重要的作用。此外，CTRP6——一種在心肌梗死細胞中表達并可改善心肌梗死后心功能、減輕心肌纖維化的信號分子，被證實是通過AMPK抑制TGF-β誘導的肌成纖維細胞分化及心肌成纖維細胞遷移來實現保護作用的[30]。

2.2 AMPK與SIRT Sirtuins家族是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴的組蛋白去乙酰化酶，廣泛分布在人體各組織中，參與調節細胞能量代謝、細胞凋亡及衰老等多種過程。既往研究發現，Sirt3基因敲除小鼠更易發生心肌纖維化、心肌肥厚及心功能降低，而AMPK可能通過多種途徑與Sirt3發生關聯，共同作用于心肌纖維化的發生發展[31]。

在以脂多糖(LPS)誘導的膿毒癥心肌細胞模型中，通過RNA提取和對TPS、TR90等數據的分析，發現AMPK和Sirt3對LPS引起的心肌收縮舒張功能降低均有逆轉效果[31]。為探究二者之間的關聯，進一步將AMPK抑制劑CC添加到Sirt3處理的心肌細胞中，并檢測線粒體電子傳遞鏈復合物和活性氧活性，結果發現線粒體是連接二者作用的關鍵，即Sirt3可提高線粒體的活性，而這一過程需要AMPK介導，從而發揮心肌保護作用[31]。此外，AMPK/Sirt3信號通路可在多種情況下被激活。Xu等[32]用腹主動脈束帶法構建心肌肥厚模型，測定AMPK下游靶點乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化水平，并通過siRNA轉染來抑制Sirt3的表達水平，發現膽堿可激活AMPK/Sirt3信號通路以減輕心肌肥厚和心肌纖維化程度。而在通過腺病毒介導的Mfn2過表達實驗中發現，Mfn2可通過增強線粒體自噬與融合、抑制線粒體凋亡來激活AMPK/Sirt3信號通路，進而消除炎癥介導的線粒體損傷，在缺血再灌注中發揮心臟保護作用[33]。這些研究提示，上述不同物質對AMPK/Sirt3信號通路的激活，均可對心功能產生保護作用，未來可成為心血管疾病治療的靶點。

2.3 AMPK與腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS) RAS自發現以來一直是心血管領域最重要的治療靶點之一，是一類具有極強的縮血管和刺激腎上腺皮質分泌醛固酮等作用的肽類物質，包括腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉換酶、血管緊張素(Ang)Ⅰ、Ang Ⅱ等。當腎血流量減少時，會使腎素釋放增加，進而導致Ang Ⅱ分泌增多，刺激心肌成纖維細胞增殖及膠原蛋白的合成與沉積，誘導心肌纖維化。

Kr?ller-Sch?n等[34]用TekCre+或Cadh5Cre+小鼠和α1AMPKflox/flox小鼠培育出血管內皮特異性AMPK缺失的小鼠品系，注射Ang Ⅱ[0.5 mg/(kg.d)，持續7 d]，結果顯示，野生型小鼠內皮僅出現輕度功能障礙，而AMPK敲除小鼠的內皮功能障礙明顯加重，波譜測定結果提示可能與AMPK缺失引起的主動脈一氧化氮(NO)表達下降、氧化應激增加有關。同時，AMPK缺失小鼠也可通過上調內皮黏附分子來促進炎性細胞向血管壁集中，加重血管壁損害。此外，該研究還著重觀察了誘導血紅素加氧酶-1(HO-1)的變化，發現其參與了應激反應，可保護細胞免受氧化損傷；在Ang Ⅱ處理后，AMPK敲除小鼠的內皮細胞和主動脈組織中的HO-1誘導幾乎被完全鈍化。另有研究發現，Ang Ⅱ注射[0.8 μg/(g.d)]14 d后，氧化應激的3個標志物p-eIF2α、XBP1s、KDEL表達水平均明顯升高，而二甲雙胍可消除Ang Ⅱ引起的氧化應激，這一消除現象更多依賴于AMPKα2，與AMPKα1比較，AMPKα2敲除后的氧化應激反應更明顯，且這一過程需要磷酸受鈣蛋白(PLB)磷酸化的參與[35]。

3 AMPK與藥物治療

3.1 二甲雙胍 二甲雙胍作為治療2型糖尿病的一線用藥，已經得到廣泛關注和研究，近年來，部分學者發現了二甲雙胍在其他領域的功效，包括本文所探討的心肌纖維化相關類疾病。二甲雙胍于2001年首次被發現可以激動AMPK，由此展開了一系列相關的研究[36]。

對于進行冠狀動脈搭橋術的糖尿病初期患者，術后12個月的追蹤隨訪發現，術前曾長期使用二甲雙胍的患者較未曾使用的患者心血管不良事件發生率明顯降低[37]。在Ang導致的心肌肥厚中，使用二甲雙胍可激活AMPK，進而觸發Sirt1/eNOS/p53通路，改善線粒體功能障礙[38]。在糖尿病小鼠模型中進行二甲雙胍治療后發現，磷酸化AMPK表達增加，mTOR表達降低，NLRP3通路被抑制，然而在聯合使用AMPK抑制劑后，卻呈現出相反的結果，同時二甲雙胍對心功能的保護作用也消失了，這是由于二甲雙胍在糖尿病心肌病中可通過AMPK/mTOR信號通路抑制NLRP3炎性小體，從而減弱NLRP3引起的細胞死亡和纖維化，發揮心功能保護作用[39]。另外，肝細胞核因子4(HNF4)可促進心肌纖維化和TGF-β1的轉錄，而二甲雙胍可激活AMPK進而抑制HNF4的表達，揭示了二甲雙胍抗纖維化的新作用機制[40]。但是，目前對于二甲雙胍的使用劑量仍然存在爭議。有研究發現，藥理濃度下二甲雙胍可促進線粒體分裂，從而促進線粒體呼吸，此過程是AMPK依賴性的，具有保護作用；而超藥理濃度使用時反而會抑制線粒體呼吸，這可能是由于ADP的不足造成的[41]。因此，在使用二甲雙胍改善心肌纖維化時，使用的最佳劑量仍需要進一步研究。

3.2 他汀類藥物 Mendieta等[42]通過建立3種不同的動物模型發現，靜脈注射阿托伐他汀可減少缺血心肌中的細胞凋亡與炎癥反應，與對照組比較，中性粒細胞浸潤減少50%，同時可使缺血誘導的瘢痕縮小。阿托伐他汀可激活AMPK/mTOR/raptor信號通路，但它并未影響AMPK蛋白和mRNA的總體水平，而是通過改變磷酸化AMPK的比例、激活下游信號通路來發揮作用的。此外，辛伐他汀也可起到同樣的心臟保護效果。有研究發現，在TAC誘導大鼠心肌肥厚的實驗中，阿托伐他汀可減輕心肌肥厚，其機制在于阿托伐他汀可激活AMPK，進而促進Foxo1激活，抑制miR-143-3p的水平[43]。他汀類藥物對心血管系統的多種保護作用使其在臨床被廣泛應用，然而其不良反應也較大，骨骼肌損傷的案例時有報道。近來有研究發現，通過一些藥物(如黃芪甲苷)促進AMPK的磷酸化，可激活過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(PGC-1α)，上調核呼吸因子1(NRF1)的表達，進而促進能量代謝，抑制骨骼肌細胞凋亡，同時也不會影響他汀類藥物的療效[44]。

3.3 水楊酸鹽 水楊酸鹽是一種植物提取物，在臨床上可被阿司匹林等藥物代替，阿司匹林在體內會迅速分解為水楊酸鹽。有研究發現，阿司匹林對心肌纖維化有抑制作用，可減輕心肌肥厚與心室重塑[45]。Hawley等[46]發現，水楊酸鹽可與A-769662(AMPK激活劑)結合于同一位點，引起變構激活并抑制Thr172的去磷酸化，保護AMPK免受蛋白磷酸酶2ca導致的去磷酸化和失活。同時，通過對比不同濃度水楊酸鹽中對照組與實驗組細胞的磷酸化比例發現，高濃度(＞10 mmol/L)水楊酸鹽可通過增加AMP和ADP來激活AMPK，這可能與線粒體解偶聯相關。另有學者針對上述提到的線粒體途徑展開研究，發現水楊酸鹽的促質子效應可解釋水楊酸鹽誘導線粒體解偶聯、體內外氧消耗增加及不依賴AMPK β1的效應，同時還發現其對呼吸作用的影響呈劑量依賴性[47]。因此，雖然水楊酸鹽可激活AMPK，抑制心肌纖維化，起到保護心臟的作用，但若要達到在體內激活AMPK的效果，阿司匹林的使用量需超出常規劑量[46]，而過量的阿司匹林又可能導致其他方面的不良反應，因此，對于阿司匹林應用于心肌纖維化的治療，仍需更多研究加以探討。

4 總結與展望

綜上所述，AMPK作為心肌纖維化機制研究中的熱點，在心力衰竭、糖尿病心肌病、HCM、缺血性心肌病的纖維化過程中發揮了重要作用。AMPK通過與TGF-β、Sirt、RAS等信號通路網絡交互影響，共同介導心肌纖維化復雜的病理生理過程。目前AMPK在心肌纖維化中的作用仍存在部分爭議，如在缺血再灌注時的利弊權衡等。考慮到AMPK不同亞型的組織特異性，需進一步研究不同亞型的作用及不同藥物對不同亞型的影響，為闡明AMPK在心肌纖維化中的作用機制提供可靠的理論依據，以期為干預心肌纖維化提供更好、更安全有效的思路。