SND1通過識(shí)別TINCR的甲基化位點(diǎn)促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長

秦高平，孫要文，郭亞東，李建武，程亮，韓峰，宋勇

1陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科，西安 710068；2陜西省人民醫(yī)院肝膽外科，西安 710068

瘢痕疙瘩是皮膚損傷愈合后形成的、持續(xù)生長的、質(zhì)地硬韌的異常瘢痕組織。瘢痕疙瘩難以根治且容易復(fù)發(fā)，主要原因?yàn)轳：鄹泶窠M織中的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts，KFs)具有持續(xù)性侵襲生長的特性。體外研究發(fā)現(xiàn)，正常皮膚成纖維細(xì)胞(normal skin fibroblasts，NSFs)相互接觸后會(huì)發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象[1]，而KFs接觸后仍可繼續(xù)增殖，提示瘢痕疙瘩侵襲生長的特性可能與KFs的接觸性抑制失調(diào)有關(guān)[2-3]。組織分化誘導(dǎo)非編碼RNA(tissue differentiation-inducing non-protein coding RNA，TINCR)是上皮組織、結(jié)締組織細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子[4-6]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，TINCR在燒傷瘢痕來源的KFs中明顯上調(diào)，可促進(jìn)KFs的增殖、集落形成(也稱克隆形成)和炎性因子分泌，在此過程中，TINCR與葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(staphylococcal nuclease domain containing-1，SND1)存在相互作用[7]。然而，SND1與TINCR的相互作用及其對(duì)TINCR表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)KFs繼續(xù)深入探討SND1與TINCR的相互作用，并通過構(gòu)建裸鼠瘢痕疙瘩異種移植模型驗(yàn)證SND1對(duì)瘢痕疙瘩的作用，以期為瘢痕疙瘩的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胎牛血清、DMEM和Eagle培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；3-脫氮基腺苷(3-deoxyadenosine，DAA)和人SND1重組蛋白購自北京義翹神州科技股份有限公司；RNA提取試劑Trizol和LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；Magna-MeRIP試劑盒購自北京艾德科技有限公司；CpGenome-DNA修飾試劑盒購自美國Chemicon公司；放線菌素D、3,3-二氨基聯(lián)苯胺購自美國Sigma公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒購自日本Dojindo公司；兔單克隆抗METTL3抗體(ab195352)、兔多克隆抗SND1抗體(ab65078)、兔多克隆抗GAPDH抗體(ab9485)和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab97051)購自英國Abcam公司；吉姆薩染液購自青島海博生物科技有限公司；甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)腺病毒過表達(dá)載體由南京金斯瑞生物科技有限公司構(gòu)建并進(jìn)行有效性驗(yàn)證。Herocell-180細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱、Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀、E-Gel Imager凝膠成像儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；超凈工作臺(tái)和低速離心機(jī)購自北京六一儀器廠；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；超低溫冰箱購自日本SANYO公司。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 組織樣本及細(xì)胞株 瘢痕疙瘩組織取自2016年6月-2018年5月陜西省人民醫(yī)院收治的27例Ⅱ度或Ⅲ度燒傷患者。排除嚴(yán)重?zé)齻l(fā)癥、合并全身炎癥性疾病或病史、長期攝入激素或藥物成癮、合并惡性腫瘤及接受放化療的患者。其中男15例，女12例，年齡(33.2±6.6)歲，均為亞洲人種，于燒傷發(fā)生后24 h入院。原代正常皮膚組織來源于同期于該院接受整形手術(shù)的10名受試者的正常皮膚，其中男2名，女8名，年齡(25.8±3.4)歲，均為亞洲人種。本研究獲得陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SXSRMYY-2019096)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

人原代正常皮膚成纖維細(xì)胞(human normal fibroblasts，HFs)和瘢痕疙瘩KFs由陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室從正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中分離。

1.2.2 TINCR序列中甲基化位點(diǎn)的預(yù)測 登錄SRAMP網(wǎng)站(https://www.cuilab.cn/sramp)，輸入TINCR轉(zhuǎn)錄本序列(fasta格式)，獲取TINCR序列中的N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)甲基化修飾位點(diǎn)。

1.2.3 HFs及KFs的培養(yǎng) 將正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織切塊，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，刮去表皮，將真皮移植到培養(yǎng)板上，加入培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)融合度達(dá)到90%時(shí)，用0.05%胰蛋白酶、0.04%乙二胺四乙酸溶液消化40 min，分離的細(xì)胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，取第3~8代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RT-qPCR檢測TINCR和METTL3 mRNA的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長期HFs和KFs，設(shè)置HFs組和KFs組；另取對(duì)數(shù)生長期KFs，設(shè)置對(duì)照組、空載組及METTL3過表達(dá)組。空載組和METTL3過表達(dá)組分別用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染1 μg/ml腺病毒空載體和1 μg/ml METTL3腺病毒過表達(dá)載體，對(duì)照組加入等體積無菌雙蒸水。48 h后使用Trizol試劑提取總RNA，測定總濃度。以RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用RT-qPCR試劑盒檢測RNA豐度(25 μl反應(yīng)體系)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TINCR和METTL3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-qPCR

1.2.5 甲基化RNA免疫共沉淀(MeRIP)聯(lián)合RT-qPCR檢測TINCR甲基化水平 取對(duì)數(shù)生長期HFs和KFs，設(shè)置HFs組和KFs組；另取對(duì)數(shù)生長期KFs，設(shè)置：(1)對(duì)照組、空載組及METTL3過表達(dá)組；(2)對(duì)照組及DAA組；(3)對(duì)照組、SND1重組蛋白組及SND1重組蛋白+DAA組。空載組和METTL3過表達(dá)組分別用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染1 μg/ml腺病毒空載體和1 μg/ml METTL3腺病毒過表達(dá)載體，DAA組用3 μmol/L DAA處理，SND1重組蛋白組用2 μg/ml SND1重組蛋白處理，SND1重組蛋白+DAA組用2 μg/ml SND1重組蛋白和3 μmol/L DAA同時(shí)處理，對(duì)照組用3 μmol/L DMSO處理。根據(jù)Magna-MeRIP試劑盒說明書步驟提取各組DNA。提取的DNA加入5.5 μl 3 mol/L NaOH，37 ℃變性10 min，加入20 μl 10 mmol/L對(duì)苯二酚、520 μl 40.5%亞硫酸氫鈉和200 μl礦物油。修飾后的DNA經(jīng)wizard-DNA柱純化。用CpGenome-DNA修飾試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳成像，使用凝膠成像儀分析。

1.2.6 Western blotting檢測SND1、METTL3蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長期HFs和KFs，設(shè)置HFs組和KFs組。另取對(duì)數(shù)生長期的KFs，設(shè)置：(1)對(duì)照組、空載組及METTL3過表達(dá)組；(2)對(duì)照組、SND1重組蛋白組及SND1重組蛋白+DAA組。空載組和METTL3過表達(dá)組分別用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染1 μg/ml腺病毒空載體和1 μg/ml METTL3腺病毒過表達(dá)載體，SND1重組蛋白組用2 μg/ml SND1重組蛋白處理，SND1重組蛋白+DAA組用2 μg/ml SND1重組蛋白和3 μmol/L DAA同時(shí)處理，對(duì)照組用3 μmol/L DMSO處理。使用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞并提取總蛋白，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。將等量的蛋白質(zhì)(20 μg)在聚丙烯酰胺凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，37 ℃下5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入兔抗鼠METTL3(1:1000)和SND1(1:1000)抗體4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:1000)孵育1 h，采用E-Gel Imager凝膠成像儀的Image LabTM軟件分析蛋白條帶灰度，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將KFs以104個(gè)/ml密度接種于96孔板，每孔接種100 μl，設(shè)置：(1)對(duì)照組及DAA組；(2)對(duì)照組、SND1重組蛋白組及SND1重組蛋白+DAA組。DAA組用3 μmol/L DAA處理，SND1重組蛋白組用2 μg/ml SND1重組蛋白處理，SND1重組蛋白+DAA組用2 μg/ml SND1重組蛋白和3 μmol/L DAA同時(shí)處理，對(duì)照組用3 μmol/L DMSO處理。處理0、24、48和72 h后分別向每孔中加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 取對(duì)數(shù)生長期KFs，分組及處理方法同1.2.7。將KFs制備成細(xì)胞懸液，按梯度倍數(shù)稀釋后分別接種于皿中培養(yǎng)3周，期間按時(shí)更換和補(bǔ)充培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，以4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，吉姆薩染液染色30 min，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目。

1.2.9 TINCR穩(wěn)定性評(píng)估 取對(duì)數(shù)生長期的KFs，分組及處理方法同1.2.7。使用5 μg/ml放線菌素D處理各組細(xì)胞，在0、4、8、12、16、20和24 h分別提取各組細(xì)胞總RNA，采用RT-qPCR檢測TINCR水平，繪制TINCR殘留水平曲線。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 裸鼠瘢痕疙瘩異種移植模型構(gòu)建 取18只BALB/c裸鼠，6周齡，體重(18.64±1.17) g，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(陜)2020-001]，于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(陜)2020-005]。經(jīng)誘導(dǎo)吸入2%異氟醚麻醉后，在肩胛骨區(qū)域做5 mm切口，將來自燒傷患者的瘢痕疙瘩組織以5 mm×4 mm×3 mm大小植入皮下，然后用6-0 pds可吸收線縫合皮膚。12 d后，將裸鼠隨機(jī)分為瘢痕疙瘩組、瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白組及瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白+DAA組，每組6只。瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白組每天尾靜脈注射2.5 μg SND1重組蛋白，瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白+DAA組每天尾靜脈注射2.5 μg SND1重組蛋白和5 mg/kg DAA，瘢痕疙瘩組每天尾靜脈注射5 mg/kg DMSO溶劑，連續(xù)5 d。20 d后以頸椎脫位法處死，采集瘢痕疙瘩組織進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。所有手術(shù)均在麻醉誘導(dǎo)成功后于無菌條件下進(jìn)行，手術(shù)方案均經(jīng)陜西省人民醫(yī)院動(dòng)物關(guān)愛和福利委員會(huì)批準(zhǔn)(SXPPH-2018-77)，實(shí)驗(yàn)過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.3.2 HE染色觀察裸鼠瘢痕疙瘩組織生長情況取三組裸鼠瘢痕疙瘩組織，于4 ℃下用4%多聚甲醛溶液固定過夜，石蠟包埋，切片后用二甲苯清洗并在室溫下行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察瘢痕疙瘩組織生長情況。

1.3.3 免疫組化檢測裸鼠瘢痕疙瘩組織中SND1的表達(dá) 采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合程序，瘢痕疙瘩組織切片用二甲苯和不同濃度的乙醇進(jìn)行脫蠟復(fù)水，在3%過氧化氫溶液中保存20 min；加入小鼠抗SND1單克隆抗體(GeneTex GTX71945，1:100)和生物素化的山羊抗小鼠二抗(ScyTek UHP 125，1:1000)分別孵育20 min；用3,3-二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色。每組隨機(jī)選取5個(gè)視野，用ImageJ軟件計(jì)算SND1陽性細(xì)胞百分比，取平均值。

1.3.4 Western blotting檢測裸鼠瘢痕組織中SND1蛋白表達(dá)水平 取三組裸鼠瘢痕疙瘩組織，其余處理步驟同1.2.6。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HFs與KFs中TINCR甲基化水平比較 SRAMP網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，TINCR第三外顯子(E3)中存在7個(gè)高度可能的RNA甲基化位點(diǎn)，各位點(diǎn)序列與位置如圖1A所示。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，KFs組TINCR相對(duì)表達(dá)水平明顯高于HFs組(5.43±0.35vs.1.00±0.11，P＜0.01，圖1B)。MeRIP聯(lián)合RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，KFs組TINCR甲基化水平明顯高于HFs組(19.73%±1.56%vs.10.25%±1.13%，P＜0.01，圖1C)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，KFs組與TINCR互作的SND1蛋白(本團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí))和RNA甲基化酶METTL3蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯高于HFs組(P＜0.01，圖1E)。MeRIP聯(lián)合Western blotting檢測結(jié)果顯示，SND1和METTL3與甲基化的TINCR序列具有較高的親和性(圖1D)。

圖1 KFs中TINCR甲基化位點(diǎn)預(yù)測及HFs和KFs中TINCR甲基化水平檢測Fig.1 Prediction of methylation site of TINCR in KFs and detection of TINCR methylation level in HFs and KFs

2.2 過表達(dá)METTL3對(duì)KFs中TINCR甲基化水平的影響 RT-qPCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，METTL3過表達(dá)組METTL3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(mRNA：6.03±0.55vs.1.00±0.10，P＜0.01；蛋白：4.33±0.35vs.1.00±0.09，P＜0.01)和空載組(mRNA：6.03±0.55vs.1.09±0.09，P＜0.01；蛋白：4.33±0.35vs.0.96±0.08，P＜0.01；圖2A、B)。MeRIP聯(lián)合RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)METTL3后，KFs中TINCR的甲基化水平和相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(甲基化水平：32.89%±2.88%vs.19.04%±1.72%，P＜0.01；相對(duì)表達(dá)水平：4.65±0.32vs.1.00±0.10，P＜0.01)和空載組(甲基化水平：32.89%±2.88%vs.18.16%±1.64%，P＜0.01；相對(duì)表達(dá)水平：4.65±0.32vs.1.06±0.11，P＜0.01；圖2C、D)。

圖2 KFs中過表達(dá)METTL3對(duì)TINCR甲基化水平和相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of METTL3 overexpression on the methylation and relative expression levels of TINCR in KFs

2.3 甲基化酶抑制劑DAA對(duì)TINCR穩(wěn)定性和KFs增殖能力的影響 與對(duì)照組相比，甲基化酶抑制劑DAA處理KFs后TINCR的穩(wěn)定性明顯下降，半衰期明顯縮短[(8.50±1.13) hvs.(12.90±1.41) h，P＜0.001，圖3A]。DAA處理后TINCR的甲基化水平明顯低于對(duì)照組(7.43%±0.55%vs.18.88%±1.76%，P＜0.01，圖3C)。此外，DAA組KFs的活力和克隆形成能力明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[KFs活力：48 h，0.78±0.07vs.0.98±0.08；72 h：1.11±0.10vs.1.46±0.12；克隆形成能力：(43.00±5.50)個(gè)vs.(109.00±6.80)個(gè)，P＜0.01，圖3B、D]。

圖3 DAA處理對(duì)TINCR甲基化水平和KFs增殖能力的影響Fig.3 Effects of DAA treatment on the methylation level of TINCR and the proliferation ability of KFs

2.4 SND1重組蛋白單獨(dú)或與DAA共同處理對(duì)TINCR穩(wěn)定性和KFs增殖能力的影響 與對(duì)照組相比，使用SND1重組蛋白孵育KFs后，細(xì)胞中SND1蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯增高(3.65±0.17vs.1.00±0.09，P＜0.01，圖4A)，使用DAA處理后SND1蛋白相對(duì)表達(dá)水平有一定程度下降(1.87±0.12vs.3.65±0.17，P＜0.01，圖4A)。SND1重組蛋白組半衰期明顯長于對(duì)照組[(23.95±1.25) hvs.(13.10±1.33) h，P＜0.01，圖4B]，但兩組TINCR甲基化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20.15%±1.74%vs.19.04%±1.77%，P＞0.05，圖4C)；DAA處理可抵消SND1重組蛋白對(duì)TINCR半衰期的延長作用[(12.00±1.21) hvs.(23.95±1.44) h，P＜0.01，圖4D]；SND1重組蛋白+DAA組TINCR甲基化水平明顯低于SND1重組蛋白組(7.89%±0.88%vs.20.15%±1.74%，P＜0.01，圖4C)。SND1重組蛋白組細(xì)胞活力和克隆形成能力明顯高于對(duì)照組[細(xì)胞活力：48 h，1.19±0.09vs.0.99±0.08；72 h，1.81±0.14vs.1.48±0.12；克隆形成能力：(297.00±17.90)個(gè)vs.(123.00±11.20)個(gè)，P＜0.01，圖4D、E]。SND1重組蛋白+DAA組KFs活力(48 h：0.97±0.08；72 h：1.44±0.10)和克隆形成能力[(105.00±15.60)個(gè)]明顯低于SND1重組蛋白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖4D、E)。

2.5 SND1重組蛋白單獨(dú)或與DAA共同處理對(duì)體內(nèi)瘢痕疙瘩組織生長的影響 HE染色結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白組真皮層有大量成纖維細(xì)胞和膠原纖維，而瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白+DAA組呈現(xiàn)疏松的膠原纖維(圖5A)。

免疫組化檢測結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白組SND1陽性細(xì)胞百分比高于瘢痕疙瘩組(63.43%±3.32%vs.21.16%±4.67%，P＜0.01)，而瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白+DAA組SND1陽性細(xì)胞百分比低于瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白組(38.52%±6.88%vs.63.43%±3.32%，P＜0.01，圖5B)，且免疫組化染色結(jié)果顯示SND1主要集中在細(xì)胞核中。

Western blotting檢測結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白組SND1蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯高于瘢痕疙瘩組(2.54±0.13vs.1.00±0.10，P＜0.01)，瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白+DAA組SND1蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于瘢痕疙瘩+SND1重組蛋白組(1.07±0.09vs.2.54±0.13，P＜0.01，圖5C)。

圖5 SND1重組蛋白單獨(dú)或與DAA共同處理對(duì)體內(nèi)瘢痕疙瘩組織生長的影響Fig.5 Effects of SND1 recombinant protein treatment alone or co-treatment with DAA on keloid tissue growth in vivo

3 討 論

TINCR基因位于人19號(hào)染色體上，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為基因間的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，在多種實(shí)體腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并在癌細(xì)胞的增殖和侵襲中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[8]。瘢痕疙瘩與腫瘤有一定的類似之處，特別是瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞具有接觸抑制消失、無限增殖和侵襲生長的特性。本團(tuán)隊(duì)前期研究探討了TINCR對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞功能的影響，基因過表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TINCR可促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、集落形成和炎性因子分泌，即在瘢痕疙瘩形成過程中發(fā)揮促進(jìn)作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常HFs相比，KFs中TINCR相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，提示TINCR可能在瘢痕疙瘩的形成和生長過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。用DAA處理KFs后，TINCR的穩(wěn)定性和甲基化水平明顯降低；KFs活力下降，集落形成能力被抑制；與單獨(dú)DAA處理相比，DAA和SND1重組蛋白同時(shí)處理可明顯增加TINCR的穩(wěn)定性，增強(qiáng)KFs的活力和集落形成能力。由此可見，TINCR的穩(wěn)定性對(duì)于KFs的異常增殖能力有重要影響。

RNA甲基化是RNA轉(zhuǎn)錄本的5‘端Cap及3‘端ployA之外的重要修飾類型，用于維持RNA穩(wěn)定性或調(diào)節(jié)RNA剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)，其中m6A修飾是最常見的RNA甲基化修飾類型[9]。RNA序列中m6A水平的改變與多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、胚胎發(fā)育異常及組織纖維化等[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，RNA的m6A修飾與皮膚細(xì)胞的分化和衰老有關(guān)[11-12]，但具體作用機(jī)制尚不清楚，而瘢痕疙瘩形成和生長過程中m6A修飾發(fā)揮的作用尚未見報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，SND1蛋白與TINCR在燒傷后的皮膚組織中表達(dá)同時(shí)上調(diào)，二者均能促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的增殖和侵襲，值得注意的是，在此過程中SND1可促進(jìn)TINCR的表達(dá)，但具體原因尚不清楚[7]。

根據(jù)功能不同可將調(diào)節(jié)m6A修飾的酶分為3類：(1)甲基化酶(writer)，主要用于RNA序列中m6A的形成；(2)甲基化位點(diǎn)識(shí)別酶(reader)，主要功能是識(shí)別并結(jié)合RNA序列中的m6A位點(diǎn)，影響RNA的穩(wěn)定性、可變剪接和轉(zhuǎn)運(yùn)等；(3)去甲基化酶(eraser)，即消除RNA序列中m6A修飾的酶[13]。METTL3是最常見的writer，常作為多種疾病診斷的生物標(biāo)志物[14]。本研究中，與正常HFs相比，高表達(dá)TINCR的KFs中METTL3的表達(dá)水平明顯升高，且過表達(dá)METTL3可明顯增高TINCR甲基化水平。此外，在TINCR甲基化調(diào)節(jié)過程中，SND1扮演著重要角色，SND1重組蛋白處理可使KFs中TINCR的穩(wěn)定性增加但不影響其甲基化水平，提示在TINCR甲基化調(diào)節(jié)過程中SND1發(fā)揮reader的作用。最近Meng等[15]和Baquero-Perez等[16]發(fā)現(xiàn)，SND1可識(shí)別m6A甲基化位點(diǎn)并調(diào)節(jié)多個(gè)RNA分子的穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)，SND1和METTL3與甲基化的TINCR均具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，而且采用SND1重組蛋白處理KFs后，TINCR的穩(wěn)定性明顯增加，而以甲基化抑制劑DAA處理可消除SND1重組蛋白對(duì)TINCR穩(wěn)定性的促進(jìn)作用。由此可見，SND1可識(shí)別甲基化的TINCR并能促進(jìn)TINCR的穩(wěn)定。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，KFs中TINCR呈高甲基化水平，SND1可識(shí)別并結(jié)合TINCR的甲基化位點(diǎn)，增強(qiáng)TINCR的穩(wěn)定性，促進(jìn)TINCR介導(dǎo)的KFs細(xì)胞生長。