復方中草藥對虹鱒免疫保護力的影響

劉海芳，王 凡，張思琪，李聰歌，馬雅雯

復方中草藥對虹鱒免疫保護力的影響

劉海芳1，王 凡2，張思琪2，李聰歌2，馬雅雯2

（1. 中原工學院，河南 鄭州 450007；2. 洛陽師范學院，河南 洛陽 471934）

【目的】研究復方中草藥對虹鱒（）肝臟免疫功能及腸道免疫相關基因的影響。【方法】將紅棗提取物、山藥提取物和黃芪提取物按照質量比1∶1∶1混合，分別按質量分數0（對照）、0.3%、0.6%和1.2%添加到虹鱒基礎飼料中，飼喂體長7.6 ～ 8.9 cm 的虹鱒幼魚56 d。用副溶血弧菌（s）對幼魚進行攻毒試驗(5.48×106cfu/尾)，4 d后，取其肝臟和腸道，測定肝臟的生理生化指標，用半定量PCR及熒光定量PCR測定腸道免疫相關基因的表達。【結果】與對照組比較，肝臟的總抗氧化能力（T-AOC）顯著升高（< 0.05），溶菌酶（LZM）水平極顯著升高（< 0.01），酸性磷酸酶（ACP）、過氧化氫酶（CAT）活性顯著降低（< 0.05），堿性磷酸酶（ALP）活性極顯著降低（< 0.01），0.6%劑量組的丙二醛（MDA）極顯著降低（< 0.01），而SOD無顯著差異（> 0.05）；各復方中草藥組腸道的腫瘤壞死因子（TNF-α）及1.2%劑量組轉化生長因子-β（TGF-β）轉錄水平極顯著降低（< 0.01），0.3%和0.6%劑量組的補體3（C3）轉錄水平顯著升高（< 0.05）。【結論】復方中草藥(紅棗+山藥+黃芪) 可提高感染副溶血弧菌的虹鱒非特異性免疫功能。

虹鱒；免疫；中草藥；副溶血弧菌；肝臟；腸道；非特異性免疫

虹鱒（）是一種適應性較廣的冷水性魚類，其肉質鮮美，刺少肉多，無腥無鱗，高蛋白低脂肪，膽固醇含量極少，富含氨基酸、不飽和脂肪酸，有“水中人參”之稱[1]。現階段虹鱒養殖較為廣泛，隨著養殖規模的不斷擴大和集約化水平的不斷提高，虹鱒疾病頻發[2-3]。目前，常用化學治療劑或抗生素藥物治療虹鱒病害，但存在成本較高、使魚體質減弱、污染養殖水體和周圍環境等諸多缺點，不僅降低了成品價值，影響養殖效益，還威脅人們健康。在養殖過程中，如何提升虹鱒自身免疫力，預防魚病是其健康養殖的關鍵。

中草藥飼料添加劑有天然、無害、低成本、作用廣泛及對養殖動物、環境幾無副作用等優點[4-5]。目前，已有復方中草藥中功能性成分作用的體外評價和體內實驗的報道，對其功能性作用機制研究也逐漸深入，表明中草藥可促進水產動物生長，提高其抗病及免疫力[6-12]。

紅棗（）、山藥（L.）和黃芪（Schischkin）是我國常見的藥食兼用中藥材。紅棗中的多糖、維生素、礦物質、皂苷和黃酮類等有豐富的生物學功能[13]。山藥的功能性活性成分包括多糖、皂苷、膽甾醇、麥角甾醇、膽堿等，有抗氧化作用[14]。黃芪多糖可促進動物脾內漿細胞增生以及抗體合成，在體液免疫中起促進作用[15]。本課題組前期研究表明，飼喂該3種中草藥復合物8周后，虹鱒生長性能有增加趨勢，免疫力增強[16]。為研究該復方中草藥對虹鱒免疫保護力的影響，本研究在前期研究的基礎上，對虹鱒進行副溶血弧菌（）攻毒實驗，分析虹鱒非特異性免疫功能相關指標的變化情況，為虹鱒中草藥飼料添加劑的適宜添加量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

紅棗、山藥和黃芪提取物，為水提物，購自陜西森弗天然制品有限公司，為原料經精選、粉碎、精細提取、過濾、濃縮、精制純化、干燥、精微粉碎后制成，每1 000 g原材料的提取物為50 g。

實驗用虹鱒購自四川省眉山市東坡區天貴水產養殖場，體長7.6 ～ 8.9 cm，于飼養缸（直徑×高= 1 m×1 m）中暫養14 d，每日定時投喂3次并及時清理缸內殘餌和糞便。暫養期間水溫11 ～ 15 ℃，pH 6.9 ± 0.2，溶解氧8 mg/L以上。

副溶血弧菌菌種，中國微生物菌種保藏中心。將菌種接種到配方為蛋白胨20 g/L、氯化鈉40 g/L、結晶紫0.000 5 g/L，pH = 8.8的液體培養基中，于36℃條件下培養24 h，制備2.74×107cfu/mL的副溶血弧菌原液，備用。

1.2 實驗飼料

參考肉食性魚類飼料配方及虹鱒飼料配方[17]，制備虹鱒基礎飼料，配方見文獻[16]。將紅棗、山藥和黃芪提取物按質量比1∶1∶1混合制成復方中草藥，分別按質量比0.30%、0.60%、1.20%在虹鱒基礎飼料中依次加入復方中草藥，制成相應的復合中草藥飼料。使用ZL-600顆粒機制得顆粒飼料，風干24 h，裝入保鮮袋，于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 實驗設計

選取暫養的規格相似、狀態良好、無病無傷的虹鱒，停飼24 h，放入冷水魚養殖循環系統中的飼養缸（直徑1 m，水深0.8 m），每缸放入30尾，放入前稱量體質量。設對照組和處理組，對照組投喂基礎飼料，處理組分別投喂含質量分數0.3%、0.6%和1.2%復方中草藥的飼料，每個實驗組設3個平行組，實驗期間的其他條件同暫養期，養殖周期為8周。養殖實驗結束后，進行攻毒試驗，根據預試驗結果，每組隨機選取虹鱒10尾，對魚腹腔注射0.2 mL 2.74×107cfu/mL副溶血弧菌原液，放入新實驗缸觀察，記錄死亡情況，4 d后剖取存活的虹鱒肝臟和腸道，于液氮中速凍，轉移至-80℃冰箱中保存，備用。

1.4 肝臟非特異性免疫指標的測定

將肝臟組織樣品置于冰上解凍后，取0.4 g加入9倍 [質量 (g) 體積 (mL) 比] 的冰冷生理鹽水，在冰浴中研磨60 s左右，制成勻漿，將勻漿液以4 ℃、2 500 r/min條件離心10 min，取上清液，按照南京建成生物工程公司的試劑盒詳細步驟測定總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）水平。

1.5 腸道免疫相關基因的檢測

1.5.1 引物序列 腫瘤壞死因子（TNF-α）、轉化生長因子-β（TGF-β）、補體3（C3）、LZM靶基因與內參基因的引物序列（表1）來自文獻[18-19]。

表1 PCR引物序列

1.5.2 RNA 的提取與反轉錄 根據總RNA極速抽提試劑盒（上海飛捷生物技術有限公司）的詳細步驟，提取虹鱒中腸的RNA，用超微量分光光度計測定RNA濃度及(260 nm)/(280 nm)，同時用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，對質量好、濃度適宜的RNA根據反轉錄試劑盒（東洋紡生物科技有限公司）的步驟進行反轉錄反應。

1.5.3 半定量PCR 根據普通PCR反應步驟，把反轉錄獲得的cDNA和試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）中的上下游引物、2×Tap MasterMix和Nuclear-Free Water配制成25 μL的PCR反應體系，進行PCR擴增反應。對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，調整內參基因在每個濃度組條帶亮度基本一致，觀察目的基因、、和的條帶亮度，判斷目的基因的表達量。

1.5.4 實時熒光定量PCR 經半定量PCR及實時熒光定量PCR分析，各基因的引物特異性良好。

將反轉錄反應后的cDNA，各基因的上、下游引物，DBI實時熒光定量試劑盒（DBI ? Bioscience）中的BestarSybr Green qPCR master mix、Nuclear-Free Water制備實時熒光定量PCR反應體系，進行PCR擴增反應。分析反應后的q值，利用2-ΔΔCT法計算非特異性免疫基因的相對表達量。

1.6 數據分析

用SPSS13.0軟件中的One-Way ANOVA對實驗數據進行方差分析，結果用平均值±標準差表示。用Duncan法對各組間差異進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 復方中草藥對虹鱒肝臟免疫保護力相關生化指標的影響

復方中草藥飼料對虹鱒肝臟免疫保護力相關生化指標的影響見表2。表2可見，復方中草藥組的T-AOC顯著高于對照組（< 0.05），LZM極顯著高于對照組（< 0.01），0.6%劑量組的T-AOC 顯著低于1.2%劑量組（< 0.05），0.3%劑量組的LZM顯著高于0.6%和1.2%劑量組（< 0.01）。復方中草藥組的CAT、ACP和ALP與對照組相比顯著降低（< 0.05），0.3%劑量組CAT顯著低于1.2%劑量組（< 0.05），隨復方中草藥添加劑量增加，ALP活性極顯著降低（< 0.01）。0.6%劑量組的MDA極顯著低于對照組（< 0.01），0.3%和1.2%劑量組與對照組之間差異不顯著（> 0.05）。各組間SOD差異不顯著（> 0.05）。

表2 不同中草藥添加劑量組虹鱒肝臟非特異性免疫指標

注：同列凡含一個相同字母則表示差異不顯著（> 0.05）。

Note: Containing one same letter in the same column indicates no significant difference (> 0.05).

2.2 免疫保護力相關基因的半定量PCR分析

圖1顯示，與對照組相比，基因在各復方中草藥組的表達有升高的趨勢；基因在1.2%劑量組明顯降低，在0.3%和1.2%組無顯著變化；基因的表達調控與基因類似；基因在各復方中草藥組無明顯變化。

2.3 復方中草藥對虹鱒腸道免疫保護力相關基因表達的影響

圖2可見，與對照組相比，0.6%和1.2%劑量組基因表達量顯著上升（< 0.05），分別依次上調38.8%和30.2%。復方中草藥組基因表達量無顯著差異（> 0.05）。復方中草藥組基因表達量顯著下調（< 0.01），分別依次下調44.4%、42.6%、32.3%。1.2%劑量組基因表達量顯著下調（< 0.01），下調92.9%。

圖1 不同實驗組虹鱒腸道的內參及目的基因

凡含一個相同字母則表示差異不顯著（P > 0.05）。

3 討論

3.1 復方中草藥對虹鱒肝臟免疫相關生化指標的影響

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡且傾向于氧化的狀態。丙二醛（MDA）是氧化應激過程產生的代表性毒性中間產物。總抗氧化能力是指各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是較為重要的兩種抗氧化酶。抗氧化物質可清除生物體內多余的自由基來增強免疫力。本研究中，在副溶血弧菌刺激下，復方中草藥組虹鱒肝臟的T-AOC顯著提高，0.6%劑量組MDA顯著降低，表明復方中草藥提高了虹鱒肝臟的抗氧化能力，尤其在0.6%濃度組表現得更為突出。王得清等[20]指出，黃芪總黃酮具有清除自由基的作用，劉飛等[21]研究表明，紅棗提取物顯著提高虹鱒肝臟和腎臟SOD活性，降低腎臟MDA水平，WANG等[22]研究發現，山藥提取物提高虹鱒血清SOD活性。本課題組前期研究也表明，該復合中草藥在投喂虹鱒56 d后，虹鱒血清SOD顯著升高。但本研究發現，副溶血弧菌刺激下，復方中草藥組虹鱒肝臟CAT顯著降低，而SOD無顯著變化，由此推測，虹鱒肝臟在病原菌刺激下，復方中草藥組虹鱒構成總抗氧化能力的其他抗氧化類物質可能顯著提高，從而抑制了CAT活性[23]，同時復方中草藥成分和魚組織的不同也會導致各種抗氧化酶結果的不同。

ACP和ALP在動物免疫反應中發揮重要作用，也是反映其肝功能的兩個重要指標。ACP直接用于磷酸基團的轉移，參與能量轉化和信號轉導，提高機體的非特異性免疫水平和營養代謝水平[8]。ALP在堿性介質中可通過水解作用清除表面帶有磷酸酯的異物，其活性的高低與動物的生長性能關系密切[9]。本研究中發現，副溶血弧菌刺激下，復方中草藥組肝臟的ACP和ALP顯著性降低，表明對照組被病原菌攻擊，肝臟的ACP和ALP相對升高，免疫水平和肝臟代謝功能降低，而復方中草藥增加了虹鱒肝臟的非特異性免疫功能，保護肝臟。

LZM可溶解細菌細胞壁而使細菌溶解，也可與帶負電荷的病毒蛋白結合，與核酸、脫輔基蛋白形成復合體，使病毒失活。因此，其活性與動物的抗病性和免疫密切相關[10]。血清和肝胰臟在識別外來異物和免除異物侵害時發揮重要作用。本研究中，副溶血弧菌刺激下，復方中草藥組肝臟的LZM與對照組相比較顯著升高，表明復方中草藥提高了虹鱒肝臟抑菌能力，可能與復方中草藥提高了魚類的消化能力及營養成分的利用率有關[24]。這也與復方中草藥對虹鱒血清LZM影響的結果相一致[16]。

3.2 復方中草藥對虹鱒腸道免疫保護力相關基因表達的影響

TNF-α是巨噬細胞受到病原體等有害刺激產生的小分子蛋白，能直接殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞無明顯毒性，是炎癥反應必須的介質[25]。本研究中，弧菌攻毒處理后，復方中草藥組基因表達量顯著下調，說明其腸道促炎癥因子降低，復方中草藥增加了虹鱒腸道的免疫水平，降低炎癥反應。本課題組前期研究表明，該配方的復方中草藥顯著提高了虹鱒血清含量[16]，同時還發現該配方中的山藥提取物[22]和紅棗提取物[21]也顯著提高了虹鱒腸道中的mRNA表達量，說明該配方中草藥能通過的表達調控來提高虹鱒的免疫功能。

補體系統在先天性免疫中有良好的作用（趨化、調理和消滅病原體），補體的激活可促進B細胞增殖、分化，最終產生抗體和效應淋巴細胞，連接免疫系統[26-28]。C3為補體系統中含量最高的成分。本研究發現，隨著飼料中中草藥添加量的上升，虹鱒腸道中表達量有上升的趨勢，且在0.6%與1.2%組顯著上升，表明虹鱒在投喂中草藥后腸道獲得性免疫提升，有助于虹鱒抵抗外界不良環境，極大地提高虹鱒的抗菌能力。劉飛等[21]研究表明，紅棗提取物提高了虹鱒頭腎中基因表達量，周顯青等[12]指出，黃芪能明顯促進中華鱉（）血清補體C3的合成，WANG等[22]研究顯示，山藥提取物顯著提高了虹鱒血清含量，本研究前期研究同樣證實該配方中草藥提高虹鱒血清中和的含量，這些結果和本研究結果一致，表明該復方中草藥的各種成分均可增強魚類的補體水平，增加抗菌能力。

TGF-β即轉化生長因子，主要作用是通過促進細胞外基質的形成與抑制免疫反應等來調節細胞的生長與分化，也是調節B淋巴細胞的重要細胞因子，能抑制其增殖，誘導凋亡，阻斷活化與分化[29]。本研究發現，在投喂中草藥添加劑后，基因表達量在1.2%劑量組顯著下調，說明復方中草藥能顯著增強虹鱒淋巴細胞分化，進一步證實復方中草藥添加劑能顯著增強虹鱒的免疫能力。

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Effect of Chinese Herbal Compound on Immune Protection of Rainbow Trout()

LIU Hai-fang1, WANG Fan2, ZHANG Si-qi2, LI Cong-ge2, MA Ya-wen2

（1. Z,450007,;2.,471934,）

【Objective】The aim of this study is to study the effect of Chinese herbal compound (CHC) on liver immune function and intestinal immune-related genes of rainbow trout ().【Method】Juvenilerainbow trout with a body length of 7.6 - 8.9 cm were fed the diets containing CHC prepared by jujube, yam and astragalus extracts (20∶1) in equal proportion at a dose of 0, 0.3%, 0.6% and 1.2% for 56 d, and then were injected withs (5.48×106cfu/ind). Four days after injection, physiological and biochemical indexes in the liver and the expressions of immune related genes in the intestine were detected by semi-quantitative PCR and qPCR.【Results】Compared with the control, T-AOC and LZM activity were significantly increased (< 0.05< 0.01, ), and the acid phosphatase(ACP), catalase (CAT), and alkaline phosphatase (ALP) activities were decreased (< 0.05), and the MDA level in 0.6% group was also decreased (< 0.01); while SOD was not changed (> 0.05); expressions ofgene in theintestine of CHC groups andgene in 1.2% group were significantly decreased (< 0.01), whilein 0.3% and 0.6% groups were increased (< 0.05). 【Conclusion】CHC (jujube+yam+astragalus) can improve the nonspecific immune function level of rainbow trouts infected withs.

; immune; Chinese herbal medicine;; liver; intestine; nonspecific immune

S968

A

1673-9159（2022）01-0007-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.002

劉海芳，王凡，張思琪，等. 復方中草藥對虹鱒免疫保護力的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（1）：7-12.

2021-07-27

河南省科技廳科技攻關項目（182102110407）

劉海芳（1977―），女，副教授，研究方向為水生生物學。E-mail: 49112015@qq.com

（責任編輯：劉慶穎）