微酸性電解水結合復合保鮮劑對凡納濱對蝦冷藏期間蛋白特性影響

藍蔚青，張炳杰，張 溪，謝 晶

微酸性電解水結合復合保鮮劑對凡納濱對蝦冷藏期間蛋白特性影響

藍蔚青1,2,3，張炳杰1，張 溪1，謝 晶1,2,3

（1. 上海海洋大學食品學院 // 2. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心 // 3. 上海海洋大學食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海 2013061）

【目的】研究微酸性電解水（SAEW）結合迷迭香提取物（RE）-檸檬酸（CA）復合保鮮劑處理對凡納濱對蝦（）冷藏期間蛋白特性變化影響，探討此法用于蝦類貯藏保鮮的效果。【方法】將樣品分別經SAEW、質量分數4% RE＋質量分數1% CA（RC）、SAEW結合RC（SAEW+RC）和無菌水（CK）處理10 min后，自然瀝干15 min，裝入PE保鮮袋于（4±1）℃冰箱中保藏，每2 d測定樣品的pH值、總揮發性鹽基氮（TVB-N）、總巰基含量、Ca2+-ATPase活性、化學鍵、肌原纖維小片化指數（MFI）與內源熒光強度（IFI）等指標，并結合聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行綜合分析。【結果】復合處理能延緩凡納濱對蝦貯藏期間pH與TVB-N值的升高，抑制總巰基含量下降，CK、RC、SAEW與SAEW+RC組樣品的Ca2＋-ATPase活力分別由初始0.16、0.17、0.17與0.17 μmol/(mg·min) 降至0.12、0.13、0.12與0.14 μmol/(mg·min)，MFI值較初始值上升1.88、1.73、1.76和1.54倍，可見SAEW+RC對延緩Ca2+-ATPase活性下降與MFI值的上升有較好作用。同時，SAEW+RC處理還能減緩蛋白質分解、氧化和變性，保持蛋白質化學鍵與IFI值的相對穩定。【結論】微酸性電解水結合復合保鮮劑處理能較好抑制凡納濱對蝦冷藏期間的蛋白質氧化分解，延緩其品質劣變。

微酸性電解水；迷迭香提取物；檸檬酸；凡納濱對蝦；蛋白特性

近年來，國內外研究學者已通過多種方式來保持蝦類新鮮度，抑制其微生物和酶活性。微酸性電解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）又名微酸性氧化電位水、微酸性次氯酸水，其方便制取，廣譜殺菌，且無殘留，因此通常作為殺菌劑廣泛應用于鮮切果蔬、肉制品等食材的殺菌處理等食品工業中。Tantratian等[3]利用60 mg/L的微酸性電解水在4 ℃下浸泡牡蠣（）肉30 min，結果得出其有效降低牡蠣肉中的細菌總數；Xuan等[4]研究發現，用微酸性電解水冰貯藏柔魚（）能顯著的降低其細菌總數，抑制微生物生長。近年來，生物保鮮劑因其來源廣泛、綠色安全等特點受到研究人員重視，并逐漸用于水產品保鮮[5]。迷迭香葉通過有機萃取得到酚酸類、萜類和黃酮等抗氧化和抗菌化合物，其可通過螯合金屬離子來終止自由基反應，切斷水產品中自由基的鏈式反應，減緩其蛋白質氧化[6]。其中，藍蔚青等[7]利用1.0 g/L迷迭香提取物鍍冰衣于-20 ℃凍藏條件下保存卵形鯧鲹（），結果得出其TVB-N與TBA值的上升速度明顯減緩，表明迷迭香提取物延緩了卵形鯧鲹的蛋白質氧化變性和脂質氧化；Choulitoudi等[8]研究發現，迷迭香提取物涂層能延緩煙熏鰻（）片的氧化，改善其品質。檸檬酸為天然有機酸，也在食品加工中得到較好應用。其中，Mahmoud等[9]用5.0 mg/mL檸檬酸溶液浸泡牡蠣10 min，發現其能減少牡蠣中副溶血弧菌數，且抑菌率與處理液濃度呈正相關關系。

目前，微酸性電解水與保鮮劑相結合用于水果[10-11]、肉類[12-13]殺菌保鮮已有部分報道，但將微酸性電解水-復合保鮮劑復合開展蝦類貯藏期間蛋白特性變化的研究報道鮮見。因此，本實驗擬通過微酸性電解水結合復合保鮮劑處理凡納濱對蝦，通過測定其冷藏期間的pH、總揮發性鹽基氮（TVB-N）、總巰基含量、Ca2+-ATPase活性、化學鍵、肌原纖維小片化指數（MFI）與內源熒光強度（IFI）等指標，并結合聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE分析，綜合評價微酸性電解水結合復合保鮮劑對冷藏凡納濱對蝦蛋白特性變化影響，以期為蝦類等水產品的保鮮加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

凡納濱對蝦（）購自上海浦東新區農工商超市，蝦齡60 d。選取體長（13±1）cm、體質量（15±1）g，外觀完整且大小均一的鮮活樣品。將鮮活樣品置于充氧氣泡沫箱中?；睿?0 min內運至實驗室，加冰猝死。

1.2 主要藥品試劑

迷迭香提取物（鼠尾草酸≥60%，食品級），購于上海暢碩生物科技有限公司；檸檬酸（純度＞99%），購于河南省宏益生物科技有限公司；蛋白濃度測定試劑盒，購于生工生物工程（上海）股份有限公司；總巰基測試盒、Ca2+-ATPase測試盒，購于南京建成生物科技有限公司；氯化鉀、輕質氧化鎂、硼酸、鹽酸、考馬斯亮藍G-250、冰醋酸、甲醇等，購于國藥集團化學試劑有限公司，均為國產分析純。

1.3 主要儀器設備

FX-SWS100型微酸性電解水生成機，煙臺方心水處理設備有限公司；F-7100型熒光分光光度計，上海斯邁歐分析儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Synergy2自動酶標儀，美國BioTek公司；1658001型小型垂直電泳槽，美國biorad公司等。

1.4 實驗方法

1.4.1 微酸性電解水制備 由微酸性電解水生成機電解體積分數9.0%HCl溶液制備。制備后微酸性電解水的pH值為（6.35±0.04），氧化還原電位（Oxidation-Reduction Potential，ORP）值為（861.6±12.35）mV，有效氯質量濃度（Available Chlorine Concentration，ACC）值為（30±1.54）mg/L。

1.4.2 原料處理 將樣品洗凈后隨機分成4組，分別處理如下：1）樣品在無菌水浸漬處理10 min（CK）；2）樣品在質量分數1%檸檬酸與質量分數4%迷迭香提取物復配液浸漬處理10 min（RC）；3）樣品在微酸性電解水浸漬處理10 min（SAEW）；4）樣品在微酸性電解水后浸漬5 min后，在質量分數1%檸檬酸與質量分數4%迷迭香提取物復配液中浸漬處理5 min（SAEW+RC）。處理期間的蝦水質量比為1∶2，將樣品分別處理后，自然瀝干后裝入PE保鮮袋中，在（4±1）℃冰箱中貯藏。期間，每2 d進行各項指標測定。

1.4.3 pH值與TVB-N值 參考《食品安全國家標準食品pH值的測定》（GB5009.237-2016）[14]。稱取5 g蝦肉，加入45 mL蒸餾水，靜置30 min后過濾，用pH計測濾液的pH值。參考《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》（GB 5009.228-2016）[15]，利用凱氏定氮儀測定其TVB-N值，結果以mg / 100g表示。

值為0 的區域屬于非陰影柵格，值為1的區域說明僅在某一個時刻存在陰影；值為2的區域說明某兩個時刻存在陰影；值為3 的區域表明該區域在3個時刻都為陰影區域；凡是值大于0 的地方，都是在 12∶00～14∶00 時間內有建筑遮擋的地方。

1.4.4 總巰基含量與Ca2+-ATPase活性 按總巰基含量試劑盒說明書，使用酶標法測定各組處理樣液在412 nm處的光密度值，其中分子消光系數為13 600 L/(mol?cm)。同時，按超微量Ca2+-ATPase測試盒操作說明進行Ca2+-ATPase活性測定。

1.4.5 化學鍵 參照Wang等[16]法測定化學鍵。蛋白質含量據改良型Brodford法蛋白濃度測定試劑盒說明書測定其二硫鍵、離子鍵、氫鍵與疏水相互作用，結果以蛋白溶解質量濃度（g/L）表示。

1.4.6 肌原纖維小片化指數（myofibril fragmentation index，MFI） 參考Li等[17]提取肌原纖維蛋白（Myofibrillar Protein，MFP）。取2 g蝦肉與20 mL緩沖液（20 mmol/L Tris-maleate，pH=7.0，0.05 mol/L KCl溶液）冰浴下勻漿，在4 ℃條件下，10 000 r/min離心15 min，將沉淀物與20 mL緩沖液均質，置于4 ℃條件提取1 h。隨后，在4 ℃條件下10 000 r/min勻漿15 min。得到的上清液即為肌原纖維蛋白，將其冷藏存放，并在1 h內使用。參考Wang等[18]采用雙縮脲法將MFP上清液調節質量濃度至0.5 mg/mL，酶標法測定波長540 nm處光密度值，按下列公式計算MFI值。

MFI =（540 nm）×150。

1.4.7 內源熒光強度 提取MFP溶液進行內源熒光1 200 nm/min掃描檢測。采集參數：激發波長為295 nm，發射波長為300 ～ 400 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.4.8 聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳 參考胡瀟予等[19]提取蝦樣MFP上清液，并進行SDS-PAGE分析。采用考馬斯亮藍G-250染色1 h，用體積分數7.5%冰醋酸和體積分數5%甲醇脫色至條帶清晰并進行成像分析。

1.5 數據處理

實驗重復3次，數據統計分析采用SPSS 17.0軟件，作圖采用Origin 85軟件，差異性顯著分析采用單因素法，< 0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式對蝦肉pH值與TVB-N值的影響

通常情況下，樣品pH值隨著貯藏時間的延長而相應升高，其與樣品的可接受性密切相關。由圖1(A)可知，在整個貯藏期間，盡管各組pH值差異性不大，但微酸性電解水與復合保鮮劑單一處理組、復合組樣品的pH值均低于對照組，這與Shiekh等[20]研究結果一致。在貯藏10 d時，SAEW+RC組樣品的pH值為8.02±0.04，RC組和SAEW組樣品的pH值分別為8.21±0.06和8.30±0.05，而CK組樣品的pH值為8.50±0.03。結果表明，SAEW+RC處理能保持蝦樣品質，降低其蛋白質分解速率。

樣品在貯藏期間，細菌與蛋白酶的作用會使含氮化合物分解，導致蝦肉中產生不可接受的氣味。由圖1(B)可見，貯藏期間，對照組樣品的TVB-N值高于處理組。在6 d，對照組樣品的TVB-N值為（31.34±0.84）mg/100g，已超過可接受限值（30 mg/100g）。RC、SAEW與SAEW+RC組樣品在第8 d時的TVB-N值分別為（31.29±0.67）、（34.52±0.70）、（22.57±0.82）mg/100g。此時，RC與SAEW單一處理組樣品已超過限值。而復合組樣品直到10 d才達到腐敗階段，表明其對TVB-N的生成抑制效果顯著，可能是因為微酸性電解水與檸檬酸對微生物產生失活效應，抑制了樣品貯藏期間含氮類化合物的生成。

同一大寫字母表示組內無顯著差異（P > 0.05）；同一小寫字母表示組間無顯著差異（P > 0.05）

2.2 不同處理方式對蝦肉總巰基含量與Ca2+-ATP酶活性的影響

由圖2(A)可知，SAEW組、RC組和SAEW+RC組在貯藏期間的總巰基含量均高于CK組樣品。樣品在貯藏過程中，蛋白質發生氧化，導致分子結構的展開和構象變化。在貯藏過程中，蛋白質的總巰基（尤其是活性巰基）易形成二硫鍵，巰基暴露被氧化成磺酸或二硫鍵，使總巰基含量相應減少[21]。可能是因為微酸性電解水的廣譜抑菌性和迷迭香提取物的抗氧化性雙重作用，延緩了蛋白質結構展開，減少了總巰基暴露。

肌球蛋白特性的穩定與Ca2＋-ATP酶活性相關，其活性降低，反映蛋白質氧化與變性程度。如圖2(B)所示，樣品Ca2＋-ATP酶活性在冷藏期明顯下降，且各組間Ca2＋-ATP酶活性差異顯著（＜0.05）。CK、RC、SAEW與SAEW+RC組樣品的Ca2＋-ATP酶活力由初始0.16、0.17、0.17和0.17 μmol/(mg·min)分別降至0.12、0.13、0.12和0.14 μmol/(mg·min)。蝦類MFP的肌球蛋白分子包含的巰基變化影響Ca2＋-ATP酶活性，肌球蛋白頭部因巰基氧化使其構象發生改變，Ca2＋-ATP酶活性相應降低[22]。

2.3 不同處理方式對蝦肉肌原纖維小片化指數MFI值的影響

肌原碎片化指數表示肌原纖維損傷程度，反映其結構和結構蛋白完整性。MFI值越大，表示內部損壞越嚴重。由圖3可知，各組樣品MFI值在冷藏期間呈遞增態勢，其中CK組樣品的MFI值與處理組差異顯著（< 0.05）。肌原纖維受損與鈣蛋白酶被激活導致Z盤相關的MFP降解相關。CK組、RC組、SAEW組和SAEW+RC組樣品在冷藏期間分別較初始值上升了1.88、1.73、1.76和1.54倍。肌肉的MFI值和pH值變化呈負相關關系，兩者變化趨勢一致；此外，由于肌原纖維中的結構蛋白與細胞外基質蛋白水解，使肌原纖維的完整性受到破壞，因此更易發生機械斷裂[23]。該結果與周大鵬等[24]研究結論一致。

同一大寫字母表示組內無顯著差異（P > 0.05）；同一小寫字母表示組間無顯著差異（P > 0.05）

同一大寫字母表示組內無顯著差異（P > 0.05）；同一小寫字母表示組間無顯著差異（P > 0.05）

2.4 不同處理方式對蝦肉蛋白質化學鍵的影響

圖4可知，凡納濱對蝦冷藏期間二硫鍵的蛋白溶解含量隨著貯藏時間的延長而不斷增加，其中處理組樣品的含量顯著低于對照組（＜0.05），且SAEW+RC組樣品的含量最低。離子鍵和氫鍵的蛋白溶解含量隨著貯藏時間的延長相應減少，而處理組樣品的含量相對較高，顯著高于CK組（＜0.05）；樣品疏水相互作用的蛋白溶解含量呈上升趨勢，其中對照組含量最高?？赡苁且驗榈鞍踪|氧化，促進離子鍵斷裂，使疏水基團大量暴露并聚集[25]。復合保鮮劑含有的多酚類物質能以氫鍵和疏水方式與蛋白相互作用，使蛋白氧化減緩，減少疏水基團的暴露與離子鍵的斷裂[26-27]。因此，微酸性電解水與復合保鮮劑處理能改善凡納濱對蝦貯藏期間的肌原纖維蛋白化學作用力，保持蛋白結構穩定。

2.5 不同處理方式對蛋白質內源熒光強度IFI值的影響

由圖5可知，新鮮樣品在336 nm處顯示最高的熒光強度，表明此時其蛋白質結構完整。隨著貯、藏時間的延長，各組樣品的內源熒光強度值相應下降。其中，處理組樣品的最高熒光強度始終顯著高于對照組，且以復合處理組作用更明顯。

同一大寫字母表示組內無顯著差異（P > 0.05）；同一小寫字母表示組間無顯著差異（P > 0.05）

內源熒光光譜是檢測蛋白質三級結構的重要指標。芳香族殘基由于其內源熒光特性在特定波長具有最大值。最大熒光發射波長（max）的相對位置表示暴露在蛋白質內部的芳香族殘基。蝦樣肌原纖維蛋白的IFI值在冷藏期間下降與色氨酸殘基位置從疏水環境暴露密切相關[28]。內源熒光強度值的下降可能是因為凡納濱對蝦在貯藏期間，其肌原纖維蛋白結構逐漸展開，色氨酸殘基等熒光物質暴露在極性環境中，蛋白質三級結構發生變化，使內源熒光強度降低。而微酸性電解水與復合保鮮劑處理破壞了蛋白質的疏水區域，使芳香基團暴露，熒光強度相應增大[29]。各組樣品隨著貯藏時間的延長，蛋白質進一步伸展，色氨酸暴露于溶劑中，產生猝滅作用，熒光強度隨之降低[30]。由此表明，微酸性電解水與復合保鮮劑結合處理，改變了凡納濱對蝦肌原纖維蛋白的結構完整性。該結果與總疏基含量變化趨勢一致。

2.6 不同處理方式下蝦肉肌原纖維的聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE變化

由圖6可知，各組樣品在冷藏期間條帶顏色逐漸變淡。其中，對照組樣品在高分子質量區的條帶逐漸變淺，而在50 ku左右的條帶顏色加深，表明此時樣品中的肌原纖維蛋白已發生明顯降解。在貯藏10 d時，RC組樣品的條帶呈現分子質量較大的蛋白質聚合體，說明蛋白間發生聚集交聯[31]。CK組中肌球蛋白重鏈的條帶密度在10 d最弱，而其他處理組僅略有降低。

肌球蛋白重鏈（220 ku）、肌動蛋白（43 ku）和肌球蛋白（38 ku）與蛋白質氧化密切相關。一般來說，高分子鏈出現是由于蛋白質交聯和積累，而小分子鏈出現可能由于高分子鏈降解[32]。因此，SDS-PAGE能顯示樣品中肌原纖維蛋白的降解情況。樣品在冷藏期間內源性酶的催化下，肌原纖維蛋白發生相應降解，條帶顏色逐漸變淡。而由于肌球蛋白重鏈易受氧化降解，貯藏10 d時CK組中肌球蛋白重鏈被分解成相對較小分子量的蛋白質，導致CK組在條帶密度較其他組弱。而肌動蛋白和肌球蛋白在不同樣品的所有條帶中無明顯變化，可見微酸性電解水-復合保鮮劑結合具有良好的抗氧化活性，延緩了凡納濱對蝦貯藏期間巰基和蛋白質氧化，防止其降解。

圖5 不同處理方式對凡納濱對蝦冷藏期間內源熒光強度變化影響

圖6 不同處理方式下凡納濱對蝦肌原纖維蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳

3 結論

凡納濱對蝦在冷藏期間經微酸性電解水結合復合保鮮劑處理后，能減緩其pH、TVB-N與MFI值的上升速率，通過抑制其總巰基含量與Ca2＋-ATPase活性的下降，保持蛋白質化學鍵與IFI值的相對穩定，減緩蛋白質氧化分解，保持其良好的蛋白特性，延緩其品質劣變。該研究結果將對后期凡納濱對蝦的保鮮加工提供理論參考。

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Effects of Slightly Acidic Electrolyzed Water Combined with Compound Preservative on the Protein Characteristics of Pacific white shrimp () During Refrigerated storage

LAN Wei-qing1,2,3, ZHANG Bing-jie1, ZHANG Xi1, XIE Jing1,2,3

（1.// 2.// 3.,201306,）

【Objective】The effects of slightly acidic electrolyzed water combined with compound preservative on the protein characteristics of Pacific white shrimp () during refrigerated storage were measured. 【Methods】Samples were impregnated with slightly acidic electrolyzed water (SAEW), compound preservatives (rosemary extract+citric acid, RC), slightly acidic electrolyzed water and a compound preservative (SAEW+RC) and sterile water (CK) treatment for 10 min. The samples were drained for 15 min, and put in PE bags and stored in a refrigerator at (4±1) ℃. Different indexes, such as pH, TVB-N, total sulfhydryl content, Ca2+-ATPase activity, chemical bond, MFI and IFI, and also in combination with SDS-PAGE, were analyzed respectively. 【Results】SAEW+RC treatment could delay the increase of pH and TVB-N value, inhibit the decrease of total sulfhydryl content. The Ca2+-ATPase activity of CK, RC, SAEW and SAEW+RC samples were decreased from 0.16, 0.17, 0.17 and 0.17 μmol/(mg·min) to 0.12, 0.13, 0.12 and 0.14 μmol/(mg·min) respectively. The MFI value had increased by 1.88, 1.73, 1.76 and 1.54 times respectively compared with the initial value. It can be seen that SAEW+RC has a beneficial effect on delaying the decline of Ca2+-ATPase activity and the raise the MFI value. At the same time, it can also slow down protein decomposition, oxidation and denaturation, and maintain the relative stability of protein chemical bond and IFI value.【Conclusion】slightly acidic electrolyzed water combined with compound preservative treatment could inhibit the oxidation and decomposition of protein, delay the quality lost of pacific white shrimp during refrigerated storage.

slightly acidic electrolyzed water; rosemary extract; citric acid;; protein characteristic

Q939.11

A

1673-9159（2022）01-0098-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.013

藍蔚青，張炳杰，張溪，等. 微酸性電解水結合復合保鮮劑對凡納濱對蝦冷藏期間蛋白特性影響[J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（1）：98-105.

2021-08-18

“十三五”國家重點研發計劃重點專項 (2019YFD0901602)；現代農業產業技術體系建設專項（CARS-47-G26）；上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心能力提升項目（19DZ2284000）

藍蔚青（1977―），男，博士，高級工程師，研究方向為水產品加工及貯藏工程。E-mail: wqlan@shou.edu.cn

謝晶（1968―），女，教授，博士，研究方向為食品保鮮技術。E-mail: jxie@shou.edu.cn

（責任編輯：劉朏）