組蛋白乙酰化酶抑制劑(DCH36_06)對小鼠急性肝損傷的保護作用及機制研究

彭金金 黃鶴鳴 劉彥君 石翠翠 范建高 張元元 羅成 李光明

急性肝損傷(acute liver injury, ALI)臨床十分常見，目前尚無有效防治方法。盡管引發ALI的病因各異，但均有炎性反應參與其損傷修復過程，且炎性反應可能是決定ALI臨床結局的關鍵[1, 2]。ALI病情進展除與損傷強度及持續時間(環境因素)有關外，也與宿主的易感體質(遺傳因素)密切相關，因此表觀遺傳在ALI病情演進中可能起關鍵作用。組蛋白的乙酰化修飾是一種重要的表觀調控方式[3]。P300/CBP組蛋白乙?；?histone acetyltransferase，HAT)與促炎因子表達上調及炎癥信號通路活化密切相關[3]。DCH36_06是新近發現的一種P300/CBP組蛋白乙?；敢种苿?，其可能具有抗炎活性[4]?；谘仔苑磻贏LI病情進展中的關鍵作用，DCH36_06可能對ALI具有保護作用。本研究探討DCH36_06對脂多糖/D-氨基半乳糖胺(Lipopolysaccharide/D-galactosamine，LPS/D-Gal)誘導的ALI小鼠的保護作用，并初步闡明其機制。

材料與方法

一、 動物、試劑與藥物

C57BL/6雌性小鼠75只，8～10周齡，SPF級，體質量20～22 g，購自中國科學院上海藥物研究所，在清潔級動物實驗中心喂養(標準動物飼料及飲水，12 h明暗交替光照時間)。所有動物實驗均遵守中國科學院上海藥物研究所動物倫理委員會的相關規定。LPS(E.Coli，菌株O111：B4)和D-Gal均購自美國Sigma公司。DCH36_06試劑由中國科學院上海藥物研究所提供。蘇木素-伊紅(HE)和末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase media-ted nick end labeling，TUNEL)染色試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司。RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和RT-qPCR熒光染料試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。ELISA試劑盒購自美國Sigma公司。

二、 動物分組及小鼠ALI模型的建立

將75只小鼠隨機分成4組，正常對照組20只、ALI模型組20只、藥物干預組20只和藥物對照組15只。正常對照組：0.9%氯化鈉溶液0.5 mL腹腔注射，1 h后注射0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液；模型組：0.9%氯化鈉溶液0.5 mL腹腔注射，1 h后注射溶解有LPS(2 mg/kg)/D-Gal(250 mg/kg)的0.9%氯化鈉溶液0.1 mL；藥物干預組：DCH36_06(100 mg/kg)0.5 mL腹腔注射，1 h后注射溶解有LPS/D-Gal(劑量同模型組)的0.9%氯化鈉溶液0.1 mL；藥物對照組：DCH36_06 (劑量同干預組) 0.5 mL腹腔注射，1 h后注射0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液。前3組于LPS/D-Gal誘導4 h后每組各處死5只取材，余小鼠繼續飼養至24 h，用以觀察各組小鼠24 h存活情況。

三、血生化水平檢測

使用日立7020全自動血生化分析儀，檢測血清AST、ALT、TBil水平。

四、 肝組織染色

(一)HE染色 肝組織浸泡于4%的多聚甲醛，室溫固定48 h后，脫水、浸蠟、包埋，切成約為5 μm厚度的切片。依次將切片放入二甲苯孵育140 min、無水乙醇孵育20 min、75%乙醇孵育5 min，三蒸水洗滌。蘇木精染色5 min后，于鹽酸水溶液中浸泡數分鐘，氨水水溶液中反藍，三蒸水洗滌。再將切片依次置于85%、95%的梯度乙醇中脫水后，蘇木精染液中染色5 min，三蒸水洗滌，而后脫水封片。

(二)TUNEL染色 將固定于4%多聚甲醛中的肝組織脫水、浸蠟、包埋，切成約為5 μm厚度的切片。按照試劑盒使用說明，制備反應液并進行染色孵育，依次經converter-POD試劑37 ℃暗濕盒中孵育30 min， DAB底物室溫孵育10 min后，漂洗干燥、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

五、肝組織細胞因子蛋白含量檢測

組織裂解液提取肝組織總蛋白后， ELISA法檢測肝組織細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白含量。經過包被、封閉、洗滌、加樣、溫育、抗體孵育、洗滌、酶結合、顯色、終止反應后，于酶標儀450 nm處，以空白對照孔調零后測各孔A值，并根據標準品的濃度和A值做標準曲線，然后根據標準曲線方程計算出各樣本濃度。

六、肝組織細胞因子mRNA水平檢測

七、統計學分析

結 果

一、各組小鼠24 h存活情況

在LPS/D-Gal刺激后，模型組小鼠早期即出現死亡，15只小鼠24 h存活6只；而DCH36_06干預組小鼠死亡時間明顯推遲，且24 h存活13只；空白對照組和藥物對照組的15只小鼠24 h均存活。實驗表明，DCH36_06對LPS/D-Gal誘導的ALI小鼠具有顯著保護作用，且無明顯肝毒性。

二、各組小鼠肝組織炎性損傷和肝細胞凋亡情況

正常對照組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞呈放射狀有序排列成肝索結構；LPS/D-Gal誘導4 h后模型組小鼠肝細胞大片壞死，肝小葉結構破壞，正常肝索結構消失，大量炎性細胞浸潤；藥物干預組小鼠肝細胞變性、壞死明顯減少，肝索結構基本正常，炎性細胞浸潤明顯減輕，見圖1。TUNEL染色顯示，ALI模型組小鼠肝組織見大量肝細胞凋亡，與模型組相比，藥物干預組小鼠肝組織內肝細胞凋亡顯著減少，見圖2。染色結果從組織學水平證實DCH36_06對LPS/D-Gal誘導的ALI具有顯著保護作用。

圖1各組小鼠肝組織光學顯微鏡下表現(HE，低倍放大)A.正常對照組 B.ALT模型組 C.DCH36-06給藥組

圖2各組小鼠肝組織光學顯微鏡下表現(TUNEL，低倍放大)A.正常對照組 B.ALT模型組 C.DCH36-06給藥組

三、各組小鼠血清AST、ALT、TBil水平

LPS/D-Gal刺激誘導模型組小鼠血清AST、ALT、TBil水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)；而DCH36_06干預后小鼠血清AST、ALT、TBil水平較ALI模型組顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠肝功能指標比較(±s)

四、各組小鼠肝組織炎性細胞因子mRNA水平和蛋白含量

與正常對照組相比，ALI模型組小鼠肝組織內促炎性細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；DCH36_06干預組肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平亦有輕微增高，但與模型組相比，炎性細胞因子mRNA水平顯著下降(P<0.05)，見表2。促炎性細胞因子 TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量的ELISA分析也顯示類似的結果，見表3。以上數據表明DCH36_06干預可有效抑制LPS/D-Gal誘導的肝組織炎性細胞因子mRNA表達和炎性細胞因子的蛋白分泌，從分子水平證實DCH36_06對LPS/D-Gal誘導的肝組織炎性損傷具有顯著保護作用。

表2 各組小鼠肝組織內促炎性細胞因子mRNA含量比較(±s)

表3 各組小鼠肝組織內促炎性細胞因子蛋白含量比較(pg/mL,±s)

討 論

ALI本質上是一種炎性損傷，適度的炎性反應有助于損傷修復，過弱不利于病灶清除，過強易誘發損傷擴大，導致疾病快速進展。因此，精準調控炎性反應是防治ALI的關鍵。表觀遺傳可整合環境因素與宿主基因組遺傳信息，從源頭調控基因表達及炎性反應[5]，提示干預表觀調節可能具有潛在肝臟保護作用。研究發現，組蛋白乙?；揎椗c肝損傷的發生發展密切相關，P300/CBP組蛋白乙酰化酶作為一種重要的組蛋白修飾酶，在炎癥性疾病的進展中起重要調控作用[6- 8]。

DCH36_06作為新發現的一種P300/CBP組蛋白乙?；敢种苿4]，可能對ALI具有保護作用。本研究結果顯示，DCH36_06干預可顯著提高LPS/D-Gal誘導ALI小鼠24 h的存活率。為了探究DCH36_06對小鼠ALI的保護機制，進一步從組織病理學及血清生化學方面證實了DCH36_06可顯著減輕LPS/D-Gal誘導的小鼠ALI，表現為肝組織炎癥性壞死、炎性細胞浸潤及肝細胞凋亡顯著減少，血清ALT、AST及TBil明顯降低。從分子生物學角度發現，DCH36_06干預可顯著下調小鼠肝組織促炎細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表達和蛋白分泌。

本研究證實P300/CBP組蛋白乙?；敢种苿〥CH36_06對小鼠ALI具有顯著保護作用，其機制可能與抑制促炎細胞因子表達、減輕肝內炎性反應相關。研究結果顯示，表觀抑制劑可從源頭調控炎性反應強度，由此減輕肝組織炎癥損傷，提示表觀抑制劑DCH36_06在防治ALI中可能具有潛在應用價值，表觀調控可能是ALI防治的一個新靶點。