高效液相色譜法測定他達拉非中11個雜質

聶忠莉，曾勝莉，王曉玲，蕭茂玲，黃金玉

(1.成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都克萊蒙醫藥科技有限公司，四川 成都 610041)

0 引 言

他達拉非(Tadalafil)是一種口服磷酸二酯酶V型(PDE5)抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙(MED)[1-2].他達拉非是由起始物料D-色氨酸甲酯鹽酸鹽(SM1)和胡椒醛(SM2)合成[3-5]，化學名為(6R-12aR)-6-(1,3-苯并二惡唑-5-基)-2-甲基-2,3,6,7,12,12a-六氫化吡嗪并[1′,2′-1,6]-吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮.目前對他達拉非的降解產物及可能存在的雜質相關研究較少，故本研究參考相關標準中他達拉非中有關物質的測定方法，探索高效液相色譜法將他達拉非與其11個已知雜質(結構見圖1)有效分離的檢測條件[6-8]，初步確定測定他達拉非中11個已知雜質的檢測方法，并對該方法進行方法學驗證.最終利用確定的方法測定中試樣品中雜質的含量，為控制他達拉非質量提供依據.

圖1 他達拉非及雜質的結構式

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1260型液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，Waters 2695型液相色譜儀(沃特世公司)，UV759CRT型紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)，BP-210D型電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司).

1.2 試 藥

他達拉非(批號，190501S、190502S、190503S)、雜質L(批號，20190501S，純度為98.86%)、雜質N(批號，20191120，純度為97.91%)，購自四川省旭暉制藥有限公司；他達拉非對照品(批號，F0L003，含量為99.9%)，由美國藥典委員會提供；雜質D(批號，P-RXX-57-0，含量為98.01%)，購于深圳大力水手生物科技有限公司；雜質F(批號，18-11-0842，含量為97.06%)、雜質G(批號，20-08-0614，含量為97.19%)、雜質S(批號，19-08-2804，含量為98.46%)、雜質V(批號，19-09-2018，含量為96.72%)、雜質W(批號，21-01-0101，含量為90.55%)，購于美國SINCO公司；雜質I(批號，18-T03579-02，含量為96.4%)，購于加拿大RXA化學公司；雜質K(批號，1-ALN-19-2，含量為97%)，購于加拿大TRC公司；SM2(批號，PH-18010，含量為99.92%)，購于四川惠泉生物科技有限公司；甲醇、乙腈與異丙醇為色譜純試劑；三氟乙酸為分析純試劑.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent ZORBAX SB C84.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.1%三氟乙酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為285nm，柱溫為40℃，樣品盤溫度為5℃，流速為1.0 mL/min,進樣體積20μL.

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液

取本品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL含1.0 mg的溶液.

2.2.2 對照品溶液

精密稱取他達拉非雜質F、雜質D、雜質I、雜質G、SM2、雜質K、雜質L、雜質V、雜質S、雜質W及雜質N適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含SM2、雜質V、雜質S和雜質W各約0.5 μg，其余雜質各約含1.0 μg的混合溶液.

2.2.3 對照溶液

精密量取他達拉非供試品溶液0.1 mL，加甲醇定量稀釋至100 mL，制成每1 mL中含他達拉非1.0 μg的對照溶液.

2.2.4 系統適用性溶液

精密量取他達拉非對照品及他達拉非雜質A適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中含他達拉非對照品1 mg和他達拉非雜質A 1 μg的混合溶液.

2.3 系統適用性要求

在系統適用性溶液色譜圖中，他達拉非與雜質A依次出峰，理論塔板數按他達拉非峰計算不得低于5 000，他達拉非峰與雜質A峰之間的分離度應大于3.0.取“2.2.3”項下的對照溶液20 μL注入高效液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使色譜圖中他達拉非的峰高約為滿量程的20%.

2.4 專屬性試驗

按“2.1”項下的色譜條件，對他達拉非(批號190501S)強制降解試驗后的樣品進行測定，結果見表2.

表2 專屬性試驗結果

由表2可知，空白不干擾樣品測定，他達拉非較穩定，僅在酸與堿破壞條件下產生降解雜質，且主要降解雜質為雜質A(異構體測定項下控制).主成分峰與雜質峰分離度較好，主峰純度符合要求，破壞后各樣品的物料平衡均在90%～110%之間，表明方法專屬性較好.

2.5 檢測限與定量限

取“2.2.2”項下的混合溶液適量，用甲醇稀釋至一定濃度，取此溶液按“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，同時走空白基線，以儀器基線噪音3倍峰高作為檢測限，儀器基線噪音10倍峰高作為定量限，得各雜質的檢測限與定量限，結果見表3.

表3 檢測限與定量限測定結果

2.6 線性范圍

研究各雜質在10%-1 000% 濃度范圍內，各雜質峰面積與濃度之間的線性關系，結果見表4.

表4 線性范圍測定結果

2.7 回收率

精密稱取11份他達拉非樣品，其中2份加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL約含1 mg的溶液，作為空白供試品溶液，另9份分別加入50%、100%與150%限度濃度的已知雜質，每個濃度配制3份供試品溶液，測定樣品中各雜質的含量，計算回收率及RSD值，結果見表5，各雜質回收率良好.

表5 雜質平均回收率

2.8 精密度

他達拉非原料中不含已知雜質F、雜質D、雜質I、雜質G、SM2、雜質K、雜質L、雜質V、雜質S、雜質W及雜質N，重復性試驗采用加樣方式，測定重復6份樣品中各雜質含量的變異程度，結果6份樣品中各已知雜質含量RSD分別為2.49%、3.35%、4.09%、6.78%、1.02%、2.10%、2.26%、1.65%、1.00%、1.26%及1.87%，重復性試驗良好.

由甲、乙兩位研究員在不同儀器、不同時間上對同一批號樣品測定12次，各雜質平均含量的RSD分別為2.27%、2.53%、3.28%、6.24%、1.73%、2.48%、2.24%、2.88%、1.44%、4.57%及1.84%，中間精密度良好.

2.9 耐用性

按“2.1”項下的色譜條件，在流速、柱溫以及流動相中三氟乙酸的量發生微小改變時，對加樣樣品進行測定，結果顯示，樣品中雜質個數和雜質量以及各成分峰之間的分離度與原條件幾乎無變化.當更換成不同型號色譜柱時，他達拉非峰與雜質峰、雜質峰與雜質峰之間的分離度未符合要求，由此可知，在色譜柱不發生變化的情況下，本方法的耐用性能良好.

2.10 樣品測定

分別取3批他達拉菲中試樣品，按“2.2”項下的方法配制供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，按外標法計算樣品中11種雜質的含量，結果見表6.

表6 3批中試樣品中11種雜質的檢測結果

3 討 論

在對測定波長進行考察時，他達拉非及他達拉非各雜質都具有不同的紫外特征峰，但在285 nm附近均有吸收，參考相關標準及文獻有關物質的檢測波長，最終選擇285 nm作為本品有關物質的檢測波長[9].

本研究對稀釋劑進行了篩選，分別采用50%乙腈、乙腈、甲醇以及乙腈—異丙醇(1∶1)等溶劑溶解并稀釋制成每1 mL含雜質各約1 μg，他達拉非1 mg的混合溶液，作為系統溶液，進樣測定.結果在純乙腈和乙腈—異丙醇(1∶1)體系中，各雜質峰型較差，理論板數低.取系統溶液在50%乙腈和甲醇溶劑中分別于不同時間進樣測定，考察峰面積變化情況，結果雜質H和雜質W的峰面積均呈逐漸下降趨勢，控制樣品盤溫度在5℃可以減緩下降趨勢，在甲醇中的穩定性略優于50%乙腈，因此選擇甲醇作為本品的稀釋劑.