基于瞬時受體電位香草酸1通道探討電針治療骶上脊髓損傷后神經源性膀胱大鼠的作用機制

郭寧 秦合偉 李彥杰 牛麗 牛雨晴 宋雪梅 劉昊源

1河南中醫藥大學康復醫學院（鄭州450046）；2河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）康復科（鄭州450002）

神經源性膀胱（neurogenic bladder，NB）是指中樞或外周神經系統病變導致膀胱和尿道的儲尿和排尿功能障礙，進而產生一系列下尿路癥狀及并發癥，最常見原因之一是脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）。據不完全統計，約80%的SCI 患者在受傷后1年內出現不同程度的膀胱功能障礙［1］，給患者家庭和社會帶來巨大負擔。

瞬時受體電位通道（transient receptor potential channels，TRPc）超家族通過Ca2+、Na+和K+通道參與機體多種器官內機械感覺與傷害感受的傳導，其中瞬時受體電位香草酸1（transient receptor po?tential vanilloid 1，TRPV1）在人類和大鼠的神經元和非神經元組織中均有表達，通過多種機制促進正常膀胱感覺的產生［2］。研究發現TRP 通道、ATP釋放和嘌呤能受體的異常表達與膀胱功能障礙程度密切相關［3］。

近年來，電針已成為SCI后NB中醫治療的主流方法［4-5］。本實驗選取“中極”“關元”兩穴進行干預，中極為足三陰與任脈交會穴、膀胱募穴，穴下為交感神經支配的膀胱傳出神經分支髂腹下神經，電針此穴可對膀胱及尿道內括約肌的交感支配產生影響；關元強壯腎陽，與中極同處小腹，正是膀胱在體表的投射區，針感可直接傳導到病灶，促進膀胱對尿液的氣化固攝［6-7］。本研究將以膀胱逼尿肌為靶標，以TRPV1 及其下游信號通路為切入點展開研究，并通過設立TRPV1 抑制劑組驗證電針“中極”“關元”穴是否通過抑制TRPV1 通道的激活發揮治療作用，以期為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組健康SPF 級SD 雌性大鼠60 只，體質量（220±20）g，7～9 周齡，購自鄭州市惠濟區華興實驗動物中心，動物許可證號SCXK（豫）2019?0002，所有動物均飼養于河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）SPF 級動物實驗中心。常規飼養1 周后，隨機挑選15 只作為假手術組，其余45 只大鼠進行骶上脊髓損傷手術造模。本實驗經河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）倫理委員會審查通過（PZ?HNSZYY?2020?016）。

1.2 實驗試劑TRPV1 抗體（博奧森）、P2X2抗體（博奧森）、GAPDH 抗體（博奧森）、C?Kit 抗體（San?ta Cruz 公司）、TRPV1 抑制劑capsazepine（Sigma 公司）、HE 染色試劑盒（索萊寶）。

1.3 模型制備2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，以第十三浮肋相連接的T13 作為骨性標志，以T10?11 為中心縱行切開約2 ～ 3 cm，鈍性分離，手術刀緊貼棘突兩側將椎旁肌縱行切開，暴露T10?T11 的棘突及椎板，切開棘間韌帶，止血鉗輕輕咬除T10 椎板直至暴露脊髓。用尖刀片于暴露的脊髓上緣橫向反復切割數次，此時若大鼠雙下肢抽搐，鼠尾呈松弛性甩動，表明脊髓已完全橫斷［8］。術后每天三次定時crede手法排尿，記錄排尿量。

1.4 模型評價成模標準：（1）脊髓損傷行為學（basso beanie bresnahan，BBB）評分：后肢在前肢行走時處于拖動狀態，不能參與行走，BBB 評分為0分；（2）膀胱功能評估：脊髓休克期，大鼠腹部可觸及脹大膀胱，需手法排尿，籠內墊料干燥。脊休克期過后，膀胱脹大不明顯，無需手法輔助排尿，大鼠下腹部及部分墊料潮濕，尿流動力學結果顯示高壓、低順應性，說明膀胱逼尿肌產生了無抑制性收縮。若出現雙后肢自主運動、自主排尿或尿潴留的情況，亦將其剔除。

1.5 各組干預方法造模成功后，將大鼠隨機分為模型組、電針組、抑制劑組，各組開始治療：假手術組：暴露T10?T11，僅去除T10 棘突（不切斷脊髓），正常飼養；模型組：造模后不做任何處理，正常飼養；電針組：以0.3 mm×25.0 mm 毫針斜刺“中極”“關元”2 ～ 5 mm，電針儀參數設定為疏密波（10 Hz/50 Hz），強度1 mA，以針刺處出現規律性收縮為宜，留針20 min，每日1 次，連續2 周。抑制劑組：膀胱灌注TRPV1 抑制劑（2.5 mL，100 nmol/L，30 min），每天1 次，連續2 周。

1.6 標本采集及檢測

1.6.1 尿流動力學模型穩定和電針治療結束后，2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，排空膀胱后將大鼠仰臥位固定，將F3 導尿管經三通管與微量注射泵及尿動力儀連接，緊貼尿道壁緩慢插入導尿管，排空管腔氣體，待導尿管插入膀胱并固定，此時壓力值為膀胱基礎壓（cmH2O），隨后以0.2 mL/min 的速度向膀胱內灌注溫生理鹽水至膀胱壓力穩定，記錄膀胱漏尿點壓（cmH2O）和膀胱最大容量（mL），計算膀胱順應性（mL/cmH2O）。

1.6.2 標本采集尿流動力學檢測結束后，在冰塊上將膀胱組織剪取兩塊，一塊放置固定液固定，以備HE染色和免疫熒光染色，一塊置于凍存管-80 ℃凍存，用于蛋白免疫印跡（Western blot）檢測。

1.6.3 HE 染色梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；切片機以厚度4 μm 進行切片；進行蘇木素?伊紅染色；× 400 光鏡下觀察膀胱組織形態學改變。

1.6.4 免疫熒光雙標染色將切好的石蠟切片脫蠟，抗原修復，山羊血清封閉后，滴加P2X2（1∶500）4 ℃過夜，FITC 標記的二抗室溫1 h，然后滴加C?Kit（1∶200）4 ℃過夜，Cy3 標記的二抗室溫1 h，TBST漂洗，含DAPI 的抗熒光衰減封片劑封片。×200 熒光顯微鏡下觀察、采集圖像，統計C?Kit 與P2X2 受體的陽性細胞數。

1.6.5 Western blot 檢測檢測大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2 蛋白表達取凍存的膀胱組織提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，240 mA 恒流轉移到PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（TRPV1 1∶1 000、C?Kit 1∶500、P2X21∶500），4 ℃搖床過夜，TBST 洗膜后加入HRP 標記的二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，洗膜后ECL 顯色、曝光顯影。Image Lab 分析軟件進行圖像處理和灰度值計算。

1.7 統計學方法數據處理采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，對符合正態分布的數據，多組間比較采用完全隨機設計單因素方差分析，方差齊采用獨立樣本t檢驗，方差不齊采用Dunnett′s T3 檢驗方法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型評價脊髓休克期，模型組大鼠雙后肢無任何運動，呈拖行狀態，行為學評分（0.07±0.19）較假手術組（21.00 ± 0.00）明顯降低（P＜0.01），腹部可摸到脹大充盈的膀胱，手法排尿量達到頂峰且標準差波動較大；脊髓恢復期膀胱脹大不明顯，表現為尿失禁，無需手法排尿，尿量明顯減少逐漸趨于穩定。結合尿流動力學結果顯示，模型組大鼠膀胱基礎壓和漏尿點壓升高，膀胱最大容量和順應性降低，表明逼尿肌反射亢進型膀胱模型制備成功。見圖1、表1。

圖1 術后模型組大鼠的手法排尿量Fig.1 Manual urine output of rats in the model group after operation

表1 術后兩組大鼠尿流動力學結果比較Tab.1 Comparison of urine flow dynamics between the two groups after operation ±s

表1 術后兩組大鼠尿流動力學結果比較Tab.1 Comparison of urine flow dynamics between the two groups after operation ±s

注:與假手術組比較，**P ＜0.01

組別假手術組模型組t 值P 值例數15 45基礎壓（cmH2O）16.635±2.548 37.648±3.603**-9.523＜0.001漏尿壓（cmH2O）35.091±3.938 54.537±3.8074**-7.100＜0.001最大容量（mL）4.345±0.452 1.273±0.304**11.277＜0.001膀胱順應（mL/cmH2O）0.206±0.029 0.052±0.012**9.504＜0.001

2.2 治療后尿流動力學檢測電針干預后，與模型組比較，電針組、抑制劑組大鼠膀胱基礎壓和漏尿點壓下降，膀胱最大容量和順應性升高（P＜0.01）。見表2。

表2 電針干預后各組大鼠尿流動力學結果比較Tab.2 Comparison of the results of urine flow dynamics in each group after electroacupuncture intervention ±s

表2 電針干預后各組大鼠尿流動力學結果比較Tab.2 Comparison of the results of urine flow dynamics in each group after electroacupuncture intervention ±s

注：與假手術組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01

組別假手術組模型組電針組抑制劑組F 值P 值例數15 15 15 15基礎壓（cmH2O）15.885±1.641 35.648±2.581**23.857±1.852##26.707±3.045##48.268＜0.001漏尿壓（cmH2O）35.091±3.938 53.537±2.829**40.556±1.158##41.580±1.869##30.089＜0.001最大容量（mL）4.402±0.452 1.306±0.349**2.990±0.197##2.639±0.257##59.974＜0.001膀胱順應（mL/cmH2O）0.231±0.026 0.073±0.012**0.166±0.022##0.171±0.024##36.417＜0.001

2.3 膀胱組織HE 染色假手術組膀胱移行上皮細胞排列整齊，固有膜完整，無炎性細胞浸潤，無異常出血、增生及纖維化改變；模型組膀胱移行上皮細胞排列紊亂，固有膜結構被破壞，細胞間存在大量單核細胞浸潤，組織水腫、出血明顯，結締組織增生呈纖維化趨勢；與模型組比較，電針組和抑制劑組膀胱組織的炎癥、水腫、出血程度有所減輕，單核細胞浸潤數量減少。見圖2。

圖2 各組大鼠膀胱組織形態學變化（HE，×400）Fig.2 The bladder histomorphological changes of rats in each group（HE，×400）

2.4 各組大鼠膀胱ICC 細胞C?Kit、P2X2 受體陽性表達水平免疫熒光雙標染色結果顯示膀胱ICC 細胞C?Kit 與P2X2受體共同表達于膀胱肌束邊緣，C?Kit 陽性細胞著色為紅色，P2X2陽性細胞著色為綠色。與假手術組比較，模型組C?Kit 和P2X2免疫陽性細胞數量增多（P＜0.01）；與模型組比較，電針組與抑制劑組均有少量表達（P＜0.01）。見圖3、表3。

表3 免疫熒光各組大鼠膀胱ICC 細胞C?Kit、P2X2受體的陽性共表達量Tab.3 Positive expression of C?Kit and P2X2 receptor in ICC cells of rats in immunofluorescence groups ±s

表3 免疫熒光各組大鼠膀胱ICC 細胞C?Kit、P2X2受體的陽性共表達量Tab.3 Positive expression of C?Kit and P2X2 receptor in ICC cells of rats in immunofluorescence groups ±s

注：與假手術組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01

組別假手術組模型組電針組抑制劑組F 值P 值例數15 15 15 15 C?Kit 與P2X2共表達量3.728±1.236 10.914±2.294**7.343± 0.941##6.178±1.278##15.264＜0.001

圖3 各組大鼠膀胱ICC 細胞免疫熒光雙標染色結果（×200）Fig.3 Results of ICC immunofluorescence double?label staining in each group（×200）

2.5 Western blot 檢測各組大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2蛋白相對表達量比較與假手術組比較，模型組TRPV1、C?Kit、P2X2蛋白表達水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2蛋白表達水平降低（P＜0.01）。見圖4、表4。

表4 各組大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2受體蛋白相對表達量比較Tab.4 Comparison of TRPV1，C?Kit and P2X2 receptor protein expressions in bladder tissues of rats in each group±s

表4 各組大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2受體蛋白相對表達量比較Tab.4 Comparison of TRPV1，C?Kit and P2X2 receptor protein expressions in bladder tissues of rats in each group±s

注：與假手術組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01

組別假手術組模型組電針組抑制劑組F 值P 值例數15 15 15 15 TRPV1 0.128±0.040 0.591±0.028**0.349±0.036##0.362±0.037##79.416＜0.001 C?Kit 0.179±0.031 0.517±0.034**0.279 ±0.019##0.302±0.045##71.656＜0.001 P2X2 0.167±0.034 0.560±0.048**0.274±0.024##0.269±0.031##90.679＜0.001

圖4 各組大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2受體蛋白電泳圖Fig.4 TRPV1，C?Kit and P2X2 receptor proteins in bladder tissues of rats in each group

3 討論

中醫電針療法在治療SCI 后泌尿系統疾病已取得了一定的進展，常選擇任、督脈及足太陽膀胱經上穴位，如“大椎”、“次髎”、“中極”、“三陰交”等［9］，其機制研究以細胞凋亡、神經營養因子、神經遞質及其受體調控為主。關聯規則分析顯示“中極”“關元”為針灸治療SCI 后NB 核心腧穴組合［10-11］，且臨床上多兩穴聯合使用治療泌尿系統相關疾病，但關于兩穴的機制研究尚未明確，本實驗從膀胱感覺功能著手，以膀胱逼尿肌為靶標，以TRPV1 及其下游信號通路為切入點展開研究。本實驗結果顯示電針“中極”、“關元”穴后大鼠行為學、尿流動力學和病理組織形態均有所恢復，說明該兩穴可有效改善逼尿肌反射亢進型大鼠尿失禁癥狀。

TRPV1 是一種Ca2+高滲透性的非特異性陽離子通道，病理狀態下，TRPV1 受體被各種炎性遞質和蛋白激酶C 等磷酸化而過度活化，通道開放大量Ca2+內流，胞內陽離子增多，引起神經元及其纖維釋放肽類物質，誘導神經炎癥產生，傳入沖動增加［12］。在泌尿道，TRPV1 表達于初級感覺傳入神經纖維、膀胱尿路上皮和平滑肌細胞中，促進膀胱充盈期間的傳入神經反應，感受膀胱擴張感覺［3］。研究發現SCI 引起逼尿肌過度活動時，膀胱尿路上皮細胞中的TRPV1 通道表達增加［13］。Capsazepine是感覺神經元興奮性毒素TRPV1 的競爭性拮抗劑，可阻斷電壓激活的鈣通道，使感覺神經元脫敏、失活，減小離體膀胱對膀胱內容量負荷的收縮反應［14］，這表明TRPV1 在膀胱感覺功能中起到了重要作用，介導了SCI 后NB 的發生。本實驗中，模型組大鼠膀胱組織中TRPV1 蛋白表達明顯高于假手術組，表明SCI 可上調膀胱TRPV1 表達，激活TRPV1 通路，導致膀胱機械感受功能被激活。給予電針干預、抑制劑灌注后，電針組和抑制劑組大鼠膀胱組織中TRPV1 蛋白表達水平較模型組均顯著降低，提示電針療法的治療作用可能與TRPV1信號通路活性的抑制有關。

固有層Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）是神經調控膀胱平滑肌的“信號中轉站”、“起搏細胞”，ICC 細胞上可表達多種神經受體亞型［15-16］。膀胱神經釋放的神經遞質、肽類物質與ICC 細胞上的神經受體結合后，介導Na+和Ca2+的非選擇性陽離子內流以及K+外流，啟動細胞去極化，進一步誘導平滑肌細胞收縮［17］。嘌呤能P2X2作為TRPV1 通道下游相關因子及ICC 細胞受體在膀胱的感覺和運動方面發揮著重要作用［18］。研究發現P2X2受體的阻滯可顯著抑制膀胱肌條的收縮，降低膀胱壓力和骨盆神經放電，增加有效排尿收縮時間，減少脊髓反射缺陷引起的逼尿肌過度活動［19-20］。本實驗免疫熒光雙標染色顯示膀胱ICC 細胞標志物C?Kit 與P2X2受體共表達于膀胱平滑肌肌束邊緣，且膀胱組織中C?Kit、P2X2受體蛋白表達與TRPV1 表達趨勢一致，分析其作用機制是電針通過抑制膀胱組織中TRPV1 過表達，對TRPV1 通道產生抑制效應，神經元敏感性不足導致Ca2+離子滲透性降低使膀胱上皮ATP 釋放減少，激活膀胱黏膜下層感覺傳入神經纖維上的嘌呤能P2X2受體表達的能力減弱，ICC 細胞收縮頻率相應減少，從而改善逼尿肌和尿道外括約肌的協調性，減少膀胱壓力，增加膀胱容量，提高膀胱順應性。

綜上所述，電針或許是通過抑制TRPV1 通道使膀胱內的生理活動和神經遞質發生改變，減少平滑肌收縮頻率，改善膀胱功能。這不僅為電針對SCI 后NB 的臨床治療提供了新的理論支持與可行思路，也在一定程度上豐富了中醫治療膀胱功能障礙的科學依據，但電針對TRPV1 通道周圍膜電勢的具體機制有待進一步研究。