金屬有機骨架載體固定化生物酶的研究進展

張 帥，王 悅，王 艷，趙 寧，張 娜，辛嘉英

（哈爾濱商業大學，食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076）

金屬有機骨架（Metal-Organic Frameworks，MOFs）是由金屬中心與有機配體通過配位作用自組裝形成的一類具有周期性多維網絡結構的多孔晶態材料[1]。作為一種新型生物固定化載體材料，MOFs引起眾多研究者的極大興趣[2?3]。近年來，MOFs材料在吸附、催化、生物傳感、氣體儲存等多個技術領域均有廣泛的應用前景[4?8]。生物酶作為一種高效、綠色的生物催化劑，它的存在大大提高了反應速率，而且在反應過程中自身還不會產生損耗[9?10]。但在工業生產過程中經常面臨生物酶的化學穩定性差、儲存條件要求苛刻、回收困難和不可重復使用等問題[11?12]。Wang等[13]將生物酶固定在MOFs材料的表面或空腔中形成固定化酶則可以有效地解決這些問題，生物酶通過MOFs固定化后具有高穩定性、較強的選擇性、易于分離等性質；同時，固定化后的生物酶還可以循環使用，降低了生產成本。該方法在化學、生物、農業和醫藥等領域均得到廣泛應用[14?16]。

本文擬闡述MOFs載體固定生物酶合成方法的研究現狀，通過分析MOFs-生物酶復合材料的特性及應用，加深研究者對MOFs載體固定化生物酶的了解，為后續開發研究和在生物與醫藥行業的應用提供可靠的理論參考。

1 MOFs載體固定化生物酶的合成方法

生物酶固定化可以通過同時形成和固定在MOFs載體中實現，也可以通過物理相互作用或化學鍵合將酶固定到預合成的MOFs載體上。這些固定化方法可分為四類（圖1）：表面吸附、共價結合、孔道包埋和原位合成。

1.1 表面吸附

表面吸附是生物酶固定化方法中最重要和應用最廣泛的方法之一[17]，發生在MOFs的配體與蛋白質的游離氨基、羧基之間，或是帶正電荷的MOFs金屬基團與帶負電荷的蛋白質之間（圖1A）。MOFs通過物理相互作用如π-π堆積作用、疏水作用、靜電作用力、范德華力、電荷相互作用和分子相互作用等將生物酶緊緊吸附在表面達到共固定化的效果[11]。

2006年Psklak等[18]首次嘗試將MOFs材料應用于固定化酶技術；而后，Liu等[19]提出的“固定化平臺”理論引起了研究人員對MOFs材料表面接合酶方面的深入研究，并進一步細化到固定化一種工業上常見的胰蛋白酶（Trypsin）。Li等[20]利用MOFs材料的孔隙對小分子的獨特容納能力和對生物大分子的高效傳遞效率，將胰蛋白酶吸附于含有金屬有機骨架CYCU-4[Al（OH）（SDC）]和MIL-101的表面，固定化后的胰蛋白酶活性和穩定性顯著提高。Cui等[21]將假絲酵母脂肪酶（CRL）固定化在MOFs材料NH2-MIL-88B外表面并與磁性Fe3O4結合，通過用碳二亞胺（EDC）活化脂肪酶的羧基，在NH2-MIL-88B表面與配體上暴露的氨基結合，磁性Fe3O4在該過程中起到促進CRL-NH2-MIL-88B分離的作用。研究表明，CRL-NH2-MIL-88B催化載體的效率比游離CRL高69%。Liu等[22]采用直接物理吸附法將豬胰脂酶（PPL）固定在微孔MOFs上，這些MOFs包括UiO-66（Zr）、UiO-66NH2（Zr）、MIL-53（Al）等；他們首先將新合成的MOFs浸泡在甲醇和二甲基亞砜的PPL溶液中，然后渦流混合1 h，最后離心5 min得到PPL@MOF粉末；通過傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）、X射線衍射儀技術（XRD）和掃描電子顯微鏡（SEM）等結構表征證實了PPL成功地吸附在MOFs上，并且具有良好的穩定性和結晶度（圖2）。表面固定化作為酶固定化中最簡單的方法，在開發生物電極和生物傳感器的研發等領域普遍適用[23]，但不足的是生物酶與MOFs載體的結合力較小，如果外界環境發生變化，容易導致生物酶從MOFs載體上分離脫落。

圖2 豬胰脂酶（PPL）通過表面吸附固定在微孔MOFs示意圖[22]Fig.2 Schematic diagram of porcine pancreatic lipase(PPL)immobilized on microporous MOFs by surface adsorption[22]

1.2 共價結合

雖然生物酶可以通過表面固定化法有效地附著在MOFs表面，但是僅僅通過MOFs和生物酶分子之間的弱相互作用形成的固定化酶穩定性較差，MOFs表面的共價結合酶可提高穩定性以及可回收性[24]。目前共價結合法可以分為兩種：一種是不同MOFs表面有多種官能團（如：氨基、羥基、羧基等），它們通過共價鍵將生物酶連接在MOFs表面（圖1B）；另一種是，首先MOFs載體內的有機連接體通過ππ堆積作用與一些小分子（如染料分子）結合，生物酶再通過氫鍵與作為錨定分子的染料結合[25]。由于染料分子可以滲透到MOFs的微孔中，生物酶分子懸浮在MOFs的表面即構成了生物酶和MOFs的共價結合。

圖1 MOFs載體固定化生物酶的四種合成方法Fig.1 Four synthetic methods of immobilized biological enzymes on MOFs carrier

Cao等[26]通過共價鍵結合的方式將制備的功能化金屬有機骨架UiO-66-NH2與大豆環氧化物水解酶（SEH）混合后，添加到100%飽和硫酸銨溶液內，4 ℃磁力攪拌30 min使大豆環氧化物水解酶沉淀，然后注入適量的25%戊二醛（GA）并攪拌可將大豆環氧化物水解酶（SEH）交聯到功能化UiO-66-NH2上（圖3）；經對比，固定化SEH比天然SEH具有更高的穩定性，在儲存穩定性研究中，SEH/UiO-66-NH2在4周后顯示出其原始活性的97.5%；然而，研究發現由于反應需要添加大量的交聯劑和活化劑，同時劇烈的固定化條件（如：高速攪拌）均對大豆環氧化物水解酶的活性造成影響。Liu等[19]首次通過生物酶-染料標記機理的研究，將胰蛋白酶（Trypsin）與含有CYCU-4[Al（OH）（SDC）]和MIL-101的MOFs結合并與染料異硫氰酸熒光素（FITC）混合，獲得胰蛋白酶@MOFs共價結合體，證實酶分子與染料結合后，能夠進入MOFs的微孔中實現生物酶的固定化。Mohamad等[27]利用4-氯-7-硝基苯并呋喃（NBD）染料的分子尺寸與金屬有機骨架（UiO-66）的微孔尺寸相匹配的特點，將NBD用于UiO-66載體固定化胰蛋白酶（Trypsin）；NBD染料附著在胰蛋白酶表面使酶穩定性顯著提高，同時，NBD還可使UiO-66表面結合位點增多，因此UiO-66 負載酶能力增加，UiO-66負載Trypsin-NBD的量達到80 μg/mg；此外，NBD染料與胰蛋白酶共價結合使染料具有特定的熒光發射，通過檢測產物的熒光強度可直接評價回收固定化酶的性能，但Trypsin的活性位點因變形導致活力下降。綜上所述，共價結合方法提高了生物酶的穩定性，減少生物酶在反應過程中的泄漏，達到固定化酶的效果；但是，存在使用前需要繁瑣的活化程序、MOFs與生物酶分子共價結合需要劇烈的固定化條件等問題，將會制約共價結合方法在工業催化領域的應用。

圖3 大豆環氧化物水解酶（SEH）通過共價結合固定在UiO-66-NH2示意圖[26]Fig.3 Schematic diagram of soybean epoxide hydrolase （SEH） immobilized on UiO-66-NH2 by covalent bonding[26]

1.3 孔道包埋

由于MOFs的孔隙尺寸可以被合理地調節，調節后的MOFs的孔徑一般比生物酶的直徑大，生物酶就很容易地擴散到MOFs的孔中實現生物酶的共固定化（圖1C）。根據MOFs的金屬結構該固定化方法可以分為兩種：生物酶被包埋在未修飾的MOFs中，或包埋在使用致孔劑輔助修飾的MOFs孔中。Tsuruoka等[28]將微過氧化物酶-11（MP-11）固定化在具有較大的孔徑（3.9 nm×4.7 nm）的MOFs材料介孔中構建MP-11@MOFs，用于催化H2O2氧化3,5-二叔丁基鄰苯二酚生成鄰醌（圖4）；結果表明，與游離MP-11和MOFs相比，MP-11@MOFs復合材料具有較高的反應速率和轉化率，通過傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）、X射線衍射儀技術（XRD）和掃描電子顯微鏡（SEM）等結構表征證實MP-11在MOFs孔道存在擴散運動。然而，MOFs載體的孔道只能包埋一些分子量較小、形狀規則的生物酶，并且MOFs的微孔尺寸與生物酶分子的直徑匹配度低，使得孔道包埋的方法應用范圍縮小。因此，MOFs材料作為固定化酶的載體應用到工業生產領域仍然受限制。

圖4 MP-11的分子結構（A）和3,5-二叔丁基鄰苯二酚氧化生成鄰醌的反應流程（B）[28]Fig.4 Molecular structure of MP-11（A） and reaction process of oxidation of 3,5-di-tert-butyl catechol to o-quinone （B）[28]

1.4 原位合成

目前大多數MOFs的孔徑小于生物酶的孔徑，生物酶不能通過擴散的方法進入到MOFs孔隙內。為實現在MOFs框架內包封大型生物酶的需求，研究人員針對MOFs內生物酶的原位合成方法進行深入研究[29]。原位合成方法的特點是生物酶的成核和MOFs的形成發生在同一時間（圖1D），并且生物酶不在MOFs的微孔或通道中而是被MOFs的骨架包圍。

范錚等[30]開發了一種超大介孔穩定的MOFs陣列，用于包封微過氧化物酶（MP-11）、辣根過氧化物酶（HRP）和細胞色素C（Cytc），包封后的生物酶具有可回收性和高催化效率。為提高酶活性和整體催化效率。Chen等[31]引入DNA作為交聯劑將葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根過氧化物酶（HRP）制成雙酶體系GOx&HRP@DNA，將其與硝酸鋅溶液和2-甲基咪唑混合，25 ℃攪拌30 min成功將GOx和HRP封裝在沸石咪唑酯骨架（ZIF-8）中構成GOx&HRP@DNA/ZIF-8（圖5），該方法能有效抑制生物酶從MOFs骨架中浸出，浸出量比傳統方法低10倍以上。綜上所述，以MOFs為骨架的生物酶的原位包封，可以使更大的蛋白分子達到固定化效果。然而，MOFs的微孔結構卻限制了底物分子與MOFs骨架內的酶接觸，為了避免酶失活變性，誘導MOFs生長過程必須保證在溫和條件下進行[32]。

圖5 GOx和HRP被封裝在沸石咪唑酯骨架（ZIF-8）構成GOx&HRP@DNA/ZIF-8示意圖[31]Fig.5 GOx and HRP encapsulated in the zeolite imidazole ester framework （ZIF-8） to form GOx&HRP@DNA/ZIF-8 schematic diagram[31]

2 MOFs-生物酶復合材料的特性

2.1 提高催化活性

與游離酶相比，MOF-生物酶復合物材料表現出更強的催化活性。當生物酶暴露在極端環境或有機溶劑中，生物酶本身的結構會發生變化，同時生物酶活性位點變形導致活力下降[33]。MOFs可以為生物酶分子構建穩定的微環境維持酶的生物活性，有效防止生物酶分子的聚集。固定在MOFs材料上的生物酶會更加穩定，生物酶活性的損失降低，也提高生物酶對惡劣環境的耐受性[34]。2006年，Feng等[35]首次對微過氧化物酶-11（MP-11）在Cu-MOFs中的擴散進行研究，一方面，由于Cu-MOFs的比表面積為1260 m2/g，平均孔徑為1.78 nm，適合MP-11的擴散；另一方面，MP-11可以通過擴散包埋到Cu-MOFs介孔中；結果表明，固定化后的MP-11具有較高的酶催化性能。

2.2 提高穩定性

當生物酶暴露在極端的pH、溫度或有機溶劑中時，就會發生酶變性。MOFs通過在生物酶和載體之間形成新的化學鍵，為生物酶提供保護環境，使固定化酶在較高溫度下仍然保持穩定[36]。Lin等[37]使用N,N'-二環己基碳二亞胺（DCC）將MOFs材料MIL-101（Cr），MIL-88B（Cr）和MIL-88B-NH2（Cr）激活，激活后表面成的肽鍵可與胰蛋白酶（Trypsin）緊密結合，通過共價鍵合制備出胰蛋白酶（Trypsin）-MOFs復合材料；結果表明，Trypsin-MOFs復合材料在極端條件下表現出前所未有的高穩定性，如將胰蛋白酶溶液置于沸水（100 °C）煮沸1 h后，酶的活性和底物選擇性未受到影響，酶活性遠高于游離胰蛋白酶，這個結果對于酶固定在其他材料上所展現的高穩定性是前所未有的。

2.3 提高可重復使用性

盡管生物酶在催化過程具有高效性和選擇性，但惡劣的生產條件下酶可能會發生變性，從而降低了其催化性能和長期可回收性。由于MOFs結構剛性和優異的穩定性能阻止生物酶從金屬有機骨架中浸出，故可提高酶的可回收性，減少產品中的酶污染，并且使反應的催化效率得到改善[2]。與游離酶相比，固定化酶最大的優勢之一是其可循環利用，這大大降低了生產成本[38]。以金屬有機骨架為載體固定化生物酶的合成方法極大地促進了復合材料的生產和發展，MOFs-生物酶復合材料將在工業催化和生物催化中得到廣泛的應用。

2.4 其他

酶的固定化可以通過將酶限制在具有保留的酶活性的特定空間中來以低成本的方式提高酶的穩定性、可回收性和回收率。傳統固定化酶常見的載體為顆粒[39]、水凝膠[40]、氧化石墨烯[41]、碳納米管[42]、中孔二氧化硅[43]和聚合物[44]等。將生物酶固定在這些材料上不可避免地出現了低負載率、變性等問題。由于MOFs具有大表面積和孔隙尺寸可調節等特性[45]，使MOFs材料可以裝載大量的生物酶，負載能力強；并且通過調節不同孔隙的MOFs對反應底物和產物進行尺寸及形狀的篩選，使催化反應效率得到顯著提高[46]。因此，MOFs-生物酶復合材料可以保持生物酶的完整性和活性，具有較大的研究價值。但是，由于MOFs環境信號的干擾，測定MOFs-生物酶復合材料中生物酶的取向一直是一大難題；同時，生物酶直接進入MOFs的孔隙中易引起生物酶的結構發生變化，致使酶活性降低[47]。因此，以MOFs為載體固定化生物的合成方法有待研究人員進一步優化。

3 MOFs載體固定化生物酶的應用

3.1 構建微反應器

目前，許多研究人員使用MOFs材料固定生物酶以維持生物酶的穩定性，通過構建多酶催化的高性能仿生反應器完成高效催化反應。Wang等[48]通過原位合成法將葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根過氧化物酶（HRP）嵌入沸石咪唑酯骨架（ZIF-8）構成的納米金屬有機框架材料（NMOF）中構成NMOF微反應器（NMOF@GOx/HRP）（圖6）；GOx催化葡萄糖（Glucose）與氧氣反應生成葡萄糖酸（Gluconic acid）和過氧化氫（H2O2），同時HRP催化產物H2O2生成H2O和O2，并催化H2O2與熒光紅染料（Amplex Red）產生強烈的紅色熒光物質試鹵靈（Resorufin），通過FTIR、XRD和SEM等結構表征證實GOx和HRP成功地固定在（ZIF-8）NMOF內，并且封裝在NMOF中的GOx或HRP比封裝前保留了>90%的酶活性。Zou等[49]成功構建一個雙酶微反應器，通過仿生礦化將胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）封裝在金屬有機骨架（ZIF-90）框架中，然后將胰蛋白酶（Trypsin）共價吸附在ZIF-90的外表面。與溶液消化相比，微反應器具有更高的穩定性（如：熱穩定性、pH穩定性等）。因此，通過改變生物酶的類型可設計出用于多酶催化的高性能仿生反應器，能夠進一步開發生物大分子在催化反應中的巨大潛力。

圖6 GOx和HRP封裝在（ZIF-8）NMOF的雙酶級聯反應示意圖[48]Fig.6 Schematic diagram of the two-enzyme cascade reaction of GOx and HRP encapsulated in ZIF-8[48]

3.2 生物傳感與檢測

近年來，基于固定化酶生物傳感的制備與檢測，在臨床診斷、食品監測和質量檢查等領域引起廣泛關注。葡萄糖是維持生物體生命、促進生物體生長必須的一種營養成分，準確測定葡萄糖含量對于糖尿病等疾病的治療和工業生產的調控具有重要意義[50]。Qiu等[51]利用共價鍵將葡萄糖氧化酶（GOx）和過氧化物酶（POD）固定化在MOFs材料MIL-101（Al）-NH2表面制備出一種葡萄糖比色生物傳感器，可催化葡萄糖生成葡萄糖酸（gluconic acid）和H2O2，同時催化產物H2O2與3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（TMB）發生顯色反應，通過顏色變化測定溶液中葡萄糖的濃度，該葡萄糖比色生物傳感器線性范圍在10~1000 μmol/L；將比葡萄糖濃度高3倍的果糖、乳糖和麥芽糖作為對照組，對研發的傳感器進行特異性測試，未得到明顯的檢測信號，說明該生物傳感器對于葡萄糖具備較高的選擇性。Amarajothi等[52]將GOx固定在MOFs材料[MOF-545（Fe）]上構建GOx@MOF-545（Fe）（圖7），有氧條件下催化葡萄糖與（2-乙基苯并噻唑啉）-6-磺酸鈉（ABTS）反應生成ABTS+，檢測限低（0.28 μmol/L），特異性強，也可用于葡萄糖的快速檢測；此外，GOx@MOF-545（Fe）在貯藏7 d后仍保持其原有活性的92%，而在類似條件下游離酶的活性僅保持40%，說明該固定化酶提高其原有游離酶的穩定性。

圖7 GOx通過表面吸附制備 GOx@MOF-545（Fe） 應用于葡萄糖檢測示意圖[52]Fig.7 Schematic diagram of GOx prepared by surface adsorption GOx@MOF-545（Fe） and applied to glucose detection[52]

3.3 藥物輸送與靶向治療

MOFs大表面積和高孔隙率的特點使其具有高負載能力。目前，被廣泛用于各種生物醫學應用，如藥物輸送[53]、臨床腫瘤監測及治療[54]等。腫瘤細胞的快速增殖過程需要消耗大量的葡萄糖，葡萄糖氧化酶（GOx）可以催化葡萄糖產生葡萄糖醛酸（gluconic acid）和過氧化氫（H2O2），研究人員基于該原理研發出一種饑餓性協同癌癥治療方法，引入GOx用于抑制癌細胞快速增長。Zhang等[55]通過將GOx和前藥替拉扎明（Tirapazamine，TPZ）封裝在紅細胞膜包裹的MOFs納米粒子中，研制了一種仿生納米反應器；該仿生納米反應器可以將GOx輸送到腫瘤細胞，并耗盡腫瘤細胞內的葡萄糖，有效阻斷腫瘤營養供應。Zhang等[56]將具有類過氧化氫酶活性的鉑（Pt）納米酶固定在MOFs材料Zr基卟啉（PCN-224）內，成功制備了一種新型的納米復合材料PCN-224@Pt（圖8），此時PCN-224@Pt具有高穩定性和良好的過氧化氫酶活性，能分解腫瘤內H2O2并在腫瘤內原位生成O2，利用其產生的細胞毒性1O2對癌細胞造成嚴重損傷。酶激活前藥療法（Enzyme Activation Prodrug Therapy，EAPT）是一種廣泛使用且有效的癌癥治療方法，通過將前藥轉化為藥物，其關鍵步驟是前藥激活，比常規化療法具有更好的選擇性，并且對人體傷害性降低[57]。由于PCN-333納米顆粒具有較高的酶包埋能力，易被熒光團修飾，化學性質穩定性等特點。Lian[58]將其作為生物酶載體，用于實現腫瘤特異性前藥激活。選擇酪氨酸酶（TYR）作為激活酶，并將其裝載在PCN-333納米顆粒（NPCN-333）中，形成一種納米酶復合反應器TYR@NPCN-333。細胞毒性來自對乙酰氨基酚（APAP）的酶促轉化產物4-乙酰氨基-鄰-苯醌（AOBQ），TYR@NPCN-333通過產生活性氧（ROS）和消耗谷胱甘肽（GSH），可持續激活癌細胞中的前藥APAP。結果表明，無毒前藥APAP可以被TYR@NPCN-333有效激活，產生細胞毒性化合物，抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡。用TYR@NPCN-333和APAP治療后，腫瘤體積消退了2.5倍，故在藥物輸送與腫瘤靶向治療方面，更加高效，對人體的傷害性更低。

圖8 PCN-224-Pt的制備用于分解腫瘤內H2O2抑制腫瘤細胞生長示意圖[56]Fig.8 Preparation of PCN-224-Pt used to decompose the H2O2 in the tumor and inhibit the growth of tumor cells[56]

4 結論與展望

作為穩定性強、高效的固定化酶的載體，金屬有機骨架MOFs使生物酶的穩定性、催化活性、可回收性等得到顯著提升，構建的MOFs固定化酶復合材料在不同領域應用均體現出它獨特的優勢。但同時MOFs載體固定化生物酶也存在一些待解決的問題：其一，絕大多數MOFs材料在極端的條件下（如溶劑、pH等）性質不穩定，嚴重阻礙它們在實際條件下作為酶固定化載體的應用。其二，由于MOFs的微孔尺寸與生物酶分子的直徑不匹配，使MOFs材料作為固定化酶的載體應用到生產領域仍然受限制。其三，由于生物酶不能通過擴散的方法進入到MOFs孔隙內，其直接進入MOFs的孔隙中易引起酶的結構變化，使酶活性降低。今后，希望致力于提高MOFs的結構穩定性和適用性方面的研究，開發、設計新型MOFs材料以固定不同種類的生物酶，并向一次催化多種反應的MOFs固定化酶方向發展。