玉米多肽制備方法及其功能活性研究進展

李云亮，王曉靜，阮思煜，劉曉霜，徐雅宣，黃姍芬，馬海樂

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013）

玉米是世界上不可缺少的糧食作物和經濟作物[1]，也是我國傳統的農作物。玉米蛋白粉是玉米籽粒濕磨法生產淀粉中的副產品，也稱為玉米黃粉、玉米麩質粉，含有大量的蛋白質、淀粉、纖維素等營養物質，粗蛋白含量約占60%，其中玉米醇溶蛋白約為68%，谷蛋白約為28%，還有極少量的球蛋白和白蛋白[2?3]。但由于玉米蛋白粉水溶性差，且缺少人體必需的賴氨酸和色氨酸，導致其生物利用率低，長期以來主要作為廉價飼料原料或當作廢棄物向環境中排放，造成資源浪費、環境污染等問題[4]。

為提高玉米蛋白粉的附加值，以玉米蛋白粉為原料，利用現代生物技術改變蛋白質的結構解決其水溶性差的問題，用以制備多種生物活性肽，對發展新食品資源、保護環境具有重要意義。此外，類蛋白反應在修飾蛋白質、改善蛋白功能性方面展現出巨大的優勢，目前是學者研究蛋白質的新熱點[5?6]，該反應可以將限制性氨基酸補充到多肽中，提高蛋白質的營養價值[7]。國內外關于類蛋白的研究很多，但關于改造玉米蛋白的類蛋白反應研究較少，國內有學者[8]將玉米蛋白和大豆蛋白進行類蛋白反應，生成的物質同時具有玉米蛋白和大豆蛋白中的所有氨基酸，該研究為今后利用類蛋白反應改善玉米蛋白的生物效價和功能特性，綜合利用玉米資源提供了新思路。

玉米多肽是玉米蛋白粉的水解產物，具有營養豐富、食用安全性高、易于消化吸收等特點[9]。目前，利用蛋白酶的特異性水解玉米蛋白粉是比較通用的制備玉米多肽的方法，此外，化學降解和微生物發酵也是玉米多肽的制備方法。已有研究發現玉米多肽具有多種生物活性功能，如抗氧化、降血糖、降血壓、醒酒護肝等[10]，擁有很大的開發潛力。本文重點介紹了玉米多肽的制備和生物學功能兩方面的研究現狀，并提出了現有研究的問題及未來的發展前景，對當前玉米淀粉加工企業轉型優化升級，利用玉米蛋白粉開發高附加值玉米生物活性肽產品，提升行業經濟效益、促進科技進步具有重要意義。

1 玉米多肽的制備

1.1 蛋白酶解法

蛋白酶解法是利用酶的特異性，與底物在溫和的條件下進行反應，不僅能在特定的環境中通過定位水解蛋白質形成目標肽類，而且也能更有效地控制其水解程度，更好地滿足實際的生產要求。

酶解法包括單一酶解法和復合酶解法。于亞莉等[11]以玉米胚芽粕醇溶蛋白為原料，分別采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶水解玉米胚芽粕蛋白，結果發現堿性蛋白酶的酶解產物抗氧化活性最好，是制備抗氧化肽的最佳蛋白酶。李艷娟等[12]采用復合酶解法制備玉米多肽，將堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶按1:1比例混合后酶解玉米胚蛋白，在最佳酶解條件下制備的玉米多肽還原力為0.299，水解速率較單一酶解法快。Wang等[13]提出了用海藻酸鈉-殼聚糖載體固定化雙酶制備玉米活性肽的新方法，該方法制得的玉米多肽具有良好的抗氧化能力，在乙醇溶液中，玉米蛋白中的醇溶蛋白更易溶解到反應體系中，水解度高于常規方法，該研究對玉米多肽的制備和工業應用十分有價值。

酶解法因其優點、多肽得率高而越來越受關注，近年來，超聲、微波等物理加工手段也用于輔助酶解制備玉米活性多肽[14?15]。趙鳳影等[16]在用酶解法制備玉米抗氧化多肽時，將玉米蛋白粉加水溶解后，先用微波預處理2 min，晾涼后再加入堿性蛋白酶進行水解，此操作可以有效提高玉米蛋白的水解度，縮短水解時間，通過實驗設計得到微波協同酶解法制備玉米多肽的最佳工藝條件為：微波功率400 W，微波時間2 min，酶添加量為9000 U/g，酶解時間2.5 h，溫度45 ℃，pH為8.9。Zhou等[17]證明了單頻超聲預處理玉米蛋白粉，酶解反應速率比未進行超聲預處理的對照組提高了10.98%。王珂等[18]發現超聲波預處理玉米胚芽蛋白可以顯著提高產物多肽的轉化率和ACE抑制活性，使用其實驗室自主研發的聚能逆流雙頻、發散三頻和雙頻超聲設備預處理玉米胚芽粕，得到最佳超聲工作模式為20/40 kHz交替雙頻聚能逆流式超聲，通過優化超聲預處理參數得到最佳酶解條件，此條件下蛋白轉化率和產物多肽的ACE抑制活性均高于未超聲預處理組。然而，大多數研究都是在酶解前利用超聲對玉米蛋白粉進行預處理，而鮮少將超聲處理與酶解過程同步進行，因此Qu等[19]引用固定化酶技術，研究了三頻超聲同步酶解處理對玉米蛋白粉性能、動力學和熱力學的影響，結果表明，在最佳條件下，與未經過超聲的對照組相比，三頻超聲處理后的水解度、肽濃度、ACE抑制活性和相對酶活性分別提高了20.6%、34.4%、24.1%和25.8%。但是目前尚未有研究表明，超聲、微波等物理加工手段用于輔助制備玉米多肽時，與酶解過程同步操作和酶解前預處理操作兩者哪個效果更佳。

1.2 微生物發酵法

微生物發酵法是指在微生物發酵生長過程中，利用其產生的微生物蛋白酶系直接降解蛋白質，制備玉米多肽。此方法與傳統酶解方法相比，可以有效降低玉米多肽的苦味，簡化操作流程，降低生產成本。牟金秀[20]采用微生物發酵法制備玉米多肽，從玉米加工廠附近的土壤中分離出發酵菌種枯草芽孢桿菌，對其進行馴化后證實該菌種能夠生產玉米多肽，最佳發酵時間為85 h，并且在最佳水解條件下玉米多肽的得率可達23%，高于最初轉化率。祁尼娜等[21]利用納豆桿菌，在對玉米黃粉進行堿性預處理后，發酵制得玉米多肽，肽轉化率為22.06%。陳丹陽等[22]利用枯草芽孢桿菌發酵玉米黃粉制得玉米多肽，對發酵參數進行優化后，獲得的可溶性玉米多肽的含量提高了13.3倍，該多肽中分子質量小于1000 Da的低聚肽占有76.36%，具有較高的抗氧化性。Jiang等[23]以玉米蛋白粉為原料，用枯草芽孢桿菌固態發酵生產生物活性肽，在優化的發酵條件下，每克初始干玉米蛋白粉可獲得玉米多肽的量最高達到369.4 mg，通過注射D-半乳糖建立的大鼠衰老模型證實，該玉米多肽具有很好的體內抗氧化能力，此研究為固態發酵最大限度生產玉米多肽提供了數據參考。

目前微生物發酵法生產玉米多肽的技術缺陷在于，微生物在培養過程中會利用一部分的多肽用于自身的新陳代謝造成多肽得率無法進一步提高，某些微生物的氨基酸脫氨酶的活性較高會產生較大的異味，所以該技術對微生物菌種的選擇依賴性較大，國內使用此方法制備玉米多肽的研究較少，因此從自然界中篩選或者定向進化出優良發酵菌株的研究具有重要意義。

1.3 其他方法

化學降解法又稱酸堿降解法，是在酸堿條件下對蛋白質進行水解，雖然工藝簡單，但是反應過程不易控制。因該方法過程中使用的酸堿容易破壞玉米蛋白本身的營養成分，而且可能會產生類似Lys-Ala的有毒物質[24]，所以該方法較少使用，目前已有研究發現亞臨界水可作為一種新的樣品處理技術制備玉米多肽。

亞臨界水是指比水臨界溫度（374.2 ℃）和臨界壓力（22.1 MPa）稍微低一些的低溫壓下成液體狀態的水，與普通的水相比，亞臨界水具有酸、堿催化劑的催化功能，可以作為一種綠色高效的提取溶劑，用于提取原料中的多肽和蛋白質，同時，亞臨界水的性質隨溫度和壓力不同而發生相應變化，可以調節控制提取過程[25?26]。陳晉陽[27]利用亞臨界水的高活性制備玉米多肽，將玉米渣和去離子水加到水熱高壓反應釜中水解，水解完成后抽濾得到多肽水解液并進行脫色處理，脫色后的多肽水解液再經超濾分離、濃縮干燥即可得到玉米多肽，多肽得率最大可達到34%。這種方法在只加入水的條件下即可短時間（一般在1 h以內）水解制得玉米多肽，有效利用玉米資源，操作簡單且不會污染環境。因該方法是在高溫高壓狀態下操作，對設備及原料的要求較高，目前國內外利用該技術制備蛋白、多肽類物質的研究多集中于大豆蛋白[28?30]、核桃粕蛋白[31]等。

2 玉米多肽的生物學功能

2.1 抗氧化活性

玉米多肽的抗氧化活性主要是通過抑制生物大分子過氧化或清除體內羥基自由基·OH和超氧陰離子自由基·O2?等自由基產物而實現的[32]。Zhou等[33]證實了用微生物蛋白酶制備的玉米蛋白水解物可以有效抑制脂質氧化。Wang等[34]研究了玉米多肽的體外和細胞內自由基清除能力，發現不同分子量的多肽段均具有良好的羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基和氧自由基清除能力，對細胞均表現出明顯的保護作用和細胞內活性氧清除能力，而且小分子量的玉米多肽抗氧化活性高于大分子量的玉米多肽，通過MALDI-TOF/TOF質譜分析鑒定出一種抗氧化肽序列 Tyr-Phe-Cys-Leu-Thr，該序列對ABTS自由基清除能力良好，EC50值為37.63 μmol/L，遠低于抗氧化劑Trolox。此外，張淼[35]、胡佳麗[36]的研究也說明玉米多肽具有抗氧化活性，可以用作天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑。已有研究表明，腫瘤、關節炎、心腦血管病等多種疾病的發生都與過剩自由基損害有關，玉米多肽所表現的抗氧化活性，在應對人體老化現象的優勢已初步顯露，在未來的醫藥和食品工業中有重要意義。

2.2 降血糖活性

胰高血糖素樣肽-1（glucagons-like peptide-1，GLP-1）是由胰高血糖素基因表達，并由腸道L細胞分泌的一種肽類激素，具有促進胰島素的生物合成和分泌、抑制胰高血糖素的分泌、抑制食欲及攝食、延緩胃內容物排空等功能。利用這些功能，通過對清醒大鼠進行IP葡萄糖耐量試驗（IPGTT），將玉米蛋白水解物注射入大鼠回腸中，刺激大鼠腸道L細胞分泌GLP-1，證明了玉米蛋白水解物對葡萄糖引起的高血糖有明顯的抑制作用[37]。另外，Higuchi[38]研究了口服玉米醇溶蛋白是否可以通過刺激GLP-1和葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）分泌來改善葡萄糖耐受性，對正常雄性大鼠和糖尿病模型大鼠進行了IPGTT，發現正常雄性大鼠口服玉米醇溶蛋白可顯著抑制血糖反應，同時血漿GLP-1和GIP水平立即升高，口服玉米醇溶蛋白也能誘導糖尿病模型大鼠的GLP-1分泌和降低血糖反應，即在正常和糖尿病情況下，口服玉米醇溶蛋白均可通過刺激腸促胰島素分泌來降低血糖。這些研究表明，玉米多肽具有明顯的降血糖作用，口服類降血糖產品一直有巨大的市場需求，未來可用于研發具有降血糖功能的玉米多肽產品。

2.3 降血壓活性

近年來，高血壓已成為世界上最常見且最嚴重的慢性健康問題之一，并伴有腦血管、心臟和腎臟衰竭等并發癥，最常見的降壓作用機制是抑制血管緊張素轉化酶（Angiotension Converting Enzyme，ACE）的活性，一些ACE抑制劑如卡托普利、依那普利、賴諾普利等對降低血壓有明顯效果，但同時有一定程度的毒副作用，引發頭疼、味覺異常、肝臟損失等問題[39?40]。

大量研究表明，玉米蛋白水解物含有的多肽類物質可以抑制體內ACE的活性從而達到降低血壓的目的，是很好的ACE抑制劑，且與人工合成的ACE抑制劑相比，具有安全、無毒副作用等特點[41?42]。早在1993年就有日本學者[43]發現從α-玉米醇溶蛋白酶解物中得到的三肽（Leu-Pro-Pro）具有顯著的ACE抑制活性，其作用效果與降血壓藥物卡托普利相當，在此之后越來越多人關注玉米多肽的降血壓活性。王麗萍[44]以食用玉米蛋白為原料酶解得到活性多肽，發現與其他蛋白水解物相比，玉米蛋白水解肽對ACE的抑制作用更明顯，而且雜質少、制備工藝簡單。李世敏等[45]研究了玉米多肽對原發性高血壓大鼠的降血壓作用及其機制，發現從玉米蛋白分離出來的活性多肽經灌胃后均能顯著降低原發性高血壓大鼠的血壓，并且血液中的ACE活性、血管緊張素Ⅱ水平與降血壓程度呈明顯相關性，說明玉米活性多肽的降血壓作用是通過抑制體內ACE活性、降低血管緊張素Ⅱ水平完成的。梁秋芳等[46]在酶解玉米醇溶蛋白制備ACE活性多肽的研究中，鑒定出兩種玉米多肽，其氨基酸序列分別為Ala-Leu-Tyr、Phe-Tyr-Gln，通過模擬胃腸道消化和小腸內壁吸收后，該多肽仍具有良好的ACE抑制效果。這類具有抗胃腸蛋白酶消化的ACE抑制肽具有很好的應用價值。

2.4 護肝作用

玉米多肽因其具有良好的抗氧化能力，可以抑制肝臟細胞內的氧化應激，而且玉米多肽可以促進人肝細胞DNA的合成，加快細胞增殖分裂，提高細胞活力，一定程度上可以起到修復肝細胞、保護肝臟的作用[47]。

目前已有研究表明，玉米多肽在化學性肝損傷[48]、免疫性肝損傷[49]和酒精性肝損傷[50?52]等方面有明顯抑制效果。Yu等[53]研究了玉米多肽對四氯化碳（CCl4）致小鼠肝損傷的保護作用，經喂食玉米多肽的小鼠血清中的天冬氨酸轉氨酶與丙氨酸轉氨酶的活性和肝臟中丙二醛水平顯著降低，超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽水平顯著升高，生化檢查結果輔以肝臟切片的組織病理學檢查得出玉米多肽對減輕CCl4誘導的肝細胞損傷具有顯著的保護作用，其保護機制是由于玉米多肽具有的抗氧化能力和高F值（支鏈氨基酸與芳香族氨基酸含量的摩爾濃度比值）。Guo等[49]以玉米蛋白水解液為原料，研究了玉米多肽對卡介苗/脂多糖誘導的小鼠免疫性肝損傷的保護作用，結果表明，玉米多肽對卡介苗/脂多糖誘導的肝細胞損傷具有顯著的保護作用，玉米多肽的劑量為600 mg/kg bw時效果最佳，并指出玉米多肽保護肝臟的潛在機制可能是因為其抗氧化能力、清除自由基能力、降低NO生成和激活抗氧化酶的能力。Zhang等[54]和林兵等[55]通過對大鼠喂食玉米多肽，證實了玉米多肽對酒精性肝損傷具有一定的抑制作用。劉雪姣[56]針對玉米多肽的保肝活性，從細胞和動物水平深入研究了其作用機制，結果顯示玉米多肽能夠通過調節凋亡蛋白的表達，促進肝細胞增殖，并且通過影響肝細胞的能量代謝為細胞提供能量，由此保護肝臟健康。

此外魏康[57]建立了高脂食誘導的非酒精性脂肪肝損傷大鼠模型和高濃度果糖處理的肝細胞模型，發現玉米多肽可以有效降低模型中脂質堆積的情況，緩解肝損傷，對非酒精性肝損傷的預防效果優于治療效果，同時玉米多肽可以增強肝細胞的能量代謝和脂質代謝水平，抑制細胞凋亡，保護線粒體的功能完整性，以達到肝保護的作用。

2.5 醒酒作用

乙醇主要由乙醇脫氫酶代謝為乙醛，再由乙醛脫氫酶氧化為乙酸，乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶可以有效調節飲酒后血液中的乙醇和乙醛濃度，加快乙醇在體內的代謝，從而降低醉酒程度和解酒。Yamaguchi等[58]以玉米蛋白粉為原料制備玉米多肽，研究其對自發性高血壓大鼠酒精代謝的影響，結果發現玉米多肽可使大鼠血液中乙醇和乙醛含量降低。通過對成年男性攝食玉米多肽后酒精代謝的研究進而發現，攝食玉米多肽后血液中丙氨酸和亮氨酸的含量顯著升高，產生穩定的NAD+，即表明玉米多肽對血液中乙醇水平的升高有一定的抑制作用[59]。玉米多肽還可顯著激活小鼠肝臟中乙醇脫氫酶的活性，小鼠攝入的玉米多肽含量與體內乙醇含量存在明顯的劑量-效應關系，可以顯著抑制乙醇含量的升高[60?61]。Yu等[62]通過激活乙醇脫氫酶活性，研究玉米多肽促進乙醇代謝的能力，結果顯示，分子量小于1000 Da的玉米多肽，乙醇脫氫酶的體外活化活性最高，分子量低于5000 Da的玉米多肽，可以顯著降低小鼠血液中的乙醇濃度。Sun等[63]采用超濾法和Sephadex G-15對玉米蛋白酶解制備的混合水解物進行分離，并經反向高效液相色譜法進一步分離得到兩種玉米多肽，其氨基酸序列分別為Val-Leu和Gly-Met-Leu，通過灌胃實驗評價其在體內的酒精代謝活性，結果顯示，口服玉米多肽對預防急性酒精中毒有顯著效果，玉米多肽能加速酒精在肝臟中的代謝，減輕急性酒精中毒引起的氧化損傷，可作為急性酒精中毒的預防劑。

2.6 其他功能活性

除以上功能活性外，玉米多肽還具有其他方面的活性。玉米多肽具有抗疲勞和提高機體運動能力的功效，將玉米多肽灌胃到小鼠體中，可顯著提升小鼠肝糖原含量、降低血漿尿素氮含量和延長小鼠負荷游泳時間[64]。玉米多肽具有抗炎活性[65]，可以顯著降低炎癥因子TNF-α誘導的Caco-2細胞產生引起的環氧化酶-2、誘導型一氧化氮合酶和促炎癥細胞因子IL-8的表達功能，改善炎癥反應。Margarita等[66]研究發現從優質玉米蛋白分離出來的肽段對人肝癌細胞HepG2具有增殖抑制作用，該肽段可以促進凋亡因子的表達，從而誘導癌細胞凋亡。此外還有研究顯示，玉米多肽對60Co-γ射線、X射線、微波具有抗輻射功能[67?69]。

3 玉米多肽研究存在的問題及其發展前景

目前在玉米多肽制備方面，主要還是采用單一的酶解方法，復合酶解法和微生物發酵法很少采用。利用微生物發酵法制備玉米多肽，可以簡化操作工藝，降低成本，是未來玉米多肽產業化生產的發展趨勢[70]，但要解決因微生物自身代謝使多肽得率受影響以及發酵產生的異味等問題，因此研究優良發酵菌株以解決該法的缺陷十分重要。此外亞臨界水法作為制備玉米多肽的新技術，值得深入研究優化。其次，玉米多肽具有的抗血壓、降血糖等多種生物活性功能，已展現出巨大的開發潛力，但目前的研究大多停留在實驗室階段，而很少實際投入生產應用中，而且玉米多肽的生物活性研究多為體外或動物實驗，在人體內作用機理有待考察，另外玉米多肽的生物活性是否會因為食品加工過程（高溫或冷凍）而失活也有待研究。這些問題若得到解決，對人類具有重要的經濟效益、社會效益。

玉米多肽的開發有很廣闊的市場空間，利用玉米多肽抗炎、降血壓、降血糖功能，可以研制肽類藥物，改善或治療相關疾病；玉米多肽的抗疲勞功能可以用來開發功能性食品，作為運動員的營養補給食物、運動訓練食物，可以恢復運動后的疲勞感；根據玉米多肽醒酒護肝功能可以開發醒酒飲料，減少醉酒時間、降低醉酒程度，保護肝臟；玉米多肽也可以作為添加劑加入到食品中，延緩食品氧化，延長食品貨架期。玉米多肽在食品、醫學領域中的重要意義已經吸引了很多研究者，國外已經研制出玉米活性肽功能性食品和添加劑并投入市場[71]，我國對玉米多肽的開發研究還有很高的發展空間。