雙鋸魚(Amphiprion)胚胎不同發(fā)育階段和成魚不同組織中內(nèi)參基因的篩選及應(yīng)用*

李迎娣 孫志賓 馬愛軍 楊敬昆 劉志峰 于 宏 趙亭亭 常浩文 朱理光 劉詩穎 曲江波

雙鋸魚()胚胎不同發(fā)育階段和成魚不同組織中內(nèi)參基因的篩選及應(yīng)用*

李迎娣1, 2, 3, 4孫志賓2, 3, 4馬愛軍2, 3, 4①楊敬昆2, 3, 4劉志峰2, 3, 4于 宏2, 3, 4趙亭亭2, 3, 4常浩文2, 3, 4朱理光2, 3, 4劉詩穎2, 3, 4曲江波5

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室 山東青島 266071; 3. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學與生物技術(shù)功能實驗室 山東青島 266237; 4. 中國-東盟海水養(yǎng)殖技術(shù)“一帶一路”聯(lián)合實驗室 廣東廣州 510275; 5. 煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司 山東煙臺 264003)

雙鋸魚()亦稱為海葵魚, 又稱為小丑魚, 是一類經(jīng)濟價值較高的海水觀賞魚。目前國內(nèi)在雙鋸魚的胚胎發(fā)育、人工飼養(yǎng)以及形態(tài)學觀察等方面已經(jīng)取得了有效成果, 但在分子生物學水平上對其基因表達的研究較少。為了篩選出適用于雙鋸魚胚胎不同發(fā)育階段以及成魚組織的內(nèi)參基因, 分析酪氨酸酶(TYR)基因的表達情況, 以眼斑雙鋸魚()和白條雙鋸魚()為材料, 利用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR)對、(甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)、(轉(zhuǎn)錄延伸因子基因)和(β-肌動蛋白基因)這4個候選內(nèi)參基因的表達水平進行檢測, 同時通過geNorm和Norm Finder軟件對其穩(wěn)定性進行評估, 最后以合適的內(nèi)參基因作為參考, 研究TYR mRNA的表達水平。結(jié)果表明, 在雙鋸魚胚胎的不同發(fā)育階段,和的表達量相對于其他基因較為穩(wěn)定; 在雙鋸魚的不同組織中, 穩(wěn)定性依次為>>>。以作為內(nèi)參基因時分析發(fā)現(xiàn)TYR基因的表達在雙鋸魚胚胎發(fā)育過程中呈先上升后下降的趨勢, 在體節(jié)期表達量最高; 在雙鋸魚各組織中均有表達, 且在眼、尾和紅皮中表達量最高。

雙鋸魚; 內(nèi)參基因; TYR基因; qPCR; geNorm; Norm Finder

雙鋸魚隸屬于鱸形目(Perciformes)、雀鯛科(Pomacentridae)、雙鋸魚屬() (白海鋒等, 2011)。其與海葵共生, 為海葵去除壞死組織, 海葵為其提供保護, 亦被稱為海葵魚(葉樂等, 2008)。雙鋸魚體表都有一條或兩條白色條紋, 神似戲劇中的丑角, 因此俗稱“小丑魚”。雙鋸魚色彩絢麗、性情溫和, 且經(jīng)濟價值高, 是海水觀賞魚的首選品種(章霞等, 2015; 張薇等, 2018)。國內(nèi)在其人工繁育和飼養(yǎng)、形態(tài)學觀察、性別分化等方面取得了較多成就, 如滕力平等(2005)對二線小丑魚()的發(fā)育進行了生態(tài)學和形態(tài)學兩方面的研究, 發(fā)現(xiàn)胚后仔、稚、幼魚階段的二線小丑魚體表色素會逐漸增加并積累; Amonrat等(2013)用富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和蝦青素的飼料對眼斑雙鋸魚進行投喂, 結(jié)果表明, 在一定范圍內(nèi), 蛋白質(zhì)含量較高的飼料更適合雙鋸魚的生長, 而蝦青素和脂質(zhì)則有利于色素的積聚。但目前在分子水平上對雙鋸魚體色相關(guān)基因表達模式的研究還比較匱乏。

TYR (酪氨酸酶, tyrosinase)基因參與生物體黑色素(melanin)的合成, 其表達量決定了生物的體色變化, 在魚類的胚胎時期就已經(jīng)開始表達(蔣燕玲, 2016)。通過實時定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)技術(shù)對TYR的表達進行分析有助于了解基因的功能、闡明相關(guān)基因在胚胎發(fā)育和體色變異中的調(diào)控機制(楊愛馥等, 2010; Tang, 2017; 何麗斌等, 2018)。且生物體內(nèi)mRNA水平的變化是生理變化的最早信號, 會因為處于不同的發(fā)育時期或?qū)嶒灄l件的不同而表現(xiàn)出不同的濃度, 因此可以用來預測生物組織更高層次的變化(Franzellitti, 2015)。

內(nèi)參基因(reference gene)又稱管家基因(house-keeping gene), 其表達水平受環(huán)境因素影響較小, 在所有細胞中都能夠相對穩(wěn)定的表達, 不同實驗條件下選用的內(nèi)參基因有所不同(鄧紅平等, 2006; 劉穎等, 2013; Szczygie?, 2021)。常用的內(nèi)參基因有基因、重組蛋白基因()、肌動蛋白基因()、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因()、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因()、多聚泛素酶基因()、β-肌動蛋白基因()、α-微管蛋白基因()和β-微管蛋白基因() (蔣素華等, 2018)。內(nèi)參基因在qPCR技術(shù)分析基因表達的過程中非常關(guān)鍵, 其穩(wěn)定表達是目標基因表達數(shù)據(jù)標準化的先決條件, 可以作為數(shù)據(jù)分析的參考標準(Pfaffl, 2004; Mitter, 2009; 吳萍等, 2017)。研究表明, 在同一物種中, 即使內(nèi)參基因在某一條件下能夠相對穩(wěn)定的表達(Mughal, 2018), 但不一定在所有實驗條件下都適用, 因此在qPCR之前需要篩選出合適的內(nèi)參基因(Dheda, 2005)。若內(nèi)參基因有較大的表達誤差, 實驗結(jié)果中存在的干擾就會增加, 從而限制雙鋸魚分子生物學方面的研究(Iwata, 2008; 呂梁等, 2019)。

目前對雙鋸魚內(nèi)參基因篩選的研究較少, 為了進一步探索TYR基因的表達機制, 本實驗以白條雙鋸魚和眼斑雙鋸魚的組織及不同發(fā)育階段的胚胎作為樣品, 綜合利用Norm Finder和geNorm軟件對、、和這4個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行分析, 并選出相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因, 以TYR基因作為目的基因檢測其表達規(guī)律, 為獲得最優(yōu)內(nèi)參基因提供理論依據(jù), 為雙鋸魚相關(guān)基因的分析奠定應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試胚胎、組織均取自黃海水產(chǎn)研究所實驗室內(nèi)經(jīng)馴化后的野生白條雙鋸魚(番茄小丑魚) ()和眼斑雙鋸魚(公子小丑魚) () (圖1)。實驗期間將雙鋸魚成對飼養(yǎng)在養(yǎng)殖缸中, 即一對白條雙鋸魚, 一對眼斑雙鋸魚, 水溫用加熱棒維持在(27±1) °C, 鹽度為30～35, 光照周期為14L : 10D, 每天在8:00和14:00投喂人工餌料。白條雙鋸魚通常在12:00～13:00產(chǎn)卵, 孵化期為8～9 d; 眼斑雙鋸魚通常在15:00～16:00產(chǎn)卵, 孵化期為9～10 d。分別取這兩種雙鋸魚的6個胚胎發(fā)育時期(25個胚胎/時期, 三個重復): 2 hpf (hours post fertilization, 受精后小時數(shù)) (卵裂期)、33 hpf (體節(jié)期, 出現(xiàn)黑色素細胞, 圖 2)、57 hpf (翻轉(zhuǎn)期)、81 hpf (血管形成期)、105 hpf (器官形成期)、225 hpf (孵化期) (圖 3, 圖 4)。取這兩種雙鋸魚的成魚組織(三月齡, 三個重復): 心臟、腦、脾臟、眼、腸、鰓、白皮、紅皮、肌肉、尾(圖 5, 以眼斑雙鋸魚為例)。將取得的胚胎和組織樣品迅速浸泡在RNA保護液中, 然后儲存在–80 °C冰箱中, 用于后續(xù)總RNA的提取。

圖1 眼斑雙鋸魚和白條雙鋸魚外觀

注: a、c: 眼斑雙鋸魚; b、d: 白條雙鋸魚

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 根據(jù)總RNA提取試劑盒(TIANGEN)中的操作說明, 從胚胎和組織樣品中提取總RNA。由于RNA易污染, 提取完成后迅速將其儲存在–80 °C中。隨后, 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性, 并使用分光光度計(260 nm)檢測總RNA的濃度和純度(王玉成等, 2006)。取5 μL總RNA, 根據(jù)TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(TransGen, 北京)提供的說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 然后用無菌去離子水稀釋5倍(1︰5), 置于–20 °C中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 兩種雙鋸魚體節(jié)期胚胎的黑色素細胞

注: a. 白條雙鋸魚; b. 眼斑雙鋸魚

圖3 白條雙鋸魚胚胎不同發(fā)育時期

注: a. 卵裂期; b. 體節(jié)期; c. 翻轉(zhuǎn)期; d. 血管形成期; e. 器官形成期; f. 孵化期

圖4 眼斑雙鋸魚胚胎不同發(fā)育時期

注: a. 卵裂期; b. 體節(jié)期; c. 翻轉(zhuǎn)期; d. 血管形成期; e. 器官形成期; f. 孵化期

圖5 成魚組織(以眼斑雙鋸魚為例)

注: a. 眼; b. 肌肉; c. 紅皮; d. 尾; e. 鰓; f. 心; g. 腸; h. 白皮

1.2.2 引物設(shè)計 從NCBI (National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中獲得候選內(nèi)參基因的編碼序列, 用Primer Premier 5.0設(shè)計出上、下游引物(表1)。

1.2.3 引物特異性檢測 以雙鋸魚組織樣品逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA混合液為模板, 對這4個候選內(nèi)參基因進行普通PCR反應(yīng), 檢測引物的特異性。反應(yīng)體系(20 μL)為: ddH2O 10 μL, 2×TSINGKE?Master Mix 7.4 μL, 上游引物0.8 μL, 下游引物0.8 μL, cDNA 1 μL。

PCR反應(yīng)程序設(shè)置為: 94 °C預變性5 min; 94 °C變性30 s, 60 °C退火30 s, 72 °C延伸30 s, 35個循環(huán); 72 °C延伸10 min。普通PCR擴增得到的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 觀察得到的條帶是否單一。

表1 4個候選內(nèi)參基因的相關(guān)信息及引物

1.2.4 qPCR試驗以及數(shù)據(jù)分析 使用TOROGreen?qPCR Master Mix試劑盒進行qPCR, 反應(yīng)用StepOnePlusTMReal-Time PCR System儀器完成, 每份樣品重復三次。反應(yīng)體系(20 μL)為: 2×TSINGKE?Master Mix 10 μL, ddH2O 6.4 μL, 上游引物0.8 μL, 下游引物0.8 μL, cDNA 2 μL。

qPCR反應(yīng)程序設(shè)置為: 95 °C預變性1 min; 95 °C變性10 s, 60 °C退火30 s, 40個循環(huán)。

將qPCR得到的數(shù)據(jù)進行標準化處理, 然后運用geNorm和Norm Finder這兩種軟件對以上4個候選內(nèi)參基因進行統(tǒng)計學分析, 從而篩選出在雙鋸魚胚胎發(fā)育和不同組織中表達相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

1.2.5 內(nèi)參基因的應(yīng)用 本研究選用作為內(nèi)參基因, 對TYR基因的表達進行分析。TYR基因的NCBI序列號為XP_023132182.1, 利用Primer Premier 5.0設(shè)計得到正、反向引物, 與內(nèi)參基因的引物一并交由上海生工生物工程有限公司合成。

正向引物: TGGTTCCCTTCTTCCCTCTC

反向引物: GGTTACGCTTCCACTTCCTTC

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的質(zhì)量評估及普通PCR產(chǎn)物檢測

利用分光光度計對提取的雙鋸魚胚胎和成魚組織樣品的總RNA進行測定, 其中, OD260/280值為1.8～2.0, 濃度為340～590 ng/μL。數(shù)據(jù)表明樣品的總RNA質(zhì)量較好, 可以用于后續(xù)實驗。

通過1%的瓊脂糖凝膠電泳對普通PCR的產(chǎn)物進行檢測, 這4個候選內(nèi)參基因的引物與組織cDNA結(jié)合之后均得到一個單一的條帶, 沒有引物二聚體(圖6)。

利用qPCR反應(yīng)得到的這4個候選內(nèi)參基因的熔解曲線, 均為單一峰且重復性好(圖7), 進一步說明引物的特異性好。

圖6 候選內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物

2.2 4個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.2.1 4個候選內(nèi)參基因Ct值分析 利用qPCR反應(yīng)對這4個候選內(nèi)參基因進行擴增, 模板分別取自雙鋸魚的胚胎和成魚組織, 數(shù)據(jù)見表2, Ct值分布范圍為13.67～36.71。其中, 最小的Ct值出現(xiàn)在基因的表達中, 表明其在胚胎和組織中的表達水平相對較高; 最大的Ct值出現(xiàn)在的表達中, 表明其表達水平較低, 分布范圍為28.00～ 36.00 (圖8)。

2.2.2 Norm Finder以及geNorm穩(wěn)定性分析 向內(nèi)參基因篩選軟件中輸入標準化后的定量數(shù)據(jù), geNorm會得出相應(yīng)的表達穩(wěn)定值(值);值越小, 基因表達越穩(wěn)定(吳建陽等, 2017); 還有配對變異分析V/V+1結(jié)果, 若V/V+1>0.15, 則表明適合內(nèi)參基因的數(shù)量有+1個(胡金川, 2008)。Norm Finder會給出候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值且得到一個最佳選擇(滕彥嬌等, 2021)。

圖7 候選內(nèi)參基因熔解曲線分析

表2 雙鋸魚胚胎不同發(fā)育時期以及成魚組織中4個候選內(nèi)參基因的Ct值

圖8 雙鋸魚胚胎不同發(fā)育時期以及成魚組織中4個候選內(nèi)參基因的Ct值分布

geNorm分析結(jié)果表明, 在眼斑雙鋸魚和白條雙鋸魚的胚胎中,和的值最小; 在眼斑雙鋸魚和白條雙鋸魚的成魚組織中,、和的值最小(圖9)。又因為配對變異分析結(jié)果2/3=0.904>0.15 (圖10), 因此在眼斑雙鋸魚和白條雙鋸魚的成魚組織、胚胎中, 適合的內(nèi)參基因有3個, 即、和。

利用Norm Finder軟件對標準化后的數(shù)據(jù)進行分析, 在白條雙鋸魚和眼斑雙鋸魚的胚胎、成魚組織樣品中, 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序為>>>(穩(wěn)定性值見表3), 這與geNorm分析結(jié)果相符, 表明和在這4個候選基因中較為穩(wěn)定。

因此, 綜合geNorm和NormFinder對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析結(jié)果,和的表達相對穩(wěn)定, 且的值最小, 更適合作為雙鋸魚qPCR分析實驗中的內(nèi)參基因。

2.3 TYR基因表達分析

利用qPCR技術(shù), 以作為內(nèi)參基因檢測TYR基因在白條雙鋸魚和眼斑雙鋸魚的胚胎及成魚組織中的表達情況, 數(shù)據(jù)見表4。結(jié)果顯示TYR基因在雙鋸魚胚胎時期就已經(jīng)開始表達, 表達水平呈先上升后下降的趨勢, 在體節(jié)期達到最高。且在胚胎觀察過程中發(fā)現(xiàn), 黑色素細胞亦出現(xiàn)在白條雙鋸魚和眼斑雙鋸魚的體節(jié)期(參考圖3, 圖4); 在白條雙鋸魚和眼斑雙鋸魚成魚的眼、紅皮以及尾中表達量相對較高(圖11)。

圖9 4個候選參考基因的平均表達穩(wěn)定值

注: a. 眼斑雙鋸魚成魚組織; b. 眼斑雙鋸魚胚胎不同發(fā)育時期; c. 白條雙鋸魚成魚組織; d. 白條雙鋸魚胚胎不同發(fā)育時期

圖10 標準化控制基因數(shù)量的確定

3 討論

實時定量PCR (qPCR)是目標基因準確表達的首選工具, 內(nèi)參基因則是qPCR數(shù)據(jù)分析的參考標準, 但不是所有內(nèi)參基因在實驗中都能夠穩(wěn)定表達(Vandesompele, 2002)。因此, 在進行qPCR之前需要根據(jù)樣品和實驗條件選擇合適的內(nèi)參基因。geNorm和Norm Finder軟件是專門用來篩選內(nèi)參基因的, 但分析結(jié)果略有不同。其中, Norm Finder是根據(jù)內(nèi)參基因的穩(wěn)定值大小對其進行排序, 并得到每個實驗條件下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因; geNorm則是可以得出適合實驗的最佳內(nèi)參基因組合(吳建陽等, 2017)。

表3 利用Norm Finder程序獲得的M值

表4 TYR基因在白條雙鋸魚和眼斑雙鋸魚的胚胎及成魚組織中的表達

續(xù)表

圖11 TYR基因在白條雙鋸魚和眼斑雙鋸魚的胚胎及成魚組織中的表達

注: a. 白條雙鋸魚胚胎不同發(fā)育時期; b. 眼斑雙鋸魚胚胎不同發(fā)育時期; c. 白條雙鋸魚成魚組織; d. 眼斑雙鋸魚成魚組織

用于魚類胚胎不同發(fā)育階段以及不同組織研究的內(nèi)參基因種類很多, 常見的有基因, 在真核生物中參與蛋白質(zhì)的翻譯, 是總蛋白含量的1%～2% (唐永凱等, 2008);是一類編碼核糖體小亞基的rRNA (周曉馥等, 2016);基因參與糖降解反應(yīng)(Pei, 2007);基因是肌肉及細胞骨架的主要成分, 廣泛分布于各組織中(唐永凱等, 2013)。更多的研究為了真實地反映目標基因的表達水平, 會篩選出兩個或兩個以上的內(nèi)參基因作為數(shù)據(jù)分析過程中的參考, 如張寧等(2018)通過實驗選擇了和作為多鱗鱚研究中的內(nèi)參基因; 在對不同處理條件下的異育銀鯽()組織和尾鰭細胞的研究中, 實驗結(jié)果表明可以作為腎臟組織和細胞研究的適合內(nèi)參基因, 而適合在病毒刺激下作為數(shù)據(jù)分析的內(nèi)參基因(費越越等, 2020); 茅華華等(2016)對斑鱧()的胚胎不同時期和成魚組織進行分析, 結(jié)果得出和適合作為組織相關(guān)基因表達分析的內(nèi)參基因, 而和可以作為胚胎相關(guān)研究的內(nèi)參基因。

目前, 關(guān)于雙鋸魚的研究多傾向于胚胎發(fā)育和飼養(yǎng)、繁殖, 而對內(nèi)參基因篩選的研究少之又少。本研究通過geNorm和Norm Finder軟件對、、和的穩(wěn)定性進行分析, 最終選擇作為雙鋸魚基因表達研究的合適內(nèi)參基因。這與陳張帆等(2018)在牙鲆胚胎中的篩選結(jié)果相似。TYR是黑色素合成的關(guān)鍵酶, TYR基因的表達決定了生物體色的變化程度(張植元等, 2017)。結(jié)果表明, 在雙鋸魚胚胎發(fā)育過程中就已經(jīng)出現(xiàn)了黑色素細胞(圖2), 即TYR基因開始表達, 在體節(jié)期表達量最高; 在成魚的眼、尾和紅皮中表達量最高。只有篩選出合適的內(nèi)參基因, qPCR技術(shù)在目標基因的研究中才能發(fā)揮重要作用, 否則就會出現(xiàn)一定的誤差(呂梁等, 2019)。旨在為后期研究雙鋸魚相關(guān)基因的表達機制提供應(yīng)用基礎(chǔ), 使數(shù)據(jù)分析結(jié)果更有效、可靠。

4 結(jié)論

為了篩選出合適的內(nèi)參基因, 本實驗以眼斑雙鋸魚和白條雙鋸魚的胚胎、組織為研究對象, 對、、和的表達穩(wěn)定性進行分析, 雖然geNorm和Norm Finder顯示的結(jié)果略有不同, 但相對于其他內(nèi)參基因穩(wěn)定值更高, 并選其作為TYR基因相對定量數(shù)據(jù)分析的參考標準, 以期為研究雙鋸魚胚胎、個體發(fā)育過程中基因的表達水平提供有效的數(shù)據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

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SCREENING AND APPLICATION OF REFERENCE GENE IN ANEMONE FISH () EMBRYOS IN DIFFERENT DEVELOPMENT STAGES AND ADULT TISSUES

LI Ying-Di1, 2, 3, 4, SUN Zhi-Bin2, 3, 4, MA Ai-Jun2, 3, 4, YANG Jing-Kun2, 3, 4, LIU Zhi-Feng2, 3, 4, YU Hong2, 3, 4, ZHAO Ting-Ting2, 3, 4, CHANG Hao-Wen2, 3, 4, ZHU Li-Guang2, 3, 4, LIU Shi-Ying2, 3, 4, QU Jiang-Bo5

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 4. China-ASEAN Belt and Road Joint Laboratory on Marine Aquaculture Technology, Guangzhou 510275, China; 5. Yantai Tianyuan Aquatic Co. Ltd., Yantai 264003, China)

Anemone fish (), or known as clownfish, is a class of economically valuable seawater ornamental fish. Outstanding results have been achieved in the embryo development, artificial breeding, and morphological observation of anemone fish, but few studies are made on its gene expression at molecular biological level. To screen out the reference genes that are suitable for different development stages of anemone fish embryos and the adult fish tissues and to analyze the expression of tyrosinase (TYR) genes, we conducted this experiment using Fales-Clown anemone fish () and tomato clownfish () as the materials, for which quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) was applied to determine the expression levels of four candidate reference genes:gene,,and. Meanwhile, the stability of these four candidate reference genes is evaluated with software geNorm and Norm Finder. Finally, an appropriate reference gene was used to study the expression level of TYR mRNA. Results show that the expression ofandn was relatively stable in anemone fish embryos at different development stages. In different tissues of anemone fish,was the most stable. Whenwas used as the reference gene, the expression of TYR gene was first increased and then decreased during the development of anemone fish embryos and the highest expression level was found at the body segmentation stage. The TYR gene was expressed in all tissues and the expression level peaked in eye, tail, and red skin. A reference gene suitable for the anemone fish was selected and applied to analyze the expression of TYR gene in different stages of embryo and adult tissues.

anemone fish; reference gene; TYR gene; qPCR; geNorm; Norm Finder

Q954; S965

10.11693/hyhz20210800196

*“一帶一路”沿線熱帶國家水產(chǎn)養(yǎng)殖科技創(chuàng)新合作項目, 2018～2020; 中國東盟海上合作基金項目, 2016～2020; 中國水產(chǎn)科學研究院基本科研業(yè)務(wù)費項目, 2020TD25號; 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室“鰲山人才”培養(yǎng)計劃項目, 2017ASTCP-OS04號。李迎娣, 碩士研究生, E-mail: 1721775977@qq.com; 同等貢獻第一作者: 孫志賓, E-mail: sunzb@ysfri.ac.cn

馬愛軍, 博士, 研究員, 博士生導師, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn

2021-08-31,

2021-10-06