基于馬氏珠母貝(Pinctada fucata)血細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)補(bǔ)體樣組分的鑒定與分析*

王 菁 李桂英 林楷琪 歐 靜 張淑瓶 王忠良

基于馬氏珠母貝()血細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)補(bǔ)體樣組分的鑒定與分析*

王 菁 李桂英 林楷琪 歐 靜 張淑瓶 王忠良①

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東湛江 524088)

補(bǔ)體系統(tǒng)作為先天免疫的重要組成部分, 是一種復(fù)雜的限制性蛋白水解系統(tǒng), 其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的防御作用。為分析馬氏珠母貝補(bǔ)體系統(tǒng)的組成及作用機(jī)制, 使用血細(xì)胞樣品進(jìn)行了全長轉(zhuǎn)錄組測序建庫、基因比對、功能注釋, 共挖掘到212個(gè)潛在補(bǔ)體樣組分相關(guān)基因。補(bǔ)體樣組分基因經(jīng)同源性比對和結(jié)構(gòu)域檢測分析表明, 檢索到的基因分別編碼89個(gè)含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白、57個(gè)C型凝集素蛋白、33個(gè)纖維膠凝蛋白、11個(gè)纖維蛋白原相關(guān)蛋白、8個(gè)甘露糖結(jié)合型凝集素關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶、2個(gè)含硫酯蛋白(1個(gè)C3分子, 1個(gè)TEP分子)、1個(gè)補(bǔ)體受體、2個(gè)補(bǔ)體因子、9個(gè)絲氨酸蛋白酶。隨機(jī)選擇12個(gè)補(bǔ)體相關(guān)基因, 使用溶藻弧菌刺激前后的血細(xì)胞樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測其表達(dá)水平, 結(jié)果顯示(C1q domain containing protein)、、(mannose-binding lectin)、、(mannan-binding lectin serine protease)等基因均呈現(xiàn)出顯著差異表達(dá), 表明馬氏珠母貝補(bǔ)體系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的多組分效應(yīng)系統(tǒng), 且可能通過凝集素途徑或類似于凝集素途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)的免疫作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步驗(yàn)證馬氏珠母貝中存在的原始補(bǔ)體系統(tǒng)提供了分子生物學(xué)證據(jù), 同時(shí)對深入了解馬氏珠母貝免疫防御機(jī)制, 豐富和發(fā)展海洋無脊椎動(dòng)物免疫學(xué)內(nèi)容也具有重要理論意義。

馬氏珠母貝; 全長轉(zhuǎn)錄組; 補(bǔ)體組分; 生物信息學(xué)分析; 實(shí)時(shí)定量PCR

與其他無脊椎動(dòng)物一樣, 馬氏珠母貝()缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng), 其機(jī)體的正常生命活動(dòng)主要依靠先天免疫系統(tǒng)以抵御各種病原和外來物質(zhì)的入侵(焦鈺等, 2020)。先天免疫是機(jī)體抵抗和消滅外來病原入侵的第一道防線(吳勇等, 2019)。補(bǔ)體系統(tǒng)作為先天免疫的組成部分及免疫效應(yīng)系統(tǒng), 是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的樞紐, 具有識(shí)別、清除病原體的作用(劉先軍等, 2011; Li, 2019)。

補(bǔ)體系統(tǒng)是一種復(fù)雜的生物效應(yīng)系統(tǒng), 自19世紀(jì)末被發(fā)現(xiàn)以來, 在哺乳動(dòng)物中展開了廣泛的研究(Fujita, 2004)。哺乳動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)是由30多種蛋白組成的復(fù)雜蛋白水解系統(tǒng), 具有誘導(dǎo)炎癥、調(diào)理并溶解病原體的作用(Suckale, 2005)。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活途徑主要包括經(jīng)典途徑(classic pathway)、凝集素途徑(lectin pathway)和替代途徑(alternative pathway) (Fujita, 2004)。經(jīng)典途徑和凝集素途徑通過利用不同的蛋白質(zhì)C1q (C1q domain containing protein)、MBL (mannose-binding lectin)、Ficolins識(shí)別靶標(biāo)從而激活蛋白酶C1r、C1s、MASP (mannan-binding lectin serine protease); 而替代途徑中激活的C3 (complement 3)可與Bf (Factor B)結(jié)合, 在Factor D作用下形成C3轉(zhuǎn)化酶(Nonaka, 2006)。三條補(bǔ)體途徑激活后最終均進(jìn)入終末途徑(terminal pathway), 形成膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex, MAC)裂解靶細(xì)胞(Suckale, 2005)。此外, 缺乏基因的小鼠可通過凝血酶替代C3依賴型C5轉(zhuǎn)化酶介導(dǎo)補(bǔ)體途徑的激活(Huber-Lang, 2006)。

事實(shí)上, 補(bǔ)體系統(tǒng)是一種古老的防御系統(tǒng), 其起源早于脊椎動(dòng)物的發(fā)育, 在許多無脊椎動(dòng)物門中均發(fā)現(xiàn)了與哺乳動(dòng)物相似的補(bǔ)體成分, 包括尾索動(dòng)物(Al-Sharif, 1998; Suckale, 2005)、頭索動(dòng)物(Suzuki, 2002)、刺胞動(dòng)物(Ji, 1997)、節(jié)肢動(dòng)物(Dishaw, 2005; Liu, 2019)、軟體動(dòng)物(Gerdol, 2015; Wang, 2019)等。早期在海膽()和被囊類動(dòng)物中鑒定到的與脊椎動(dòng)物同源的分子具有調(diào)理活性以及潛在的C3轉(zhuǎn)化酶作用。因此, 研究者普遍認(rèn)為補(bǔ)體系統(tǒng)起源于后口動(dòng)物(Nonaka, 2004a, 2004b)。然而, 在節(jié)肢動(dòng)物鱟()中發(fā)現(xiàn)了脊椎動(dòng)物和的同源物, 表明在原口動(dòng)物譜系中存在著以為中心分子的復(fù)雜的調(diào)理防御系統(tǒng)(Zhu, 2005)。從海鞘()分離得到甘露糖凝集素, 可結(jié)合相關(guān)的甘露糖結(jié)合型凝集素關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶, 進(jìn)而激活C3啟動(dòng)補(bǔ)體系統(tǒng)(Sekine, 2001)。關(guān)于補(bǔ)體系統(tǒng)的研究在雙殼貝類中同樣展開了廣泛的研究, 且相關(guān)補(bǔ)體分子在機(jī)體的免疫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用, 包括櫛孔扇貝() (Yang, 2011)、菲律賓蛤仔() (Takahashi, 2008)、海灣扇貝() (Yang, 2014)、光滑雙臍螺() (Lu, 2020)、太平洋牡蠣() (Wang, 2017)、厚殼貽貝() (陳永霞, 2018)等。對太平洋牡蠣的研究發(fā)現(xiàn), 其體內(nèi)存在C3、含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白(C1qDC)、凝集素樣蛋白(C-lectin like protein)、纖維蛋白原相關(guān)蛋白(fibrinogen-related protein, FREP)、絲氨酸蛋白酶(Serine protease)和補(bǔ)體受體樣蛋白, 表明雙殼類中存在一個(gè)多組分的補(bǔ)體系統(tǒng)(Wang, 2017)。文蛤()中樣分子和樣分子的存在, 表明雙殼類補(bǔ)體系統(tǒng)可能通過替代途徑激活(Prado-Alvarez, 2009)?？O蟶()中、、基因在先天免疫中發(fā)揮重要的免疫作用(Peng, 2017; Li, 2019; Lan, 2020)。此外, 補(bǔ)體系統(tǒng)中存在具有相似結(jié)構(gòu)的同源分子, 如C3/C4/C5、C2/Bf和C1s/C1r/MASP, 被認(rèn)為是基因復(fù)制的產(chǎn)物(Nonaka, 2004a)。因此, Nonaka等(2004a)認(rèn)為哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)似乎是通過基因復(fù)制從一個(gè)更簡單的補(bǔ)體系統(tǒng)逐步發(fā)展進(jìn)化形成的。

全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的興起為絕大部分非模式生物的基因研究提供了更全面的基因序列信息(Chao, 2019), 進(jìn)而可以全面、系統(tǒng)地開展補(bǔ)體系統(tǒng)進(jìn)化、功能和作用機(jī)制研究。本文基于馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù), 系統(tǒng)地檢索馬氏珠母貝血細(xì)胞中存在的潛在補(bǔ)體樣組分基因; 同時(shí), 使用溶藻弧菌()刺激馬氏珠母貝后的血細(xì)胞樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測相關(guān)補(bǔ)體基因的表達(dá)水平變化, 有助于加強(qiáng)對馬氏珠母貝免疫相關(guān)基因的系統(tǒng)認(rèn)知, 進(jìn)一步理解馬氏珠母貝補(bǔ)體系統(tǒng)的組成及作用機(jī)制, 對豐富和發(fā)展海洋無脊椎動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)也具有重要理論意義。

1 材料與方法

1.1 馬氏珠母貝的暫養(yǎng)、細(xì)菌刺激及總RNA提取

馬氏珠母貝(平均殼長70 mm)購自廣東省湛江市雷州養(yǎng)殖場, 暫養(yǎng)于室內(nèi)過濾海水桶中, 水溫25 °C, 飼養(yǎng)期間保持充氣, 定時(shí)投喂螺旋藻粉; 每天100%換水一次。室內(nèi)暫養(yǎng)一周后將馬氏珠母貝隨機(jī)分為兩組, 實(shí)驗(yàn)組采用閉殼肌注射的方法注射100 μL濃度為5×107CFU/mL的溶藻弧菌懸浮液; 對照組于閉殼肌處注射等體積的PBS溶液(pH 7.0) (Wang, 2016)。注射4 h后, 于閉殼肌處采集血淋巴, 每只約0.5 mL, 采集的血淋巴立即分裝至1.5 mL離心管中, 4 °C, 800×條件下離心10 min收集血細(xì)胞, 并立即提取總RNA。

1.2 全長轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序

使用馬氏珠母貝健康血細(xì)胞樣品, 利用Agilent 2100和NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測總RNA的完整性和濃度。按照制造商說明書進(jìn)行SMRTbell文庫構(gòu)建, 采用MagBead Loading上機(jī)測序獲得原始數(shù)據(jù), 使用SMRT Link v6.0對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析提取CCS (Circular Consensus Sequence)序列, 對全長序列進(jìn)行去冗余聚類、校正, 得到的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/ SRR9644402)。

1.3 生物信息學(xué)分析

Unigene在Nt、Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG及Pfam數(shù)據(jù)庫中比對并獲得基因注釋信息(E值<1.0E–5)。使用unigene在Nr庫中比對結(jié)果最好(E值最低)的序列為對應(yīng)同源序列, 確定同源序列所屬物種并統(tǒng)計(jì)比對到各個(gè)物種的同源序列數(shù)量。

1.4 補(bǔ)體樣組分篩選

基于功能基因注釋信息檢索含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白(C1q、C1qDC)、凝集素(凝集素、C型凝集素、甘露糖結(jié)合凝集素)、纖維膠凝蛋白、C3、纖維蛋白原相關(guān)蛋白、絲氨酸蛋白酶、含硫酯蛋白(thioester- containing protein, TEP)、補(bǔ)體因子等補(bǔ)體樣組分。采用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)及SMART server (http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行補(bǔ)體樣組分的結(jié)構(gòu)域檢測。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測補(bǔ)體相關(guān)基因表達(dá)水平

從全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選的補(bǔ)體相關(guān)基因中隨機(jī)選擇12個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測其表達(dá)水平, 使用One-Step gDNA Removal試劑盒(北京全式金生物公司)合成cDNA第一鏈。按照PerfectStart?Green qPCR SuperMix (北京全式金生物公司)說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR, 實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)使用2–ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算, 并使用SPSS 24進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),<0.05為顯著差異,<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)

利用SMRT測序技術(shù), 共獲得14 048 434 585總堿基數(shù)(bp), 原始平均序列長度為1 838 bp, N50為2 563 bp。使用Permissive CCS2軟件進(jìn)行序列提取和質(zhì)量過濾后, 共得到915 060 427個(gè)循環(huán)一致序列(CCS), 其中全長非嵌合序列(full-length non-chimeric, FLNC)具有636 357 960個(gè)CCS, 去掉5′primer、3′primer和polyA后獲得原始的全長轉(zhuǎn)錄本序列。序列去冗余后獲得82 381 unigenes, N50為2861 bp (表1)。

表1 馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

2.2 馬氏珠母貝基因注釋及功能分類

使用BLAST工具將所有的Unigene與NR、NT、Pfam、Swiss-Prot等蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對, 結(jié)果共得到59 621個(gè)注釋基因和22 760個(gè)未注釋基因(圖1), 表明全長轉(zhuǎn)錄組基因注釋的水平較好。Unigene注釋到同源基因的物種分布如圖2所示, 其中匹配到太平洋牡蠣的基因數(shù)量最多, 有42 014條基因。其他同源序列匹配較高的物種有馬氏珠母貝、鴨嘴舌形貝()、美國加州海兔()等物種。

圖1 馬氏珠母貝基因功能注釋venn圖

2.3 馬氏珠母貝的補(bǔ)體樣組分

通過檢索馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù), 共獲得212條補(bǔ)體樣成分unigene, 分別編碼89個(gè)含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白、57個(gè)C型凝集素蛋白、33個(gè)纖維膠凝蛋白、11個(gè)纖維蛋白原相關(guān)蛋白、8個(gè)甘露糖結(jié)合型凝集素關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶(MASP)、2個(gè)含硫酯蛋白(1個(gè)C3分子, 1個(gè)TEP分子)、1個(gè)補(bǔ)體受體、2個(gè)補(bǔ)體因子、9個(gè)絲氨酸蛋白酶。

2.4 含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白

在檢索到的89個(gè)含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白(C1qDC)中, 有81個(gè)C1qDC含有C末端球狀結(jié)構(gòu)域, 10個(gè)C1qDC蛋白還具有smc結(jié)構(gòu)域; 6個(gè)C1q亞成分結(jié)合蛋白含有MAM33結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域可與C1q的球狀結(jié)構(gòu)域結(jié)合, 參與線粒體的氧化磷酸化和細(xì)胞核-線粒體的相互作用, 但均未能檢測到N末端的膠原結(jié)構(gòu)域(表2)。

2.5 纖維膠凝蛋白、纖維蛋白原相關(guān)蛋白及C型凝集素

甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)和纖維膠凝蛋白(ficolin)分子的結(jié)構(gòu)類似, 僅在C端的放射狀球形結(jié)構(gòu)域上各自有差別。在本文中, 共檢索到33個(gè)ficolin, 其中31個(gè)分子具有C末端FBG結(jié)構(gòu)域。同時(shí), 檢測到11個(gè)具有FBG結(jié)構(gòu)域的纖維蛋白原相關(guān)蛋白, 57個(gè)C型凝集素基因(C-type lectin, CTL)中有26個(gè)基因具有CTLD結(jié)構(gòu)域(表3)。且在全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中未檢索到甘露糖結(jié)合凝集素。

圖2 馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組unigene與NR數(shù)據(jù)庫匹配物種分布

表2 馬氏珠母貝C1q/C1qDC保守結(jié)構(gòu)域分析

表3 馬氏珠母貝C型凝集素保守結(jié)構(gòu)域分析

續(xù)表

2.6 絲氨酸蛋白酶

補(bǔ)體系統(tǒng)三條激活途徑具有不同的絲氨酸蛋白酶分子, MASP/C1r/C1s在凝集素途徑和經(jīng)典途徑中發(fā)揮作用, 而替代途徑中則是Bf/C2。在馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共檢索到17個(gè)絲氨酸蛋白酶基因, 其中, 6個(gè)甘露糖結(jié)合型凝集素絲氨酸蛋白酶含有IG_like、Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域; 2個(gè)甘露糖結(jié)合型絲氨酸蛋白酶含有CUB、IG_like、Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域; 2個(gè)絲氨酸蛋白酶含有Trypsin_2結(jié)構(gòu)域; 7個(gè)絲氨酸蛋白酶基因含有N端β-螺旋結(jié)構(gòu)域(表4)。

表4 馬氏珠母貝絲氨酸蛋白酶保守結(jié)構(gòu)域分析

2.7 其他補(bǔ)體樣成分

馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共檢索到2個(gè)含硫酯結(jié)構(gòu)域蛋白, 包括C3分子和TEP (thioester- containing protein)分子。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)C3具有complement_C3_C4_C5、A2M_comp結(jié)構(gòu)域; TEP分子具有A2M_2、A2M_comp、A2M_recep結(jié)構(gòu)域(表5)。D因子具有Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域, 而H因子和補(bǔ)體受體2 (Cr2)未檢測到相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域(表5)。

表5 馬氏珠母貝其它補(bǔ)體樣成分保守結(jié)構(gòu)域分析

2.8 補(bǔ)體相關(guān)基因表達(dá)水平分析

隨機(jī)挑選12個(gè)補(bǔ)體樣相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 檢測其在溶藻弧菌刺激前后的表達(dá)水平變化(圖3)。結(jié)果顯示, 與對照組相比, 11個(gè)基因的表達(dá)水平上調(diào), 其中10個(gè)基因表現(xiàn)出極顯著差異, 包括、、、、、等補(bǔ)體基因, 暗示馬氏珠母貝的補(bǔ)體系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的免疫效應(yīng)系統(tǒng), 包括并不限于這些基因參與到馬氏珠母貝的免疫響應(yīng)過程中。

3 討論

補(bǔ)體系統(tǒng)是一種古老的免疫防御機(jī)制, 在無脊椎動(dòng)物抵御病原入侵中發(fā)揮重要的免疫作用(Nonaka, 2004a)。補(bǔ)體組分是具有特定結(jié)構(gòu)域的分子, 研究表明在哺乳動(dòng)物補(bǔ)體成分中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)結(jié)構(gòu)域普遍存在于后口動(dòng)物, 這表明后口動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)存在由補(bǔ)體分子共同發(fā)揮免疫作用的效應(yīng)系統(tǒng)(Patthy, 2003)。研究表明無脊椎動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)與脊椎動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)存在一定差異(Nonaka, 2006)。

圖3 馬氏珠母貝補(bǔ)體樣組分基因表達(dá)水平

目前, 關(guān)于無脊椎動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)的研究主要集中在海膽(Al-Sharif, 1998)、海鞘(Ji, 1997)、鱟(Zhu, 2005)、珊瑚(Coral) (Dishaw, 2005)、太平洋牡蠣() (Wang, 2017)等物種中, 而關(guān)于馬氏珠母貝補(bǔ)體系統(tǒng)的研究尚且處于起步階段。本研究基于馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 系統(tǒng)檢索補(bǔ)體相關(guān)組分, 結(jié)果顯示共挖掘到212條補(bǔ)體樣成分unigene, 分別編碼89個(gè)含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白、57個(gè)C型凝集素蛋白、33個(gè)纖維膠凝蛋白、11個(gè)纖維蛋白原相關(guān)蛋白、8個(gè)甘露糖結(jié)合型凝集素關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶、2個(gè)含硫酯蛋白(1個(gè)C3分子, 1個(gè)TEP分子)、1個(gè)補(bǔ)體受體、2個(gè)補(bǔ)體因子、9個(gè)絲氨酸蛋白酶。這些補(bǔ)體同源分子的發(fā)現(xiàn)暗示它們參與構(gòu)成馬氏珠母貝原始的補(bǔ)體系統(tǒng), 可能具有類似于脊椎動(dòng)物補(bǔ)體組分相似的免疫學(xué)功能。

補(bǔ)體C3作為補(bǔ)體系統(tǒng)的中心組分, 在經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑中具有樞紐作用, 因此大部分研究人員將C3分子或類似物的出現(xiàn)作為補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生的主要標(biāo)志(Nonaka, 2004b)。在無脊椎動(dòng)物海參() (Zhou, 2011)、珊瑚() (Dishaw, 2005)、?？?) (Kimura, 2009)、文蛤(Prado-Alvarez, 2009)中發(fā)現(xiàn)的C3分子具有原始C3的結(jié)構(gòu)特征。補(bǔ)體C3具有獨(dú)特的鏈內(nèi)硫酯鍵, 可與入侵微生物形成共價(jià)鍵, 促進(jìn)吞噬作用(Wang, 2021)。節(jié)肢動(dòng)物鱟、烏賊、珊瑚中C3樣分子的發(fā)現(xiàn), 將其起源推至13億年前的寒武紀(jì), 表明這類分子可能在后生動(dòng)物進(jìn)化的最早期就已具備調(diào)理作用(張峘, 2010)。在鱟中發(fā)現(xiàn)的C3屬于脊椎動(dòng)物C3的同源分子, 其硫酯鍵水解后能夠促進(jìn)與金黃色葡萄球菌()、大腸桿菌()等微生物表面結(jié)合(Zhu, 2005)。南美白對蝦() C3在細(xì)菌溶解和溶血方面起著至關(guān)重要的免疫作用, 激活包括C3在內(nèi)的補(bǔ)體途徑可能會(huì)限制WSSV在對蝦體內(nèi)的復(fù)制(Liu, 2019)。在前期研究中, 我們成功從馬氏珠母貝中克隆得到完整的C3分子, 其能夠在體外條件下激活NF-kB信號(hào)通路, 特異性的siRNA敲降C3的表達(dá)能夠顯著降低馬氏珠母貝血細(xì)胞對溶藻弧菌的吞噬作用(Wang, 2021)。

替代途徑可通過C3分子的激活而啟動(dòng), 在沒有抗體的情況下可通過補(bǔ)充調(diào)節(jié)因子(H因子和P因子)的相互作用直接結(jié)合病原體表面(Wang, 2017)。哺乳動(dòng)物Bf和C2在補(bǔ)體激活過程中具有重要的作用, 其具有相似結(jié)構(gòu)域, 是通過基因復(fù)制產(chǎn)生的嵌合蛋白, 包括short consensus repeat (SCR), von Willebrand factor type A (vWA), serine protease domain-containing (SPC) (張峘, 2010)。研究發(fā)現(xiàn)Bf和C2僅在兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中同時(shí)存在(Ohta, 2006)。目前在無脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的具有類似結(jié)構(gòu)域的分子均是Bf和C2的同源分子, 在結(jié)構(gòu)上同哺乳動(dòng)物存在一定差異。文蛤中因子相比脊椎動(dòng)物缺少1個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域, 而海膽具有5個(gè)SCR結(jié)構(gòu)域(Smith, 1998); 玻璃海鞘()因子除了具有脊椎動(dòng)物典型的結(jié)構(gòu)域, 還額外具有2個(gè)Low-density lipoprotein receptor (LDLR)和1個(gè) SCR (Yoshizaki, 2005)。文昌魚() Bf/C2分子在SCR重復(fù)結(jié)構(gòu)域中包含1個(gè)表皮生長因子(EGF)結(jié)構(gòu)域, LPS刺激后在肝臟中的表達(dá)量顯著上升(He, 2008)。雖然在馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了大量的SCR、SPC結(jié)構(gòu)域, 但是沒有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有SCR、SPC結(jié)構(gòu)域的基因, 表明沒有典型的Bf/C2分子存在于馬氏珠母貝中, 其分子功能仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

原始補(bǔ)體組分的功能進(jìn)化及整合促進(jìn)了補(bǔ)體系統(tǒng)調(diào)理作用的產(chǎn)生(Zhu, 2005)。凝集素途徑中MASP代替替代途徑中Bf/C2的作用直接激活C3 (Fujita, 2004)。纖維膠凝蛋白(Ficolin)和甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)是識(shí)別外源病原體并激活凝集素途徑中的關(guān)鍵分子(Gadjeva, 2001)。光滑雙臍螺和文昌魚的FREP具有凝集素的活性, 能識(shí)別并結(jié)合病原微生物, 在先天免疫中發(fā)揮著PRR的作用(Fan, 2008; Lu, 2020)。本研究中從全長轉(zhuǎn)錄組中檢索到57個(gè)C-lectin和8個(gè)MASP。C-lectin含有一個(gè)或多個(gè)C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD), 能夠與多種配體結(jié)合, 包括碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、CaCO3等(Huang, 2008)。MBL的C型凝集素結(jié)構(gòu)域可識(shí)別病原體表面上的甘露糖或N-乙酰氨基葡糖結(jié)構(gòu), 與活化的MASP形成復(fù)合酶, 進(jìn)而激活補(bǔ)體系統(tǒng)(Ikeda, 1987)?？O蟶C型凝集素具有介導(dǎo)凝集與吞噬作用的免疫功能(Lan, 2020)。縊蟶C-type lectin具有促進(jìn)血細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力, 且這種促吞噬活性是依靠CTLD結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)菌的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的(藍(lán)天一, 2018)。凝集素途徑在缺乏免疫球蛋白的無脊椎動(dòng)物中具有重要的免疫作用, 海鞘補(bǔ)體系統(tǒng)的凝集素途徑的激活產(chǎn)生C3片段, 有助于吞噬細(xì)胞上結(jié)合受體進(jìn)行吞噬作用(Miyazawa, 2001)。事實(shí)上, 凝集素-MASP復(fù)合物在結(jié)構(gòu)和功能上類似于C1復(fù)合物, 基于凝集素的補(bǔ)體系統(tǒng)已逐步演變形成經(jīng)典途徑(Matsushita, 2004)。

在全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到89個(gè)基因, 其中有81個(gè)基因含有C末端球狀結(jié)構(gòu)域(Globular C1q domain, gC1q), 該結(jié)構(gòu)域作為C1qDC的核心組成部分, 主要功能是作為PRR直接與細(xì)胞外膜上的受體相互作用, 介導(dǎo)細(xì)胞吞噬和凝集(Gerdol, 2011)。大量的基因復(fù)制事件導(dǎo)致了C1qDC家族成員的擴(kuò)增, 這可能是促進(jìn)經(jīng)典途徑產(chǎn)生的重要原因(Nonaka, 2001)。C1qDC蛋白是經(jīng)典補(bǔ)體經(jīng)典途徑的起始分子, 是構(gòu)成C1復(fù)合物的重要組分; 當(dāng)C1qDC分子與免疫球蛋白IgM或IgG的Fc段結(jié)合后, C1qDC結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 進(jìn)而導(dǎo)致C1r和C1s的活化, 啟動(dòng)補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑(Kishore, 2004; Yan, 2020)。研究顯示C1qDC出現(xiàn)在脊椎動(dòng)物進(jìn)化的早期階段, 在適應(yīng)性免疫建立和免疫球蛋白出現(xiàn)之前, 原始的C1qDC作為補(bǔ)體系統(tǒng)的初始識(shí)別分子發(fā)揮免疫作用(Matsushita, 2004; Nonaka, 2006)。七鰓鰻() C1qDC分子能夠結(jié)合廣泛分布于細(xì)菌的細(xì)胞壁中的N-乙酰葡糖胺, 其功能上可能類似于凝集素, 是一種模式識(shí)別受體(Matsushita, 2004)。太平洋牡蠣C1qDC-5可以作為調(diào)理素來識(shí)別和結(jié)合細(xì)菌, 并能與血細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白相互作用, 增強(qiáng)牡蠣血細(xì)胞的吞噬作用(Lv, 2019); C1qDC-6可以作為模式識(shí)別受體, 并介導(dǎo)血細(xì)胞的吞噬作用和遷移, 以消除入侵的病原體(Lv, 2019); C1qDC-7對LPS和PGN以及革蘭陰性細(xì)菌具有很高的結(jié)合親和力(Zong, 2019)。七鰓鰻C1q-MASP-A復(fù)合物可結(jié)合病原體上的碳水化合物導(dǎo)致C3的活化及C3b的形成, 沉積在病原體的表面上的C3b具有調(diào)理素的作用(Nonaka, 1984)。

隨機(jī)挑選12個(gè)補(bǔ)體相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測, 結(jié)果顯示其中10個(gè)基因的表達(dá)水平經(jīng)溶藻弧菌刺激后顯著上升, 包括、、、、、等補(bǔ)體基因, 暗示馬氏珠母貝的補(bǔ)體系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的免疫效應(yīng)系統(tǒng), 包括并不限于這些基因參與到馬氏珠母貝的免疫響應(yīng)過程中。

4 結(jié)論

本研究基于馬氏珠母貝全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索到多種C1qDC、C型凝集素、纖維膠凝蛋白、甘露糖凝集素、甘露糖結(jié)合型凝集素關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶以及C3等補(bǔ)體相關(guān)分子。經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示, 多種補(bǔ)體樣基因參與到溶藻弧菌刺激后的免疫響應(yīng), 暗示馬氏珠母貝補(bǔ)體系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的多組分效應(yīng)系統(tǒng)。、、、、等基因呈現(xiàn)出顯著差異表達(dá), 表明馬氏珠母貝可能傾向于通過凝集途徑或類似于凝集素途徑執(zhí)行補(bǔ)體系統(tǒng)的先天免疫作用。以上研究結(jié)果為探討馬氏珠母貝體內(nèi)可能存在的補(bǔ)體系統(tǒng)的激活機(jī)制提供了研究基礎(chǔ), 對于進(jìn)一步加深對馬氏珠母貝的免疫防御機(jī)制的理解、豐富和發(fā)展無脊椎動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)的進(jìn)化過程具有理論意義。

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IDENTIFICATION AND ANALYSIS OF COMPLEMENT-LIKE COMPONENTS INBASED ON THE FULL-LENGTH TRANSCRIPTOME SEQUENCE DATASETS

WANG Jing, LI Gui-Ying, LIN Kai-Qi, OU Jing, ZHANG Shu-Ping, WANG Zhong-Liang

(Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

The complement system in animals is a complex and restricted proteolytic system, and plays a defensive role in the immune system. To explore the composition and mechanism of the complement system in, full-length transcriptome sequencing, gene alignment, and functional annotation were performed. Homology comparison and conserved domains analysis showed a total of 212 genes of potential complement components were found in, including 89 C1q domain-containing proteins, 57 C-type lectins, 33 ficolins and 11 fibrinogen-related proteins, 8 mannan-binding lectin-associated serine proteases, 2 thioester-containing proteins (1 C3 and 1 TEP), 1 complement receptor, 2 complement factors and 9 serine proteases. Real-time PCR analysis showed that the expression levels of,,,, andwere up-regulated significantly afterchallenge, indicating that the complement system ofis a complex multi-component effective system, and lectin pathway or lectin-like pathway may be used to active the complement system with the immune responses. This study provided molecular evidence for further understanding on the original complement system and the immune defense mechanism ofa, as well as the marine invertebrate immunology.

; full-length transcriptome sequence; complement components; bioinformatical analysis; real-time PCR

Q789

10.11693/hyhz20210700158

*廣東省自然科學(xué)基金-面上項(xiàng)目, 2019A1515011875號(hào); 廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(國際科技合作領(lǐng)域), 2019A050510044號(hào); 2021年度廣東省普通高校特色創(chuàng)新類項(xiàng)目, 2021KTSCX044號(hào); 廣東海洋大學(xué)2019年“沖一流”省財(cái)政專項(xiàng)資金建設(shè)項(xiàng)目; 國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目, CXXL2020002號(hào); 廣東海洋大學(xué)“南海學(xué)者計(jì)劃”(2017年度); 廣東海洋大學(xué)2021年度本科生創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目, CXTD2021001號(hào)。王 菁, 碩士研究生, E-mail: a13414942597@126.com

王忠良, 博士, 副教授, E-mail: zhongliangwang@vip.163.com

2021-07-08,

2021-08-20