雨生紅球藻培養基篩選及誘導條件優化

張勇 李林品 吳秋瑾

摘要：目的：本文通過篩選有利于雨生紅球藻營養生長的培養基，優化雨生紅球藻內蝦青素的積累條件。方法：選用7種培養基對4株雨生紅球藻分別進行培養，同時篩選出最適于4種藻株營養生長的培養基。探究雨生紅球藻在光脅迫、缺氧、高鹽3種條件下誘導蝦青素積累情況。結果：4個不同雨生紅球藻藻株在配方A培養基中的生物量比其他6種試驗培養基的生物量高1.54-6.29倍;在優勢培養基配方A中，HP3的生物量最大，可達到6.03×106個/mL;HP3在缺氮的脅迫條件下，蝦青素產量最高，可達到20.96mg/L，比光誘導獲得的最佳蝦青素產量高0.96倍，比高鹽獲得的最佳蝦青素產量高1.53倍。結論：該研究中最適于試驗藻株營養生長的培養基是配方A，當脅迫條件為缺氮9%時蝦青素積累量最大。

關鍵詞：雨生紅球藻;蝦青素;培養基篩選;誘導條件優化

近年來，隨著我國經濟的發展和人民生活水平的提高，人們對健康的意識也在不斷提高。水是水生生物中最重要的組成部分之一。雨生紅藻具有良好的生物學特性，營養價值高及無毒等優點，是一種很有前景的生物可以利用資源。雨生紅藻是自然界中廣泛存在的綠藻，屬于團藻目紅藻科。雨生紅藻又被稱為湖生紅藻或湖生雪球藻，被公認為自然界中生產天然蝦青素的最好生物，因此利用該藻菌提取蝦青素具有很大的應用前景已經成為當前國際研究的熱點。

蝦青素是一種天然的水溶性高分子化合物，具有生物活性。主要存在于藻類、細菌以及各種植物中。在自然界中，有許多氨基酸被發現并應用到生產生活與食品領域上;蝦類可以作為營養添加劑和保健品等;同時也可利用其自身所具備的酶特性來調節細胞內pH值以增強對微生物生長發育影響而發揮作用。目前在我國研究較多的是蝦類中提取出來魚粉和甲殼素兩種物質作為提取蝦青素原料，但這種方法對環境要求較高，且易受菌種的影響。而雨生紅球藻作為提取蝦青素的一種重要來源，在很多領域有著巨大價值。例如：美容化妝、健康保健、農業飼料中具有很大的價值，并且也取得了很好效果。

蝦青素是一種天然的抗氧化物質，有很強的清除氧自由基能力，可以防止重金屬離子在體內富集。目前我國對蝦類色素主要為酚酸功能型和水溶性非揮發性合成物型兩大類型;而美國、日本等國家則將其作為食品添加劑使用或直接食用。我國于20世紀80年代開始對蝦青素進行了研究開發并投入生產，但隨著科學技術的發展以及人們生活水平的提高，對于健康問題越來越重視起來，而水溶性非揮發性合成物型和可生物降解性物質的研究也日益受到關注。

在自然界中，紅球藻是一種非常常見的生物，具有很強的生物學功能和營養價值。因為雨生紅球藻能提供大量氮、磷等多種無機鹽及其他微量元素。所以可以作為優質餌料;還能夠有效調節水體PH值以及微生物生長繁殖環境條件等等這些作用都被充分利用起來。因此可以通過培養來篩選出優良種質資源之一，從而為海洋生態系統創造良好的生存空間與生態平衡，促進其更好地發展和保護生態環境發揮重要作用。

1?資料與方法

1.1?培養條件

目前，國內外對雨生紅球藻的培養技術主要分為兩種：一種是直接利用藻基質中所富含的氮元素;另一種則是從通過不同方法將各種藻類進行光合作用。在我國很多地區都有大量使用，但大多數都是以自然方式作為其生長繁殖條件。其中最常見的是人工授粉、浸種和滴灌等三種培育基形式以及混合誘導體系（即單因素培養、多因素聯合培養或混成分培植），但每種培養基都有其自身的特點，且在不同環境條件下，所表現出來的效果也是不相同。

1.2?篩選時期培養

在篩選的過程中，要根據不同藻類生長所需營養成分和數量要求進行合理地選擇。一般情況下，可以通過培養基形狀大小、顏色以及細胞形態等方面來確定。對于一些具有特殊生理活性或某些特性的菌株來說其需要經過一定周期才能達到目的;而有些微生物則不能直接利用這些微生物產生有害物質或者對環境造成污染危害等等，因此在篩選過程中要盡可能避免分離現象發生，提高微生物的生長速度。在選擇培養基時，要考慮到不同種藻類所需營養成分，以及各種因素對其影響。在實驗中，雨生紅球藻的培養數量為（2.00×104個/mL），培養溫度為（23±1）℃，光照強度（1400-1700lx），光照時間為12h/12h（光/暗），氣體條件為3%（CO2/air，v/v），存放于500mL的器皿中，器皿盛放400mL的培養基。

1.3?條件設定

首先，需要使用配方A培養HP3藻株。培養條件：溫度（23±1）℃，光照強度為（1400-1700lx），光照時間為12h/12h（光/暗），氣體條件為3%（CO2/air，v/v），將HP3藻株存放于1000mL的器皿中，器皿盛放700mL藻液。在培養15天后，采用離心技術（4000r/min，10min）收集藻類細胞，脅迫濃度5×105-6×105個/mL，其他條件不變。

在進行脅迫研究的過程中，本試驗選取缺氮、光照以及高鹽進行研究和分析，在研究光照的過程中，設置不同的光照梯度，例如：8000、10000、12000lx;另外，在研究高鹽脅迫的過程中，需要在光照12000lx的基礎上進行分析，在培養基A中加入NaAc，并且設置不同濃度梯度，例如：20、30、40、50mmol/L;研究缺氮脅迫的方法與高鹽脅迫方法類似，也是需要在光照12000lx的基礎上進行研究，將配方A中加入NaNo3原含氮量4mmol/L調整為培養基4%、8%、12%、16%，不同的脅迫條件進行對比。

1.4?色素提取與測定

色素細胞提取的方法有很多種，但是目前常用的提取劑還是水蘇醇提法、堿溶酸沉凝等。堿溶液浸取：利用NaOH與堿性磷酸氫二鉀進行反應生成氫氧化鈉和碳酸鈉來除去水中雜質離子，然后通過分光光度儀測定其吸光度;根據實驗數據可以判斷出pH值在4-5之間時色素細胞濃度較低甚至為零或極低于10-6mg/L即可達到培養基要求。

1.5?蝦青素測定

稱取0.25gNaOH，并加入4.75mL雙蒸水，制得5%溶液待用;取藻液5mL，離心后沉淀，加入700ul?5%NaOH溶液和300ul甲醇，混勻，放入65℃水中15min去除葉綠素，冷卻后離心收集沉淀，隨后用雙蒸水洗滌，加入1mL?DMSO，并在65℃水中加熱5min，隨后冷卻離心，收集上清液，反復用DMSO提取基本無色，并定容與5mL。

2?結果

2.1?培養基篩選

在篩選過程中，需要對所選培養基成分進行分析，篩選出符合實驗要求的優良基因。試驗首先通過單因素法確定出紅球藻細胞必需生長量、pH值以及溫度等條件;然后將選擇好后的培養基的接種到離心管中加入適量穩定劑并設置攪拌器和壓塊以保證其均勻性及穩定性;其次在篩選過程中將要控制變量濃度，因為發酵液會與水發生反應生成沉淀物從而影響實驗結果，因此控制變量濃度是非常重要;最后在pH值、溫度以及等條件均不變時，將雨生紅球藻培養基和純化后得到的混合型生物藻類所需要添加量進行對比，篩選出符合實驗要求且營養豐富、生長繁殖旺盛且具有較高生物學價值優質的培養基，并且將純化后得到的混合型生物藻類所需要添加量控制在10-12mg/L，且pH值、溫度及等條件均不變時，分別加入5g和7ml這兩種培養基中進行培養。HP1細胞數目最多為6.44×106個/mL。改良后，細胞數目最低為1.73×106個/mL;HP2細胞數目為5.44×106個/mL，OHM細胞數目2.56×106個/mL;HP3細胞數目最多為7.19×106個/mL，是改良MCM后的7.29倍。如圖1所示。

2.2?蝦青素誘導

蝦青素是一種天然的綠色抗氧化劑，能夠抑制細胞中各種核酸和蛋白質在細胞膜上發生氧化反應。其主要來源為水溶性氨基酸、肽鍵或其他化合物。由于這種物質具有很強的生物穩定性，所以可以利用這個特性來進行篩選培養基成分及單糖含量較高或者不溶于水中等多種酶系而被廣泛使用;另外還能與亞硝酸根離子結合形成抗營養因子和降低細胞的低聚物誘導生長發育，提高細胞的抗氧化能力。然而，在實際生產操作中，有許多因素都影響了其結果。如pH、溫度和光照等;而本實驗以水溶性生物堿作為培養基成分并通過正交試驗篩選出雨生紅球藻為誘餌進行篩選及誘導條件優化是非常具有現實意義的方法之一。

通過研究表明，光照強度10000lx下，類胡蘿卜素最高為12.10mg/L;10000lx條件下，高鹽9d后，30mmol/L?NaAc類胡蘿卜素最高為8.91mg/L，50mmol/L?NaAc最低為5.87mg/L;10000lx下，缺氮9d后，類胡蘿卜素梯度為10%（21.35mg/L）、5%（20.24mg/L）、15%（17.51mg/L）、20%（13.13mg/L）。如圖2所示。

3討論

目前，對雨生紅藻的研究主要集中于其生物特性以及環境適應性等。生物學方面：在生物界中，許多學者都發表了大量關于如何利用與開發和提高對植物生長影響因素進行試驗或研究的理論論文、實驗報告及相關文獻;而對于一些已經有一定規模并且具有代表性并能取得較好經濟效益且可以應用于實際生產應用的雨生紅球藻資源來說，其研究也是非常重要，且有很高的研究價值。本實驗以雨生紅藻為材料，利用pH法和紅外光譜等方法，通過單因素試驗、正交試驗的方式來確定最佳培養基。結果表明：在影響雨生紅球藻生長環境條件（溫度、光照強度及氮磷比）中選取三種最為適宜的初始濃度;其次是梯度處理下不同時間段光照度對其生物量以及產量均有很大程度上不同變化;最后則是從pH值和紅外光譜反應得到最適酸堿度，從而達到比較好地效果，即pH值在0-9時，其生物量最高，紅外光譜反應則為最適偏酸堿度。通過對不同初始濃度和時間下的雨生紅球藻培養基進行對比分析得出結論：當pH大于8且氮磷比小于4時才會出現較好地變化。

在雨生紅藻培養基中，最重要的就是篩選，而如何選擇合適的培養基的成為了一個難點。首先是要對不同濃度（如：磷、鉀等）和pH值下生長良好并符合要求較高溫度和光照強度大且無毒性物質污染水體。因為水本身具有弱堿性或強酸性。所以可以通過改變氮肥比例或者在一定條件下使pH降低來達到去除水中含有的鉛離子，使水體中的鉛離子濃度降低;其次是對不同pH值下培養基的優化。通過實驗模擬研究得出最適合雨生紅率生長條件;最后就是根據實驗結果分析出合適量與PH梯度相同時間段來確定其最佳操作方法及參數范圍，為以后雨生紅率的生長和培養提供理論依據。

在自然界中，水藻生物作為一種重要的植物，是其主要生長環境。由于各種原因導致雨生紅球藻不能大量繁殖。因此要將其利用起來就要有一定量的培養基進行篩選和培育以適應各種不同種類與數量以及所需氮、磷、鉀等營養元素含量豐富多變而具有較高產量價值且適合工業化生產條件要求（如：高溫下發酵）;其次，還可以在合適季節對水藻進行處理使其能夠快速生長發育。根據研究結果表明，雨生紅藻可以通過生物法、化學合成以及物理處理三種途徑來培養，其中最主要的方式是利用其生長條件和營養元素等方面進行篩選，篩選得到最佳培養基，從而為其后續的研究奠定基礎，使其能在實際生產中發揮更好作用。

蝦青素是一種在自然界中含量豐富、具有生物活性的天然高分子化合物，其廣泛存在于植物當中，在水產品加工和醫藥領域有著重要意義。然而隨著科技發展及人類生活水平提高以及食品安全問題的日益突出使得人們對食物健康質量提出了越來越高標準。而超強抗氧化性是指能清除自由基并防止細胞衰老或破壞細胞結構從而達到延長壽命等一系列要求;另外還包括具有很強耐受脅迫作用、不改變營養成分，且對人體無害的特性。因此，超強抗氧化性是食品安全問題中最重要因素之一。而藻酸鹽就是其中一種天然生物活性成分，在自然界和生活當中都有廣泛存在的應用。

蝦青素是一種廣泛存在于自然界的天然高分子化合物，含有大量氨基酸、維生素等，具有一定生物活性。在很多領域都有應用。近年來人們對其提取分離純化方法進行了研究和探索性探討發現：用超濾法、水相萃取技術處理得到的魚鱗狀海藻紅球蛋白可用于食品行業中;利用蝦青素來作為抗氧化物質添加劑應用于化妝品行業，使之達到安全標準并實現工業化生產;利用超濾技術可用于提取生物堿，使其在化妝品中的應用更廣。

4?總結

近年來，隨著生物技術的迅捷發展，在水環境中，各種類型藻類不斷地應運而生。目前我國很多地區都建立了大量的人工濕地。但是由于缺乏相應配套設施和管理體制等因素影響下無法大面積種植雨生紅球藻種源及產量;其次是由于雨生條件對生物材料生長所造成阻礙導致許多種類細菌繁殖速度慢、質量差甚至死亡現象嚴重等等一系列問題也制約著其生產應用，因此，如何提高雨生紅球藻的產量和質量成為當前急需解決的問題，而誘導條件則是實現其產量和質量的關鍵，是實現其產量和質量的關鍵。

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作者簡介：張勇（1971—??），男，漢族，上海人，博士，高級經濟師，研究方向：雨生紅球藻產業化。