四川規模種豬場5種主要疫病的病原學檢測

邵 靚，李 春，梁璐琪，周莉媛，何慶雄，周哲學*

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省綿陽市動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000）

非洲豬瘟、口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍耳病是我國當前規模化豬場危害較為嚴重的疫病，給養豬業帶來了巨大的經濟損失。2018 年8月我國遼寧省沈陽市確診第一起非洲豬瘟疫情，并于短時間內蔓延至全國，給我國養豬業造成了毀滅性的打擊，該病目前尚無有效的治療方法和疫苗。2019年以來，非洲豬瘟病毒出現了多種變異株，與2018 年傳入的非洲豬瘟毒株相比，變異株的基因組序列、臨床癥狀、致病力等均發生了明顯變化，進一步增加了防控難度。口蹄疫是危害世界各國養殖業最嚴重的疫病之一，傳播速度快、傳播途徑廣，仔豬死亡率極高，疫區發病率可達100%［1］。豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍耳病不僅引起種豬繁殖障礙，還會導致豬體免疫抑制，加重其他疫病的繼發感染，干擾疫苗免疫效果。為貫徹落實《國家中長期動物疫病防治規劃（2012—2020 年）》，近年來，四川省積極探索規模種豬場主要疫病的凈化工作，為摸清規模種豬場主要疫病種類和感染情況，掌握疫病流行特點和趨勢，評估凈化效果，本研究于2021 年上半年對成都、綿陽、達州、眉山、遂寧5 個市的8 個規模種豬場進行了非洲豬瘟、口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍耳病5種主要疫病的病原學檢測。

1 材料

1.1 主要儀器設備 組織勻漿儀購自美國MP公司；核酸自動提取儀購自天隆生物科技有限公司；CFX96 熒光定量PCR 儀購自美國伯樂公司。

1.2 檢測試劑 磁珠法核酸提取試劑盒購自天隆生物科技有限公司；非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司；口蹄疫病毒（A/O/Asia I）熒光定量RT-PCR檢測試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所；豬瘟病毒野毒株實時熒光RT-PCR 試劑盒，豬偽狂犬病毒（gE基因）實時熒光PCR檢測試劑盒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株與美洲株雙重實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經典株與高致病性變異株雙重實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征（類NADC-30 毒株）實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒，均購自北京世紀元亨公司。

1.3 樣品 在成都、綿陽、達州、眉山、遂寧等規模化程度高及整體生物安全水平好的地區，針對已開展動物疫病凈化的規模種豬場進行病原學檢測。每個地區至少選擇1 個種豬場，共選擇了8個種豬場（綿陽3個，達州2個，成都、眉山、遂寧各1 個），分別采集場內發病死亡豬的肺、肝、脾、腎以及其他發生明顯病變的組織，每份組織大小不超過5 cm×5 cm×5 cm，單獨用小自封袋包裝并注明編號和組織名稱。同一頭豬的組織放在一個大自封袋內，-20 ℃保存備用。一頭豬的組織作為1頭份，共采集組織樣品294頭份。

2 方法

2.1 樣品前處理 將1 頭份樣品的每種類型組織用無菌剪刀分別剪取約0.05 g，混合后放入裂解管，加入1 mL滅菌PBS（pH 7.2）和陶瓷珠，使用組織勻漿儀勻漿1 min，取出后以8 000 r/min 離心2 min，取上清200 μL進行總核酸提取。

2.2 核酸提取 使用磁珠法核酸提取試劑盒和核酸自動提取儀進行總核酸提取。提取程序按照說明書導入。提取完成后，總核酸置-20 ℃保存備用。

2.3 5種病毒的實時熒光RT-PCR/PCR檢測 使用各病毒對應的實時熒光RT-PCR/PCR 檢測試劑盒進行核酸檢測，操作步驟按照各試劑盒說明書進行。豬藍耳病首次檢測采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒；分型檢測依次采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株與美洲株雙重實時熒光RT-PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經典株與高致病性變異株雙重實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征（類NADC-30 毒株）實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。

2.4 結果判定 根據各試劑盒說明書進行結果判定。陽性對照Ct值≤陽性臨界值并出現典型的擴增曲線，陰性對照無Ct 值且無特定擴增曲線，試驗結果成立。樣品Ct值≤陽性臨界值并出現典型的擴增曲線，判為陽性；陽性臨界值＜樣品Ct值＜陰性臨界值并出現典型的擴增曲線，判為可疑，需重新取樣提取總核酸，再次擴增后進行結果判定，如結果為陽性或仍是可疑，則判為陽性；樣品Ct值≥陰性臨界值或未出現典型的擴增曲線時，判為陰性。

3 結果

3.1 5種病毒的病原檢測結果 所有檢測的陽性對照、陰性對照均成立。

從表1 可知，294 頭份樣品中，非洲豬瘟、口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病病原檢測結果均為陰性，豬藍耳病檢出14 頭份陽性，陽性率為4.76%（14/294）。豬藍耳病陽性組織樣品分布于3個種豬場（眉山1 個、綿陽2 個），3 個場豬藍耳病陽性率分別為12.5%、10%、19.35%。

表1 規模種豬場5種主要疫病的病原檢測結果

3.2 豬藍耳病分型檢測結果 將14頭份豬藍耳病陽性組織樣品采用熒光RT-PCR檢測試劑盒進行進一步分型鑒定，結果顯示：綿陽2個場的9頭份陽性均為美洲型經典株；眉山1 個場的5 頭份陽性樣品中，3 頭份為類NADC-30 毒株，2 頭份為美洲型經典株與類NADC-30 毒株混合感染的毒株。以上結果表明，四川省目前流行的豬藍耳病毒株以美洲型經典株與類NADC-30 毒株為主，且個別地區存在上述兩種毒株混合感染的情況。

4 討論與建議

隨著社會的不斷發展，我國養殖業逐漸實現規模化、集約化。近年來，從對全國重點原種豬場主要疫病的監測情況來看，當前我國種豬場呈現病原混合感染多、疫病流行日益嚴重和復雜的趨勢，尤其是2018 年以來非洲豬瘟的傳入，進一步加劇了疫病防控的嚴峻形勢。凈化種豬動物疫病，降低病原傳播風險，有利于生豬產業健康穩定發展，對解決種業發展（種豬業）“卡脖子”關鍵技術難題具有重大意義。我國口蹄疫防控參照OIE 推薦的“口蹄疫漸進性控制計劃（PCPFMD）”路線圖實施，按照“因地制宜、分區防治、分型控制”的管理原則，大力推進口蹄疫綜合防制策略。依據PCP-FMD 的評估規定，我國目前處于PCP 的第3 階段，即實行根除流行的控制措施、減少病毒循環［2］。當前，全國原種豬場豬偽狂犬病的凈化已初見成效，但是部分場個體陽性率仍較高，短期內凈化還存在一定難度。大多數原種豬場的豬瘟已得到了有效控制甚至達到了免疫凈化，但要進一步提升防控效果，并在全部種豬場實現豬瘟凈化，仍面臨著政策、經濟、技術等層面的諸多制約因素。原種豬場豬藍耳病在2015～2016 年出現反彈，與類NADC-30 毒株的傳入時間相吻合，使得豬藍耳病的防控形勢更趨復雜［3］。

本研究對四川省內5個市的8個規模種豬場開展了非洲豬瘟、口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍耳病5 種主要疫病的病原學檢測，為全省科學開展種豬疫病的防控與凈化提供了技術支撐。從檢測結果來看，四川省規模種豬場主要疫病凈化工作取得了初步成效，但個別地區還存在豬藍耳病感染，建議各地在已有凈化工作的基礎上，進一步完善落實種豬疫病防控措施，加大政策與技術支持力度，從種豬源頭控制動物疫病。■