利用重組大腸桿菌和馬克斯克魯維酵母高效催化合成D-阿洛酮糖

袁堂國,李益民,杜聰,馮延賓,范超,洪皓,袁文杰*

1(大連理工大學 生物工程學院,遼寧 大連,116024)2(大連醫諾生物股份有限公司,遼寧 大連,116600)

D-阿洛酮糖(D-核糖-2-己酮糖)是D-果糖的碳-3差向異構體,是一種稀有的單糖,在自然界中天然存在[1]。D-阿洛酮糖因其特殊的營養價值受到了國內外的廣泛關注。在醫藥領域,其降血脂、降血糖和抗氧化的功能引起了重視[2-4]；在食品領域,其甜度相當于蔗糖的70%,熱量相當于蔗糖的0.3%,可做為一種健康、安全的甜味劑使用[5]。但D-阿洛酮糖在自然界中含量很低,采用化學法合成D-阿洛酮糖,萃取分離步驟比較復雜[6]。而生物轉化策略,是一種前景廣闊、環境友好的D-阿洛酮糖生產方法[7-8]。

目前,生物法生產D-阿洛酮糖主要是通過D-阿洛酮糖3-差向異構酶(D-allulose 3-epimerase,DAEase)家族酶轉化D-果糖生成。在重組大腸桿菌表達體系中,不同來源的DAEase轉化D-果糖生成D-阿洛酮糖的得率均不超過33%,D-阿洛酮糖與D-果糖的平衡參數從20∶80到33∶67[9]。此外,DAEase家族酶熱穩定性較差,雖然大多數酶在低于50 ℃的條件下具有較好的熱穩定性,但在超過50 ℃的條件下迅速失活,Clostridiumsp.來源的DAEase的半衰期僅有15 min。酶的長時間穩定使用是阿洛酮糖生產中需要解決的重要問題之一。文獻中報道,金屬離子可以有效穩定DAEase的構象,且最適離子通常是Mn2+或Co2+[9-10]。

以全細胞作為生物催化劑,可以避免酶的分離純化步驟,如細胞裂解、沉淀,而且酶的熱穩定性和對環境的抗干擾能力比自由酶更優[11-12],適于D-阿洛酮糖的生物合成。例如,來源于Agrobacteriumtumefaciens的DAEase重組大腸桿菌表達體系在50 ℃、pH 8.0、底物質量濃度為700 g/L的催化條件下,阿洛酮糖的轉化率可以達到32.9%。還有研究者將葡萄糖異構酶和DAEase構建到同一個表達載體中,利用重組大腸桿菌將D-葡萄糖異構化為D-果糖,然后再將產物D-果糖異構化為D-阿洛酮糖[13]。但是D-阿洛酮糖轉化率偏低,導致該工藝生產成本仍居高不下。

底物和產物的純化成本較高,也是限制D-阿洛酮糖在市場上廣泛應用的原因。從D-果糖中分離D-阿洛酮糖是一個復雜的過程,目前文獻報道的主要有3種方法：利用模擬移動床層析和陰離子交換樹脂基質[14-16],但需要復雜的設備和較高的設備投入;通過葡萄糖異構酶和葡萄糖氧化酶將D-果糖轉化為葡萄糖酸[10],通過改變物質的物理和化學特性的差異來進行分離;使用耐高溫的重組馬克斯克魯維酵母發酵剩余果糖來降低D-阿洛酮糖的分離難度[17]。

綜上,為進一步提高全細胞催化果糖生產D-阿洛酮糖的轉化率,并降低分離難度,本文提出了一種低成本的D-阿洛酮糖兩階段生產工藝。在大腸桿菌中表達了來源于Flavonifractorplautii的DAEase,使用該重組菌在添加硼酸的情況下高效轉化果糖后,利用馬克斯克魯維酵母菌Y179發酵剩余的D-果糖生產乙醇。本研究為D-阿洛酮糖的高效、低成本生產提供了參考。

1 實驗材料和方法

1.1 材料和操作方法

Flavonifractorplautii來源的DAEase的基因序列(GenBank:CP048436.1),根據大腸桿菌中密碼子的偏好性進行了優化,由上海生工生物技術有限公司完成,連接至pET29a,構建了表達質粒pET29a-DAEase。

以大腸桿菌DH5α為宿主菌株進行質粒保存,以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌株進行DAEase目標蛋白表達。發酵階段利用馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus) Y179將剩余的D-果糖轉化為乙醇。

大腸桿菌重組菌株在含有50 mg/L卡那霉素的LB培養基中振蕩培養,在37 ℃、180 r/min條件下生長12 h。取5 mL菌液接種于含50 mg/L卡那霉素的250 mL三角瓶中,37 ℃,180 r/min條件下擴大培養。當細胞生長狀態OD620值達到0.6時,加入終濃度是0.04 mol/L的誘導劑IPTG,18 ℃、180 r/min振蕩培養16 h,誘導DAEase的表達。通過離心(12 000 r/min,15 min,4 ℃)的方法收集菌體。

1.2 細胞干重和細胞裂解情況的測定

將誘導的重組大腸桿菌離心回收(12 000 r/min,15 min)獲得濕菌體,然后將離心獲得的濕菌體放入85 ℃烘箱中烘干,24 h后稱量菌體的質量,獲得濕重與干重的關系。

本研究是利用重組大腸桿菌全細胞進行催化反應,為了檢測重組細胞在反應過程中的裂解情況,通過離心收集65 ℃,60 min反應后的上清液,使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定上清液中蛋白質的含量。將上清液中蛋白質的含量與利用超聲破碎離心獲得的上清液蛋白質含量的百分比來計算細胞的裂解率。

1.3 pH、溫度、金屬離子對重組全細胞催化速率的影響

為了研究重組大腸桿菌的最適反應pH,在含有質量濃度200 g/LD-果糖的Tris-HCl緩沖液中(不同pH)進行反應,65 ℃條件下反應10 min后利用金屬浴在99 ℃條件下加熱滅活10 min,測定D-阿洛酮糖的生成速率來反映重組全細胞催化活性。

對于重組大腸桿菌的最適反應溫度的確定,通過檢測在含有200 g/LD-果糖的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中不同溫度(50～75 ℃)條件下的催化速率,確定最佳反應溫度,反應10 min后加熱滅活,檢測樣品中產物D-阿洛酮糖的濃度。

在探究金屬離子對全細胞催化速率的影響時,將重組大腸桿菌重懸在含有不同金屬離子的Tris-HCl緩沖液中,在4 ℃冰箱中孵育2 h,pH 7.5、65 ℃反應10 min后加熱滅活,檢測產物D-阿洛酮糖的濃度。

為了研究溫度對酶穩定性的影響,考察了添加與不添加Co2+條件下全細胞催化活性。將回收的重組細胞重懸在Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中,60 ℃條件下放置2 h,在一定時間間隔下提取樣品,加入終質量濃度200 g/LD-果糖,在pH 7.5、65 ℃條件下反應10 min后滅活,檢測產物D-阿洛酮糖的濃度,確定剩余的酶催化活性。

D-阿洛酮糖濃度采用HPLC檢測,使用Ca2+色譜分離樹脂交換柱,柱溫80 ℃,超純水洗脫,流速0.4 mL/min。

1.4 細胞濃度對重組全細胞催化速率的影響

將不同質量濃度(0.3～3 g/L,細胞干重)的重組大腸桿菌細胞加到一定質量濃度(200 g/L)的D-果糖下測定D-阿洛酮糖的轉化結果。Tris-HCl體系中65 ℃反應60 min,通過HPLC檢測D-阿洛酮糖的生成情況。

1.5 緩沖體系對重組全細胞催化速率的影響

將誘導表達的重組大腸桿菌細胞置于Tris-HCl、超純水、PBS和Glycine-NaOH緩沖液中,65 ℃反應60 min,采用HPLC檢測D-阿洛酮糖的產量。

1.6 硼酸存在對重組全細胞催化速率的影響

將一定量的重組大腸桿菌細胞分別添加到含有D-果糖400 g/L、硼酸68.6 g/L溶液和含有D-果糖600 g/L、硼酸102.9 g/L的溶液中(D-果糖和硼酸的摩爾比是2∶1),用NaOH溶液調節pH到7.5,在65 ℃條件下反應60 min,通過HPLC檢測產物D-阿洛酮糖的產量。

1.7 馬克斯克魯維酵母發酵剩余D-果糖

將重組大腸桿菌全細胞催化反應后的溶液離心除去菌體,獲得混合糖溶液,在溶液中加入5 g/L的馬克斯克魯維酵母,180 r/min、37 ℃條件下發酵,消耗剩余的D-果糖,生產乙醇,發酵12 h后補充加入5 g/L的馬克斯克魯維酵母。不同時間段采集樣品,采用HPLC檢測,ROA有機酸柱(300 mm×7.8 mm,Bio-Rad,Aminex,HPX-87H)進行產物分析,柱溫50 ℃,流動相為0.005 mol/L H2SO4,流速0.5 mL/min。

2 結果與分析

2.1 目標基因DAEase的表達分析

通過密碼子優化和培養條件優化,在大腸桿菌BL21中實現了DAEase的高水平表達。采用SDS-PAGE分析了DAEase的表達量和分子質量(圖1)。結果表明,與不含有載體pET29a-DAEase的菌體比較,構建的重組大腸桿菌在33 kDa左右出現了明顯的條帶,與DAEase理論值一致。誘導條件為37 ℃、16 h時,沉淀中含有大量的不溶性包涵體,上清液中目的蛋白含量較少；誘導條件為18 ℃時,雖然沉淀中仍有少量目標蛋白,但上清液中的可溶目標蛋白明顯增多。因此選擇的誘導條件是18 ℃、16 h。在之前的報道中,來自F.plautii的DAEase編碼基因在Corynebacteriumglutamicum和大腸桿菌中均能成功表達,但在C.glutamicum中的表達量遠低于大腸桿菌。在本研究中,經過密碼子優化后,DAEase的表達量比之前文獻報道的更高,保證了差向異構化反應更快進行。

M-蛋白marker；1-空載的全細胞(pET29a)；2-空載的破碎沉淀(pET29a)；3-空載的破碎上清液(pET29a)；4-含目的基因的全細胞(pET29a-DAEase)；5-含目標基因的破碎沉淀(pET29a-DAEase)；6-含目的基因的破碎上清液(pET29a-DAEase)；7-含目的基因的全細胞(pET29a-DAEase)；8-含目標基因的破碎沉淀(pET29a-DAEase)；9-含 目的基因的破碎上清液(pET29a-DAEase)圖1 重組大腸桿菌中DAEase的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of DAEase in recombinant E.coli 注:1～6菌體的誘導條件是18 ℃、16 h;7～9菌體的 誘導條件是37 ℃、16 h

2.2 溫度、pH、金屬離子對重組大腸桿菌全細胞催化反應的影響

通過圖2-a可知,pH 7.0～8.0時,全細胞催化活性保持在90%以上,最適pH是7.5。全細胞反應的最適溫度是65 ℃(圖2-b),這些結果與文獻報道結果相似。DAEase家族的反應條件屬于弱堿性,最適反應溫度較高。在考察金屬離子對全細胞催化活性的影響時,將未添加金屬離子的對照組的催化活性設為100%,通過圖2-c可知,加入EDTA會完全抑制DAEase的活性,Cu2+和Ca2+等二價金屬離子部分抑制DAEase的活性,Co2+和Mn2+增強了催化活性,特別是Co2+對催化活性的提高更加明顯。

a-pH；b-溫度；c-金屬離子；d-熱穩定性圖2 pH、溫度、金屬離子對重組全細胞催化反應的影響Fig.2 Effects of pH,temperature and metal ions on whole-cell catalytic reactions

在60 ℃下測定了添加和不添加Co2+條件下DAEase的熱穩定性。圖2-d顯示,添加Co2+不僅增強了DAEase的催化活性,而且提高了熱穩定性,添加1 mmol/L Co2+,60 ℃下孵育2 h后催化活性仍保持在80%以上。在60 ℃下不添加金屬離子,酶的半衰期為2.7 h,比文獻報道的其他DAEase半衰期更長,說明來源于F.plautii的DAEase的熱穩定性較好,適于高溫下的催化反應。

2.3 細胞濃度對重組全細胞催化速率的影響

不同重組細胞濃度對催化效果有明顯影響,通過圖3可知,反應時間在10、30、60 min,催化反應速率均隨著細胞濃度的增加而提高。當添加的細胞質量濃度為2.4或3.0 g/L時,催化速率和轉化率幾乎一樣,反應60 min后,轉化率均可達到33%。

圖3 細胞濃度對D-阿洛酮糖生產的影響Fig.3 Effect of cell concentration on the production of D-allulose

為了探究重組細胞(2.4 g/L干重)催化果糖異構化的動力學過程,對阿洛酮糖隨反應時間的轉化率進行了分析。由圖4可知,催化反應60 min后轉化率達到33%,隨時間的延長,轉化率沒有明顯的提高,說明在60 min時已經達到了反應終點。通過對上清液中存在的蛋白質濃度分析可知,65 ℃下反應60 min后,重組大腸桿菌的裂解率為16%左右。

圖4 轉化率隨反應時間的變化Fig.4 Change of conversion rate with reaction time

2.4 緩沖體系對重組全細胞催化速率的影響

不同緩沖體系對催化效果沒有明顯影響,通過表1可知,在Tris-HCl、PBS、Glycine-NaOH以及超純水中,阿洛酮糖的最終轉化率都可以達到33%,這為接下來的發酵階段提供了有利的條件。由于重組細胞可以將純水中的D-果糖有效的轉化成D-阿洛酮糖,可以避免額外添加各種離子,簡化了生產步驟并降低了分離純化難度和成本。

表1 不同緩沖體系下生產D-阿洛酮糖Table 1 Production of D-allulose under different buffer systems

硼酸根可以與多羥基化合物結合形成絡合物,其結合能力因糖的種類不同而有所區別。D-阿洛酮糖與硼酸根結合形成的絡合物比D-果糖與硼酸根結合形成的絡合物更加穩定,所以在催化體系中添加硼酸根有利于反應向生成D-阿洛酮糖的方向移動,從而提高D-果糖的轉化率[18-20]。實驗結果表明,在含有硼酸根的情況下,當初始底物D-果糖的質量濃度為600 g/L時,產物D-阿洛酮糖的終質量濃度可達到378 g/L(表1),轉化率達到了63%。

2.5 馬克斯克魯維酵母發酵剩余D-果糖生產乙醇

由于底物果糖和產物阿洛酮糖是同分異構體,在現有技術條件下分離成本較高[21]。本研究利用馬克斯克魯維酵母將未轉化的D-果糖發酵成乙醇,降低D-阿洛酮糖分離純化難度。實驗結果表明,初始200 g/L的D-果糖溶液,在不添加硼酸的條件下,重組大腸桿菌催化完成后,體系中剩余130 g/L的D-果糖,添加5 g/L(干重)的馬克斯克魯維酵母,可以在15 h之內將剩余的D-果糖全部發酵生成乙醇,乙醇質量濃度達到60 g/L,而D-阿洛酮糖的量沒有變化(圖5-a)。在添加硼酸根的反應體系中,利用重組大腸桿菌完成異構化后,體系中剩余65 g/L左右D-果糖,發酵階段添加5 g/L馬克斯克魯維酵母,剩余D-果糖也可以全部轉化成乙醇,質量濃度為26 g/L。雖然高濃度硼酸會抑制馬克斯克魯維酵母菌的發酵,乙醇發酵速率明顯低于不添加硼酸的發酵體系,但異構化階段剩余的D-果糖也能在18 h內完全發酵生成乙醇(圖5-b),發酵前后D-阿洛酮糖的濃度沒有明顯變化,兩種體系的糖醇轉化率都在0.4 g/g左右。

本研究中,將硼酸添加到反應體系中促進了阿洛酮糖的生成。由于D-果糖與硼酸的絡合能力弱于D-阿洛酮糖與硼酸的絡合能力,所以反應向生成D-阿洛酮糖的方向轉移[19],D-阿洛酮糖轉化率達到了63%(硼酸根與D-果糖的摩爾比1∶2),而不添加硼酸的反應體系轉化率僅有33%。添加馬克斯克魯維酵母將剩余果糖用完后,可以將pH調節到酸性條件,解除硼酸根與D-阿洛酮糖的絡合,然后通過結晶的方法分離出硼酸根,實現硼酸的重復利用[22]。因此,兩階段生產D-阿洛酮糖的生產工藝,既可以獲得高濃度和高轉化率的D-阿洛酮糖,又可實現D-果糖的全部利用,降低了D-阿洛酮糖的分離純化難度和成本。

a-無硼酸根；b-添加硼酸根圖5 乙醇、D-果糖和D-阿洛酮糖的濃度隨發酵 時間的變化而變化Fig.5 Concentrations of ethanol,D-fructose and D-allulose during fermentation

3 結論與討論

D-阿洛酮糖因其在食品領域、醫藥領域特殊的營養價值和生理功能而受到廣泛關注。本研究利用不同菌株的全細胞反應,將果糖異構化階段和發酵階段分開進行,既提高了阿洛酮糖的轉化率,又將剩余的D-果糖全部發酵成乙醇,降低了阿洛酮糖的分離難度。在果糖轉化的整個生產過程中,只需要添加重組大腸桿菌和馬克斯克魯維酵母,不需要添加額外的金屬離子和氮源。若添加適當濃度硼酸溶液,則有高達63%的D-果糖轉化成阿洛酮糖。發酵階段利用馬克斯克魯維酵母將剩余的D-果糖全部發酵成乙醇,得率為0.4 g/g。本研究可以實現D-果糖的全利用,得到高濃度的不含D-果糖的高純度D-阿洛酮糖溶液和一定量的乙醇,對阿洛酮糖的低成本工業化生產具有重要的指導意義。