柚皮苷二氫查爾酮的制備及其呈甜機理研究

彭穎,潘思軼,張德新

1(湖北中醫藥大學 檢驗學院,湖北 武漢,430065) 2(華中農業大學 食品科技學院,湖北 武漢,430070) 3(安琪酵母股份有限公司,湖北 宜昌,443003)

化橘紅(ExocarpiumcitriGrandis)是產于廣東省化州市(原化州縣)的化州柚,是自古應用的特色地道藥材,因其外果皮密被茸毛,習稱毛橘紅；而柚的外果皮光滑無毛,習稱光橘紅,毛橘紅質量優于光橘紅,明清兩代更曾列為皇室貢品[1]。化橘紅在宋代以后就開始入藥,主治風寒咳嗽、實積暖氣及喉癢痰多等癥,作為一種藥材,化橘紅有很悠久的歷史[2],胡夢君[3]采用醇提法提取化橘紅黃酮,發現化橘紅中的黃酮主要是柚皮苷和野漆樹苷,兩者占黃酮總量的84%以上,且柚皮苷含量遠大于野漆樹苷,柚皮苷占2種物質含量的72.45%,已有報道[4-6]柚皮苷具有多種生理活性,歐陽振宇[7]以柚皮渣為原料,超聲波輔助提取柚皮苷,并用D101大孔樹脂分離富集,得到純度為83.7%的柚皮苷；柚皮苷在堿性條件下加壓并以鈀碳作為催化劑合成柚皮苷二氫查爾酮(naringin dihydrochlcone,Naringin DC),產率為85.2%。TANG等[8]和湯冬梅[9]以超聲波輔助乙醇提取香柚皮中的柚皮苷,并用弱極性AB-8樹脂分離純化柚皮苷,NaOH溶液作為洗脫劑,得到純度為77.26%的柚皮苷堿溶液,最后將該堿液在催化劑雷尼鎳的作用下,加氫合成Naringin DC。Naringin DC作為黃酮類甜味劑,不僅具有甜度大的特點,還是一種強抗氧化劑[10-12]。

甜味是通過口腔味覺受體細胞膜上的味覺受體第一家族T1Rs識別并傳遞信號[13-15]。計算機分子模擬技術是一種新型的虛擬藥物篩選的技術,該技術成本低,不僅能降低所需的活性篩選藥物分子數量,還能提高發現先導活性化合物的效率。藥效團是對受體起作用的藥物小分子所共有的并與大分子之間起關鍵活性作用的藥效特征元素及空間結構,藥效特征元素可以是疏水基團、化學基團和氫鍵受體基團等[16]。

本研究利用化橘紅提取柚皮苷單體,并催化加氫制備柚皮苷二氫查爾酮,進一步用SYBYL-X及Discovery Studio 2.5軟件對柚皮苷二氫查爾酮的甜味機理及甜味藥效團進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正毛化橘紅,化州市平定鎮；柚皮苷標準品、柚皮苷二氫查爾酮標準品,上海源葉。

RE-52AA旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠；Niconlet6700傅里葉紅外光譜儀,美國熱電公司；JSM-IT300掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM),日本電子株式會社；CJF-0.5不銹鋼高壓反應釜,鞏義市予華儀器有限責任公司；SYBYL-X2.0軟件,Tripos公司；Discovery Studio 2.5軟件,Accelrys公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 化橘紅柚皮苷提取及水沉法純化

稱取500 g化橘紅粉末,在提取溫度57.5 ℃,液料比60.9∶1(mL∶g),乙醇體積分數為50.8%的條件下提取化橘紅柚皮苷[17]。化橘紅乙醇提取液經過旋蒸回收乙醇,得到化橘紅浸膏,浸膏加蒸餾水調整質量濃度為1.048 2 g/mL,10 ℃靜置12 h過濾得到純度為95.1%的化橘紅柚皮苷[18]。

1.2.2 水沉產物的紅外光譜分析

使用美國Nicolet6700型紅外光譜儀,采用KBr壓片法制樣,測定水沉產物紅外圖譜。相關參數為：KBr與樣品置于WS70-1紅外線快速干燥器烘干至少2 h；于干燥器門口取10 mg樣品與500 mg KBr于瑪瑙研缽中混合并研至顆粒細小、無反光為止；將研磨后的粉末置于壓片裝置中壓片,壓力為20～25 MPa,壓片時間為10～60 s[19]。

1.2.3 水沉產物的SEM分析

采用日本電子株式會社JSM-IT300型SEM設備觀察加氫產物形貌,加氫產物進行表面噴鍍金保護層處理。SEM主要技術參數為二次電子像分辨率3.0 nm；背散射電子像分辨率4.0 nm；放大倍數范圍：300～5 000；電子槍加速電壓20 kV；圖像種類：二次電子像；標尺長度5～50 μm[20]。

1.2.4 水沉產物的核磁共振碳譜(13C nuclear magnetic resonance,13C NMR)分析

利用13C NMR分析水沉產物的碳譜,樣品的制備方法為：取20 mg水沉產物充分溶解于0.6 mL氘代甲醇后移入核磁管中備用。

1.2.5 加氫產物的制備

不銹鋼高壓反應釜中加入1.2.1中制備的柚皮苷5.0 g,緩慢加入NaOH溶液使反應溶液終pH值為13,加入過量質量分數為10%鈀碳催化劑,壓力為1.5 MPa,溫度設為40 ℃,置于磁力攪拌器上,在反應開始的2 h通入氫氣,間隔1 h后關閉氫氣閥門以保持反應速率。在12 h后結束反應,產物過濾回收催化劑,濾液通過732型陽離子交換樹脂除去NaOH溶液,靜置過濾烘干得到加氫改性產物[7]。

1.2.6 加氫產物的紅外光譜分析

方法同1.2.2。

1.2.7 加氫產物的SEM分析

方法同1.2.3。

1.2.8 加氫產物的13C NMR分析

利用13C NMR分析加氫產物的碳譜,樣品的制備方法同1.2.4。

1.2.9 Naringin DC甜度測定

參照甜度的感官比較法[21],測定樣品甜度。

1.2.10 分子對接研究Naringin DC呈甜機理

G蛋白偶聯受體是認可度較高的甜味受體,這類受體有2個與甜味相關的亞型,分別為T1R2、T1R3,用Discovery studio軟件的modeller模塊同源建模,構建蛋白質三維結構,然后用autodock vina做Naringin DC與2個蛋白受體模型的分子對接,從而從生化結構方面解釋Naringin DC呈甜原因。

1.2.11 分子對接步驟

采用ChemBioDraw Ultra 12.0畫出化合物柚皮苷二氫査爾酮的結構(圖1),然后用ChemBio3D Ultra 12.0轉化為三維結構,并使用MMFF94力場進行優化。人甜味受體T1R2和T1R3的三維結構均由SWISS-MODEL同源建模得到(模板蛋白PDB ID為5K5T)。T1R2和T1R3蛋白和柚皮苷二氫査爾酮均使用AutodockTools 1.5.6轉化為PDBQT格式。采用Autodock vina 1.1.2進行分子對接研究。T1R2和T1R3蛋白活性位點的坐標均設置為：center_x=4.277,center_y=-16.512,center_z=-44.368；size_x=15,size_y=15,size_z=15。為了增加計算的準確度,將參數exhaustiveness設置為20。除了特別說明,其他參數均采用默認值。選取打分值最高的構象用PyMoL 1.7.6進行結果分析。

圖1 柚皮苷二氫査爾酮的結構Fig.1 Structure of naringin dihydroderone

1.2.12 藥效團研究加氫改性產物呈甜機理

1.2.12.1 小分子的準備

采用ChemBioDraw Ultra 12.0畫出化合物A-J的結構(圖2),然后用ChemBio3D Ultra 12.0轉化為三維結構,并使用MMFF94力場進行初步優化。然后將10個小分子分別用SYBYL-X 2.0進行優化。使用Tripos力場進行優化,加載Gasteiger-Huckel電荷,當能量梯度收斂達到0.005 kcal/(mol·A)或是迭代次數超過1 000,則優化停止。

圖2 十種二氫查爾酮分子結構Fig.2 Ten molecular structures of dihydrochalcone

1.2.12.2 藥效團的構建

啟動Discovery Studio 2.5,使用Common Feature Pharmacophore Generation protocol 來產生藥效團。

(1)將10個化合物導入 Discovery Studio 2.5

(2)為10個化合物添加藥效團參數：Principal 和 MaxOmitFeat

使用View | Data Table展示Data Table,隱藏除Name以外的數據列。選擇Data Table Name列的heading,鼠標右鍵點擊選擇Add Attributes,給分子添加Principal參數,點擊OK。然后在Data Table中將化合物B的Principal值改為2。重復上面操作,為各小分子添加MaxOmitFeat參數,點擊OK。最終得到3D Windows內容。

(3)加載protocol,輸入計算參數

Ⅰ)加載protocol,雙擊Protocol Explorer窗口Pharmacophore下的Common Feature Pharmacophore Generation protocol。

Ⅱ)指定ligand：選擇All ligands from a 3D view選項。

Ⅲ)其他參數設置：Conformation Generation設置為Best；Number of Leads That May Miss設置為2；Advanced | Complete Misses設置為1；Advanced | Feature Misses設置為1。

(4)點擊Run按鈕開始計算

雙擊Jobs Explorer 窗口中相應的行,出現Common Feature Pharmacophore Generation-html window。本次計算一共產生了10個藥效團模型,可以點擊ViewResults1.pl ViewResults10.pl依次察看各個藥效團。

2 結果與討論

2.1 加氫改性反應過程及機理

圖3為柚皮苷催化加氫改性反應機理。

a-堿性開環；b-催化加氫；c-二氫黃酮堿性開環機理；d-Pd-C催化烯烴加氫機理圖3 柚皮苷催化加氫機理Fig.3 Catalytic hydrogenation mechanism of naringin

首先柚皮苷在堿性條件下開環得到柚皮苷査爾酮,見圖3-a及圖3-b。具體反應機理如圖3-c所示。堿拔掉羰基α-氫原子,成負離子,然后電子轉至芐位碳上,碳氧鍵斷開,成雙鍵和氧負離子。

然后柚皮苷査爾酮在Pd-C催化下,加氫得到Naringin DC,催化加氫歷程如圖3-d所示：Pd催化劑將氫和烯吸附在它的表面,這種吸附是一種化學吸附。吸附后氫分子的原子之間的σ鍵變弱,氫幾乎以原子狀態被吸附在Pd催化劑表面,烯的π鍵打開,即與金屬表面成鍵,氫逐步轉到烯上,形成加成產物。

2.2 水沉產物的紅外圖譜

水沉得到的產物紅外光譜圖如圖4所示。

由圖4可以看出,水沉產物紅外特征吸收峰分析如下：1 642.88 cm-1處有強吸收,為羰基的伸縮振動峰；3 393.71 cm-1處有寬而強的吸收峰,為羥基的伸縮振動峰,由氫鍵締合后的羥基引起；2 919.28 cm-1為甲基不對稱伸縮振動峰；1 521.00 cm-1為苯環上碳碳雙健的骨架振動,符合柚皮苷的紅外圖譜[4]。

圖4 水沉產物的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of aqueous precipitate products

2.3 水沉產物SEM結果

圖5是不同視野下的水沉產物掃描電鏡照片,可以看出加水靜置過程中,柚皮苷以結晶的形式從水中析出。

注:a-×5 000;b-×2 000;c-×1 000;d-×500;e-×300圖5 水沉產物SEM照片Fig.5 Scanning electron microscope photographs of water settlement products

2.4 加氫改性產物紅外光譜結果分析

圖6 催化加氫產物的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of catalytic hydrogenation products

2.5 加氫改性產物SEM結果分析

圖7為不同視野下的柚皮苷催化加氫改性產物掃描電鏡圖。

注:a-×5 000;b-×2 000;c-×1 000;d-×500;e-×100圖7 加氫改性產物SEM照片Fig.7 SEM photographs of hydrogenated modified products

由圖7可以看出,干燥的加氫改性產物是結晶狀態,與Naringin DC的狀態相同,由于在常溫水溶液中容易形成晶體析出,因此Naringin DC在常溫水溶液中的溶解度極低。

2.6 水沉產物13C NMR分析結果

圖8 水沉產物13C NMR結果Fig.8 13C NMR of water settling products

圖9 柚皮苷分子結構式Fig.9 Molecular structure formula of naringin

由圖8可以看出：13C NMR,CD3OD,100 MHz,δ：207.04(C-3),165.44(C-7),164.65(C-5),164.61(C-9),156.49(C-13),133.85(C-10),130.37(C-11,15),116.16(C-12,14),106.89(C-4),102.50(C-1′,7′),99.36(C-6),96.28(C-8),79.09(C-2′),78.90(C-1),78.17(C-5′),74.00(C-3′),72.25(C-11′),72.16(C-8′),71.26(C-10′),69.98(C-9′),62.33(C-4′),47.58(C-6′),31.27(C-2),18.28(C-12′)。13C NMR圖譜解析結果與柚皮苷的結構式(圖9)一致,可知水沉產物是柚皮苷。

2.7 加氫產物13C NMR分析結果

由圖10可知：13C NMR,CD3OD,100 MHz,δ：198.58(C-3),166.55(C-7),164.99(C-5),164.67(C-9),159.12(C-13),130.81(C-10),129.19(C-11,15),116.37(C-12,14),104.93(C-7′),102.58(C-1′),99.35(C-4),97.87(C-6),96.78(C-8),80.73(C-2′),79.12(C-5′),78.96(C-3′),78.13(C-11′),73.93(C-8′),72.18(C-10′),71.23(C-9′),70.02(C-4′),62.27(C-6′),44.19(C-2),43.97(C-1),18.28(C-12′)。13C NMR圖譜解析結果與柚皮苷二氫查爾酮的結構式(圖11)一致,因此加氫產物是柚皮苷二氫查爾酮。

圖10 加氫產物13C NMR結果Fig.10 NMR results of hydrogenation products

圖11 柚皮苷二氫查爾酮分子結構Fig.11 Molecular structure of naringin dihydrochalcone

2.8 甜度測定結果

根據1.2.9方法測定甜度結果如表1所示。

表1 甜度的測定結果Table 1 Determination results of sweetness

由表1可以看出,感官比較法測得的甜度結果為：Naringin DC樣品甜度為400；Naringin DC為400；NHDC為800；三氯蔗糖為400；糖精鈉為500；阿斯巴甜和安賽蜜為100。

2.9 Naringin DC與G蛋白偶聯受體3個亞基的結合

為了從分子水平闡明Naringin DC與人甜味受體T1R2和T1R3的作用模式,將Naringin DC分別對接至甜味受體T1R2和T1R3的活性口袋。結果如圖12所示。

Naringin DC與甜味受體T1R2的作用模式如圖12-a所示。Naringin DC末端的苯環與氨基酸殘基Ala-166和Ile-167形成疏水性相互作用。Naringin DC可以與氨基酸殘基Asp-142形成長為2.3 ?的氫鍵作用。所有的這些相互作用使得Naringin DC與T1R2形成穩定的復合物。

Naringin DC與甜味受體T1R3的結合模式如圖12-b所示。Naringin DC的末端苯環可以分別與氨基酸殘基His-145和His-388形成CH-π相互作用。重要的是,Naringin DC可以分別與氨基酸殘基Thr-305和Ser-306形成長為3.5和3.3 ?的雙重氫鍵作用。所有的這些相互作用使得Naringin DC與甜味受體T1R3形成穩定的復合物。

a-與T1R2活性口袋對接；b-與T1R3活性口袋對接圖12 分子對接結果Fig.12 Molecular docking results

此外,計算結果顯示,Naringin DC與人甜味受體T1R2和T1R3的結合能分別為-6.8和-7.0 kcal/mol,即Naringin DC與甜味受體親和力的順序為：T1R3>T1R2。推測Naringin DC極有可能是與人甜味受體T1R3結合,從而呈現出甜味。

總之,上述的分子對接研究對化合物Naringin DC與人甜味受體T1R2和T1R3的相互作用給予了詳細的分析,為從分子水平解釋Naringin DC的呈甜機理提供了新思路。

2.10 十種二氫查爾酮藥效團結果

由圖13～圖14及表2可以看出,該藥效團模型由3個藥效特征組成,即1個氫鍵供體(紫色)和2個氫鍵受體(綠色)。依次點擊各化合物的Name可以查看每個化合物與該藥效團的匹配情況(圖14)。匹配程度可以用1個量化的數值Fit值來衡量,Fit值越大,該化合物分子與藥效團模型的匹配程度就越高。10種二氫查爾酮的甜味大小為B>A>D>C>J>I>E>G>F>H即NHDC>Naringin DC>橙皮素二氫查爾酮-4’-β-D-葡萄糖苷>野黑櫻素二氫查爾酮>3’-O-乙酰基根皮苷>2’-O-乙酰基根皮苷>根皮苷>3-羥基根皮苷>二氫查爾酮>根皮素。

圖13 藥效團模型Fig.13 Pharmacophore model

a-B；b-A；c-D；d-C；e-J；f-I；g-E；h-G；i-F；j-H圖14 化合物B、A、D、C、J、I、E、G、F和H與藥效 團模型匹配情況Fig.14 Matching of compounds B,A,D,C,J,I,E,G,F and H with pharmacophore model

表2 Fit值Table 2 Fit value

3 結論

在超聲波180 W,超聲時間50 min,液料比為60.9∶1(mL∶g),提取溫度57.5 ℃,乙醇體積分數50.8%條件下[11],利用醇提水沉工藝純化化橘紅柚皮苷,得到純度為95.1%的化橘紅柚皮苷,不銹鋼高壓反應釜中加入該化橘紅柚皮苷,緩慢加入NaOH溶液使終pH值為13,加入10%鈀碳催化劑,在壓力為1.5 MPa,溫度為40 ℃,反應12 h后,反應達到平衡,產物過濾回收催化劑,濾液通過732型陽離子交換樹脂除去氫氧化鈉,靜置過濾烘干得到催化加氫產物。通過紅外光譜、SEM、液質聯用表征產物結構為Naringin DC,并且其產率為90.3%,液相測定其純度為97%～99%。該方法簡單有效,得到的Naringin DC純度高、口感清爽,甜度為400。

利用Discovery Studio軟件測得Naringin DC與人甜味受體T1R2和T1R3的結合能力分別為-6.8和-7.0 kcal/moL,即Naringin DC與甜味受體親和力的順序為：T1R3>T1R2。Naringin DC極有可能是與人甜味受體T1R3結合,從而呈現出甜味。計算10種二氫查爾酮的藥效團得到甜度大小為NHDC>Naringin DC>橙皮素二氫查爾酮-4’-β-D-葡萄糖苷>野黑櫻素二氫查爾酮>3’-O-乙酰基根皮苷>2’-O-乙酰基根皮苷>根皮苷>3-羥基根皮苷>二氫查爾酮>根皮素。