一株刺梨釀酒酵母的鑒定及釀酒潛力分析

于志海,岳利容,王青,伍佳勝,鐘小祥,劉曉柱,黃名正

(貴州理工學院 食品藥品制造工程學院,貴州 貴陽,550003)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)系薔薇科薔薇屬植物，廣泛分布于我國西南地區，因其全身布刺且果實呈梨狀得名。刺梨果實富含多糖[1]、黃酮、維生素C、維生素P和超氧化物歧化酶[2]等多種功能物質，具有降血糖血脂[2]、抗氧化[3]、抑制卵巢癌轉移和侵入[4]、抗細胞凋亡[5]、抗輻射[6]和防止DNA損傷[7]等功能，具有較大的開發潛力。但刺梨的適口性差(酸、澀、苦)[8]，單果重低(15 g 左右)[9]、采收期短，不宜儲藏，嚴重影響了鮮果的銷售。刺梨露酒的制作和食用在貴州民間具有悠久的歷史。利用刺梨釀造果酒具有優勢[10]。實驗室前期的調研結果顯示,刺梨果實香氣獨特持久，受發酵過程影響較小，酒體果香突出，易形成穩定而清澈的酒體[8]。

目前釀造刺梨酒所使用的均為葡萄來源的商業釀酒酵母，未見到刺梨來源的釀酒酵母，而實際上刺梨果酒的發酵急需優質釀酒酵母。如何從刺梨中分離到優質釀酒酵母成為行業內的一個突出問題。當前對刺梨中酵母的研究較少，僅局限于非釀酒酵母。如劉曉柱等[11]對刺梨自然發酵過程中非釀酒酵母生物多樣性的變化進行了研究，從刺梨中分離到了3株能對刺梨自然發酵過程香氣成分進行調節的非釀酒酵母，1株是高產β-糖苷酶的嗜殺酵母C4[8]，另2株分別為葡萄有孢漢遜酵母F13[12]和F119[13]。到目前為止尚未見到從刺梨中分離釀酒酵母的報道。本研究擬從刺梨果實中分離出與葡萄來源的商業化釀酒酵母具有同等發酵效力的釀酒酵母，并進行深入研究，以利于刺梨果酒產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貴農5號刺梨購自貴州省龍里縣；YPD、WLN培養基，貴州博奧瑞杰生物科技有限公司；對照菌株ZYMAFLORE X16 ，Laffort公司；其余試劑均為國產分析純，貴州博奧瑞杰生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UH5300紫外分光光度計，日本日立公司；雷磁 PHSJ-3F 型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；CKX41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；SA402B電子舌味覺系統，日本INSENT公司；TQ8040 NX氣相質譜聯用儀，日本島津儀器有限公司。

1.3 菌株的分離與鑒定

稱取100 g新鮮成熟的刺梨果肉和果皮的混合物,移入250 mL無菌錐形瓶中,封口后置于28 ℃下自然發酵,分別于3、4、5 d取樣,直接在YPD固體平板上劃線,28 ℃培養48 h。隨后繼續挑取每個平板上的單克隆,劃線于YPD固體平板上,直至為純的單克隆為止。

挑取單克隆,分別劃線于YPD固體平板和鑒定培養基WLN固體平板[14]上,28 ℃培養5 d后,觀察菌株的生長狀態。

利用PCR擴增ITS序列,使用ITS1-ITS4通用引物對[15],反應體系為2×Taq PCR Master Mix 25 μL,10 μmol/L ITS1引物和ITS4引物各2 μL,菌液2 μL,補水至總體積25 μL。結束后取8 μL PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳檢測后,剩余部分送上海生工測序,結果在NCBI上進行BLAST同源序列搜索比對。利用目標ITS序列,使用MEGA 7[16]構建鄰接樹,1 000次Bootstrap自檢。同時利用DNAMAN軟件比較CZ和X16的ITS序列差異。

1.4 菌株生長曲線和碳水化合物代謝情況的確定

測定生長曲線時,將10 mL YPD液體培養基裝入15 mL玻璃試管中,然后在試管中接種菌液,終濃度為106CFU/mL菌液,混勻,30 r/min,28 ℃培養,每20 h取樣一次,測定600 nm處的菌液吸光度(A600),直至80 h[17]。利用A600繪制生長曲線。

配制氮基礎液體培養基(YNB含氨基酸)[0.5%(NH3)2SO3,0.1% KH2PO3,0.01% NaCl,0.05% MgSO3,0.01% CaCl2,0.02%酵母提取物][18]測定菌株對不同碳源的利用能力,在該培養基中分別添加20 g/L的葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、核蔗糖、D-麥芽糖、D-棉籽糖、水蘇糖、甘露醇和D-山梨醇,形成不同碳源的測試培養基。接種菌液到不同碳源的測試培養基中,終濃度為106CFU/mL,28 ℃,30 r/min,培養72 h后,測定A600。

1.5 釀酒潛力分析

15 mL的玻璃試管中裝載10 mL YPD液體培養基,接種菌液到該培養基中,終濃度為106CFU/mL,28 ℃,30 r/min,培養72 h后測A600,比較不同因素對菌株生長的影響[19]。

葡萄糖耐受性分析時在上述培養基中添加葡萄糖至終質量濃度分別為100、200、400、600 g/L。酒精耐受性測試時添加無水乙醇至其終體積分數分別為5%、9%、13%、17%。酸耐受性測試時用酒石酸/NaOH調pH分別為2.0、3.5、5.0、6.5。SO2耐受性測試時用偏重亞硫酸鉀將SO2的質量濃度分別調至200、300、400、500 mg/L。

菌株產H2S的能力參照劉曉柱等[13]的方法。絮凝性測試參照楊詩妮等[20]的方法。

1.6 實驗室規模的發酵分析

2 L的三角瓶用于發酵分析,瓶口用自制的水封呼吸器封口。刺梨汁中添加50 mg/L的SO2,經果膠酶過夜酶解后,用蔗糖將糖含量調至264 g/L,用酒石酸/碳酸氫鉀調pH至3.6。在刺梨汁中接種菌液使菌液終濃度均為106CFU/mL。發酵溫度控制在16～18 ℃。酒精發酵結束后,經過約6個月的陳釀期,陳釀期內進行倒罐處理,澄清穩定后的原酒進行后續分析。

利用福林酚法[21]測定總酚含量。結果表示為g/L,多酚為相當于沒食子酸的量。利用GB 5009.225—2016規定的酒精計法和2,6-二氯靛酚滴定法分別測定酒精度、抗壞血酸含量。利用蒽酮比色法測定總碳水化合物的含量[22]。

1.7 刺梨酒的抗氧化活性分析

1.7.1 鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)法抗氧化活性測定

使用FRAP法測定抗氧化活性[23]。取0.2 mL適當稀釋的刺梨酒樣,加入3.9 mL FRAP工作液(由0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液,20 mmol/L FeCl3溶液,10 mmol/L TPTZ溶液按體積比10∶1∶1組成),混勻后37 ℃反應20 min,測定反應液在593 nm處的吸光度。使用0.2 mL不同濃度的FeSO3(0.025、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)溶液與3.9 mL FRAP工作液混合,37 ℃,20 min,制定標準曲線。以0.2 mL的0.4 mg/L的維生素C工作液替代刺梨果酒進行同樣操作。結果表示為100 mL酒樣相當于維生素C的質量。

1.7.2 DPPH法抗氧化活性測定

DPPH自由基活性清除法測定抗氧化活性[21]。取2 mL稀釋10倍的果酒樣品,與2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混勻,室溫避光反應30 min,在517 nm波長處測定吸光度Ai。同時以無水乙醇分別替代刺梨酒樣和DPPH,進行同樣操作,在517 nm處分別測得Ac和Aj。DPPH自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100,酒樣的DPPH自由基清除率按著等量關系換算成維生素C當量,即100 mL刺梨酒樣相當于維生素C的質量。

1.8 感官及風味分析

利用電子舌對刺梨酒進行滋味分析。采樣時間120 s,采樣速度為1 次/s,每個樣品平行測定3次,每個平行重復采集4次[13]。利用頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)和GC-MS分析刺梨果酒的香氣成分,參照劉曉柱等[13]的方法。

1.9 數據統計分析

以上所有試驗均重復3次,以葡萄酒來源的商業酵母X16作對照菌株[24]。所有數據表示為平均數±標準差。利用SPSS 23.0進行數據分析,使用單因素ANOVA(Games-Howell’s 比較檢驗)比較各平均值的差異,同時利用t-test比較兩組平均數的差異,Prism 8.0用于繪圖。所有圖中的小寫字母表示平均值間在P<0.05水平上的差異。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母的的篩選與鑒定

WLN培養基鑒定結果表明,共從刺梨自然發酵液中分離到14株形態各異的本地酵母。其中1株的形態與X16菌株的形態一致,呈球狀突起,表面光滑,并且菌落的中間呈綠色,周邊白色,在YPD固體培養基上二者也有類似特征(圖1-a),顯微鏡下具有典型的酵母細胞形態(圖1-b)。

PCR鑒定結果表明,目標菌株的ITS序列(Accession No.MW453157)與NCBI中的釀酒酵母菌株3879j(Accession No.KP204935.1)的序列相似性高達99.63%,聚類分析結果顯示目標菌株和X16均位于釀酒酵母一支(圖2-b),因此將該酵母菌株鑒定為釀酒酵母,命名為S.cerevisiaeCZ,簡稱“CZ”。CZ的ITS序列的比對分析排除了相互污染的可能(圖2-a)。

a-表觀形態特征；b-顯微形態特征圖1 菌落在不同培養基上的形態特征和經美藍染色后 (×1 000)的特征Fig.1 Morphological characteristics of colonies grown on different media and cell with 1 000×amplification under microscope of CZ and X16 after methylene blue staining

a-序列比對；b-進化聚類分析圖2 CZ和X16的ITS序列比對和進化聚類分析Fig.2 The alignment of sequenced ITS between CZ and X16 and evolutionary analysis

2.2 碳源利用情況及其在YPD培養基中的生長曲線分析

碳源分析結果表明CZ和X16對同一種碳源的利用情況沒有顯著差異,二者偏好利用葡萄糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖(圖3)。在YPD液體培養基中觀察了CZ和X16的生長曲線,結果顯示前20 h后,菌體迅速增加,到40 h時增長速度明顯下降,在60～80 h達到平臺期,兩個菌株的表現幾乎一致(圖3-a)。

a-生長曲線；b-單糖；c-多糖；d-糖衍生物圖3 菌株在YPD培養基中的生長曲線和菌株對單糖、多糖以及糖衍生物的利用情況測試Fig.3 The growth curve in YPD broth and carbon metabolism tests for monosaccharides,oligosaccharides, and carbohydrate derivatives

2.3 釀酒潛力分析

在含100 g/L葡萄糖的YPD培養基中,X16的生長顯著優于CZ。但在其他濃度葡萄糖的培養基中,二者的生長狀態卻無顯著差異。另外,從含400 g/L葡萄糖的YPD培養基開始,隨著葡萄糖濃度的增加,對菌株生長的抑制程度也隨著增加(圖4-a)。

CZ在含不同乙醇體積分數的YPD培養基中的生長情況與X16一致,各濃度之間存在著顯著差異,在13%或更高乙醇體積分數的培養基中,二者的生長受到顯著抑制(圖4-b)。

兩個菌株的生長在pH為2的YPD液體培養基中受到顯著抑制,而在pH為3.5和5中沒有差異,在pH為6.5中,CZ的生長狀況優于X16(圖4-c)。CZ和X16在含0～500 mg/L SO2的YPD培養基中,隨著SO2濃度的升高,除了CZ 在200 mg/L中與空白對照(0 mg/L)沒有顯著差異外,其余濃度下二者的生長狀況均受到顯著抑制(圖4-d)。二者產H2S能力較弱(圖4-e)。CZ和X16均具有高絮凝性,分別為(11.5±4.4)%和(9.6±1.3)%,且二者之間不存在顯著差異。

a～d-耐受性分析；e-H2S產生分析圖4 菌株的釀酒潛力分析Fig.4 Brewing potential analysis of strains,CZ and X16

2.4 實驗室規模的釀造分析

利用CZ和X16分別釀造的成品酒樣,所測試的指標均不存在顯著差異。X16的酒精度(12.85%vol)略高于CZ(12.75%vol)、CZ的pH(3.71)略高于X16(3.66)、CZ的總碳水化合物含量(71.7 g/L)略高于X16(66.9 g/L)、CZ的總酚含量(12.13 g/L)略高于X16(11.53 g/L)、X16的抗壞血酸含量(9.06 g/L)略高于CZ(8.38 g/L)(表1)。

表1 刺梨果酒的理化分析Table 1 Physical and chemical analysis of R.roxbunghii wine

2.5 刺梨酒的抗氧化活性分析

抗氧化活性分析結果如表2所示。總體上,X16釀造的刺梨果酒的抗氧化活性效果均略高于CZ,但二者沒有統計學差異。刺梨酒對Fe3+的還原能力的結果顯示,100 mL CZ釀造的刺梨酒相當于0.66 μg的維生素C,X16相當于0.69 μg。DPPH自由基清除率結果顯示,兩種酵母釀造的刺梨果酒,100 mL均相當于約20 mg維生素C的清除效果。

表2 刺梨酒的抗氧化活性分析Table 2 Antioxidant activity analysis of R.roxbunghii wine

2.6 刺梨果酒的感官及風味分析

電子舌分析結果表明CZ純種發酵的刺梨果酒與X16,在咸味、酸味、苦味、澀味、鮮味、豐富度、后味A、后味B響應值上均無顯著差異(圖5-a)。采用HS-SPME-GC-MS分析,CZ刺梨果酒中共檢出63種,包括酯類31種、醇類13種、酸類6種、醛酮類3種、其他10種；X16刺梨果酒中共檢測到64種,包括酯類32種、醇類12種、酸類8種、醛酮類3種、其他9種(圖5-b)。

a-電子舌；b-HS-SPME-GC-MS分析結果圖5 刺梨酒的風味分析Fig.5 The flavor analysis for R.roxbunghii wine

3 討論與結論

本項目從刺梨果汁中獲得的CZ釀酒酵母在碳源利用的偏好性、耐酒精、耐酸、耐糖、耐SO2方面具有與商業酵母X16相似的能力,同時在亞硫酸鉍固體培養基上培養5 d后所產的H2S比較少,絮凝性優于X16,這些結果均說明CZ具備釀造果酒的潛力。

該菌株完全具備將刺梨果汁變成果酒的能力,無論是在顏色、澄清度、酒精度、風味還是在總酚和抗壞血酸的保留方面均與X16無明顯差異。該菌株具有一定的環境耐受性,可進行小規模的刺梨果酒發酵,有一定的應用潛能。但是在中試甚至是工業化生產中的表現特性如何,需要進一步的研究評價。