耐鹽乳酸菌的篩選及其誘變育種與耐受性研究

賀曉潔,趙良忠*,李明,3,周曉潔,車麗娜,劉婷, 江振桂,劉汁琪,林碧蓮,龔周亮

1(邵陽學院 食品與化學工程學院,湖南 邵陽,422000)2(豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室,湖南 邵陽,422000) 3(廣州佳明食品科技有限公司,廣東 廣州,510000) 4(湖南肯基因科技有限公司,湖南 長沙,410000)

貴州紅酸湯是以鮮辣椒、鮮西紅柿為主要原料,通過發酵法生產的半固態傳統發酵食品,具有色澤紅亮,香味濃郁,酸味醇厚的特點[1]。根據原料種類不同,貴州紅酸湯分為辣椒紅酸湯[2]、西紅柿紅酸湯[3]、辣椒與西紅柿混合紅酸湯[4]。辣椒作為紅酸湯主要原料,季節性明顯,為延長辣椒保質期并降低生產成本,工廠通常會對新鮮紅辣椒進行高鹽鹽漬保藏,發酵時再將辣椒進行脫鹽處理,脫鹽時辣椒營養、風味等物質流失嚴重并帶來水污染問題[5]。篩選耐鹽乳酸菌,在高鹽條件下直接生產紅酸湯有利于簡化生產工序、有效減少環境污染,保持產品色澤和營養。

乳酸菌屬是紅酸湯發酵的優勢菌屬,約占微生物菌群78.05%～90.26%,也是酸湯風味形成的核心微生物菌屬[6]。研究表明,食鹽可促進酸湯風味形成,延長保質期,但食鹽濃度過高會抑制乳酸菌生長代謝,導致酸湯有機酸含量低、風味不足[7]。因此,篩選耐高鹽脅迫且產酸能力強的菌株更適于酸湯工業化生產。誘變育種可改良菌株遺傳特性,紫外誘變具有經濟、穩定性好的特點,廣泛應用于食品工業誘變育種[8]。

乳酸菌具有良好的益生功能,如降膽固醇[9]、增強免疫力[10]、抗氧化[11]等,但需其耐受人體消化才能充分發揮益生功能。本研究從傳統發酵辣椒中篩選一株耐鹽乳酸菌,并通過二輪紫外誘變進一步提高乳酸菌耐鹽產酸能力,同時比較原始菌株和突變菌株的耐受性,包括耐酸、耐膽鹽、耐人工模擬胃腸液、耐鹽能力,以期為高鹽紅酸湯生產提供發酵菌株,從而簡化辣椒脫鹽工序,提高生產效率,降低生產成本,緩解工業化生產過程中紅酸湯主要原料辣椒脫鹽處理時所帶來的營養成分流失和水污染問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統發酵辣椒制品,湖南邵陽農家,要求總酸>10 g/kg,NaCl添加量(以質量分數計)>6%。

MRS肉湯,杭州百思生物技術有限公司；乳酸菌成套生化鑒定管,青島高科園海博生物技術有限公司；人工模擬胃液、人工模擬腸液,廣州臻萃質檢技術服務公司；其他試劑無特別說明來自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

EL340多功能酶標儀,美國Bio-Tek公司；SW-CJ-2FD(標準)雙人單面凈化工作臺,蘇州智凈凈化設備有限公司；IS-RDD3恒溫振蕩器,上海珂淮儀器有限公司；TG16K-II臺式高速離心機,長沙艾迪生物科技有限公司；HWS智能型恒溫培養箱,寧波江南儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 耐鹽乳酸菌篩選

1.3.1.1 初篩

參考熊蝶等[12]的方法稱取樣品,選擇合適梯度稀釋。每個稀釋度吸取100 μL樣液涂布于含1%(質量分數) CaCO3的MRS固體培養基,36 ℃,48 h培養。挑取含溶鈣圈的疑似菌落,平板劃線分離純化得到單菌落,進行革蘭氏染色與接觸酶實驗。挑選G+、接觸酶陰性的單菌落并編號,于MRS液體培養基活化,接種量2%(接種量以體積分數計,下同)于質量濃度為0、40、70、100、130、160、200 g/L NaCl的MRS液體培養基,36 ℃,24 h培養,酶標儀測定OD600,挑選最高鹽濃度下的D70菌株,接種2%于40、50、60、70、80、90、100 g/L的MRS液體培養基,選擇D70最高的5株菌進行復篩。D70按公式(1)計算：

(1)

式中：D70,OD600值比值大于70%,%；Ax,不同NaCl質量濃度下的菌株OD600值；A0,不含NaCl下的菌株OD600值。

1.3.1.2 復篩

將復篩菌株活化,接種2%于70 g/L NaCl的MRS液體培養基中,37 ℃培養,每2 h取樣,測定OD600、總酸含量,選擇菌株活力、產酸能力最強的菌株進行后續實驗。

1.3.2 總酸測定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定方法》中酸堿滴定法,以乳酸計。

1.3.3 耐鹽乳酸菌鑒定

生理生化鑒定：乳酸菌成套生化鑒定管；16S rDNA測序：活化的菌液于湖南擎科生物科技有限公司進行16S rDNA測序,MEGA 7.0繪制系統進化樹,最終確定菌株種屬。

1.3.4 紫外誘變及傳代穩定性

1.3.4.1 紫外誘變時間的選擇

活化菌株,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,無菌生理鹽水洗滌2次,稀釋菌液至107CFU/mL,取2 mL菌液于9 cm培養皿中,無菌條件下打開皿蓋,紫外(30 W,30 cm)分別照射0、5、10、15、20、25、30 s。紫外誘變后的菌液適當稀釋后取200 μL涂布于含1% CaCO3的MRS平板,37 ℃培養48 h,平板計數,按公式(2)計算致死率,為避免光修復稀釋涂布培養等操作應避光或在黃光、紅光下進行[13]。

(2)

式中：R,致死率,%；C0：誘變前活菌濃度,CFU/mL；C1：誘變后活菌濃度,CFU/mL。

1.3.4.2 紫外誘變及突變菌株穩定性測定

將紫外誘變后的菌液適當稀釋,取200 μL涂布于1% CaCO3的MRS培養基,37 ℃培養48 h。挑取溶鈣圈較大,菌體稠厚的菌落接種于含80 g/L NaCl的MRS液體培養基中培養,測定OD600值、總酸。以原始菌株為對照,對耐鹽、產酸量最高的乳酸菌進行二次紫外誘變并篩選出耐鹽高產酸菌株,將該菌株連續培養10代,檢測每代耐鹽產酸性,并觀察其發酵穩定性。

1.3.5 耐鹽乳酸菌的耐受性

1.3.5.1 耐酸能力的測定

活化菌株,接種5%至 pH 值為2.0、3.0、4.0 的MRS培養基中,37 ℃培養3 h,活菌計數,計算存活率,即接種培養3 h前后活菌數的比值。

1.3.5.2 耐膽鹽能力的測定

活化菌株,接種5%于質量濃度為 1、2、3、4 g/L豬膽鹽的MRS培養基中,37 ℃培養3 h,活菌計數。

1.3.5.3 耐人工模擬胃腸液能力的測定

參照張林奇等[14]的方法修改,活化菌株,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,無菌生理鹽水洗滌2次,吸取1 mL菌液接種于9 mL人工模擬胃液,37 ℃培養2 h,活菌計數,再取經人工模擬胃液處理后的菌液1 mL接種至9 mL人工模擬腸液,37 ℃培養8 h,每2 h活菌計數。

1.3.5.4 耐鹽能力的測定

活化菌株,接種5%于70、80、90、100 g/L NaCl的MRS培養基中,37 ℃培養3 h,取樣活菌計數。

1.3.6 數據處理

所有試驗重復3次,數據用“數值±標準差”表示。采用SPSS 22進行統計學分析,Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 耐鹽乳酸菌篩選

對耐鹽產酸菌株進行初篩,挑選含溶鈣圈的菌落劃線純化,共68株菌,均為革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶實驗陰性菌。將68株菌分別于0～200 g/L不同NaCl質量濃度下培養,NaCl質量濃度最高為70 g/L時滿足D70的菌株有14株,將14株菌分別于40～100 g/L不同NaCl質量濃度下培養,選擇D70含量最高的5株菌進行復篩,菌株編號分別為L-8、L-14、L-22、L-29、L-31。

對初篩得到的5株菌進行復篩,并繪制不同菌株在70 g/L NaCl濃度下的OD600及產酸曲線。如圖1所示,篩選的菌株均具有良好的耐鹽產酸特性。其中L-14菌株與其他菌株相比,在0～10 h時菌株活力與產酸能力略為滯后,在12 h時與其他菌株基本持平,12 h后OD600與產酸能力顯著高于其他菌株(P<0.05),并于26 h進入穩定期,OD600最高達(1.736±0.05),總酸含量達(13.838±0.11) g/kg。這是因為在發酵初期,菌株處于適應階段,生長代謝緩慢,進入對數生長期后,迅速繁殖代謝產酸。不同菌株的生長代謝能力不同,其中菌株L-14在70 g/L NaCl下產酸能力最強,因此選擇L-14菌株進行下一步實驗。

a-生長曲線;b-產酸曲線圖1 不同菌株在70 g/L NaCl濃度下的生長產酸曲線Fig.1 Growth and acid production curves of different strains under 70 g/L NaCl

2.2 耐鹽乳酸菌的鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

菌株生理生化結果如表1,參考《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[15],初步確定菌株L-14為植物乳桿菌屬。

表1 菌株生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain L-14

2.2.2 16S rDNA測序

純化后的菌液送至湖南擎科生物科技測序,測序結果與NCBI中的GenBank數據庫進行BLAST比對,MEGA8軟件中的鄰接法(neighbour-joining,NJ) 構建系統發育樹,如圖2所示。菌株L-14與植物乳桿菌L.plantarum6641(登錄號：MT_463 849.1)相似度100%,結合生理生化鑒定和16S rDNA測序結果,進一步確定菌株L-14為植物乳桿菌。

圖2 菌株L-14的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain L-14

2.3 耐鹽乳酸菌紫外誘變及遺傳穩定性

2.3.1 誘變時間的選擇

菌株在30 W、30 cm條件下紫外誘變,結果如圖3所示,紫外照射20 s時出現90%以上的致死率。由于紫外誘變后DNA產生嘧啶二聚體,導致基因突變,根據70%～80% 致死率可提高菌株正向突變率的觀點[13],紫外照射15 s時,菌株L-14致死率為79.05%,因此選擇15 s為紫外誘變最佳時間。

圖3 誘變時間對菌株L-14的致死率的影響Fig.3 Effect of mutagenesis time on the lethality of strain L-14

2.3.2 耐鹽乳酸菌的誘變育種

對L-14菌懸液紫外照射15 s,結果如表2所示,正向突變菌株(OD600>0.347)共計23株,在80 g/L NaCl下其產酸量均高于原始菌株,其中L14U1-16菌株產酸量最高,達8.833 g/kg,較原始菌株產酸量(7.770 g/kg)提高13.68%,故選擇L14U1-16進行二輪紫外誘變。

表2 一輪紫外誘變下的突變菌株產酸情況Table 2 Acid production of mutant strains under one round of UV mutation

由表3可知,二輪紫外誘變的正向突變菌株(OD600>0.347)共計24株,在80 g/L NaCl下其產酸量均高于原始菌株,其中L14U2-3菌株產酸量最高,達8.989 g/kg,較原始菌株產酸量(7.770 g/kg)提高15.69%,較L14U1-16提高1.77%。

表3 二輪紫外誘變下的突變菌株產酸情況Table 3 Acid production of mutant strains under two rounds of UV mutation

續表3

2.3.3 誘變菌株的遺傳穩定性

分別將L14U2-3和L14U1-16置于80 g/L NaCl條件下傳代培養10次,測定產酸穩定性。由表4可知,L14U2-3穩定性最好,傳代過程中產酸無顯著性差異,且L14U1-16呈現出顯著性差異(P<0.05),遺傳性狀不夠穩定,故選擇菌株L14U2-3進行后續實驗。

表4 突變菌株產酸穩定性 單位：g/L

2.4 耐鹽乳酸菌耐受性測定

乳酸菌的益生功能可分為腸道功能、免疫功能、代謝功能[16]。乳酸菌在人體充分發揮益生功能的前提是其能否耐受人體胃腸環境。

2.4.1 耐酸能力測定

乳酸菌在低pH環境(pH 2～3.5)中生存是適應人體胃液環境的必要條件之一[17],由圖4可知,2株菌均具有良好的耐酸能力,隨著pH增加,存活率均顯著增加(P<0.05),在相同pH條件下,突變菌株L14U2-3存活率均高于原始菌株L-14。其中在pH 2.0時培養3 h后L-14、14U2-3存活率均高于80%,分別為(81.75±2.34)%、(85.09±1.99)%,L14U2-3較L-14存活率提高4.09%,這與蒙月月等[18]的研究相似。2株菌株存活率均隨pH增大而增大,這是由于pH 較低時破壞了菌株胞內pH的動態平衡,使胞內pH隨環境pH下降,從而改變細胞膜通透性,影響其對外界營養物質的吸收利用,使其生長受到抑制或延滯期延長,甚至死亡[19]。

圖4 乳酸菌耐酸能力的測定Fig.4 Acid tolerance of lactic acid bacteria 注:不同字母表示同一菌株組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4.2 耐膽鹽能力測定

將菌株L-14、L14U2-3分別置于含膽鹽培養基中培養,模擬人體小腸膽鹽濃度(0.3～3 g/L)波動[20]。由圖5可知,菌株活菌數均隨膽鹽濃度升高而顯著降低(P<0.05),當膽鹽質量濃度為3 g/L時,活菌數均高于106CFU/mL,分別為(6.33±0.02)和(6.01±0.33)lg CFU/mL,突變菌株L14U2-3較原始菌株L-14活菌數提高5.32%,由陳儀婷等[21]篩選的植物乳桿菌YXB12在3 g/L膽鹽下活菌數為0,相比之下兩株菌株對膽鹽具有更好的耐受性。可能原因是植物乳桿菌自身具有幾種耐受膽鹽的系統和機制,在膽鹽脅迫下,分子伴侶蛋白dnaK、groES等7種應激基因轉錄水平上調,從而提高其膽鹽耐受能力[22]。

圖5 乳酸菌耐膽鹽能力的測定Fig.5 Bile salt tolerance of lactic acid bacteria

2.4.3 耐人工模擬胃腸液能力測定

將菌株L-14、L14U2-3分別置于人工模擬胃液處理2 h,再經腸液處理8 h,結果如圖6所示,經人工模擬胃液處理2 h,活菌數無較大變化,均高于108CFU/mL,再經腸液處理后2 h后,活菌數顯著下降(P<0.05),但在2～8 h間活菌數均維持在106CFU/mL以上,可能原因是胃腸液中的胃蛋白酶和胰蛋白酶會抑制菌株初始被膜的形成,同時破壞成熟的被膜,從而抑制菌株生長甚至造成死亡[23]。總體而言,L-14、L14U2-3具有較強的胃腸液耐受性,這與HAN等[24]的研究結果相類似。

a-耐人工模擬胃液；b-耐人工模擬腸液圖6 乳酸菌耐人工模擬胃腸液能力的測定Fig.6 Tolerance of lactic acid bacteria to artificial simulated gastrointestinal fluid

2.4.4 耐鹽能力測定

由圖7可知,原始菌株L-14培養24 h后活菌數隨NaCl質量濃度增大而顯著減少(P<0.05),突變菌株L14U2-3 在NaCl質量濃度>80 g/L時,活菌數顯著降低(P<0.05)。NaCl質量濃度相同時,L14U2-3活菌數均高于L-14,在80 g/L NaCl質量濃度下活菌數分別為(8.89±0.003)和(8.20±0.118)lg CFU/mL,耐鹽能力提高8.41%,可能是植物乳桿菌的相容性溶質調控系統有助于應對環境中的鹽脅迫[25],從而提高其耐受性。

圖7 乳酸菌耐鹽能力的測定Fig.7 Salt tolerance of lactic acid bacteria

3 結論與討論

程強等[26]研究發現植物乳桿菌M616在80 g/L NaCl下基本不生長,李靜等[27]從泡菜中篩選的植物乳桿菌LP-09在80 g/L NaCl下產酸量為3 g/L。本文從傳統辣椒發酵食品中篩選出一株耐鹽產酸菌株L-14,經鑒定菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。對其進行二輪紫外誘變得到突變菌株L14U2-3,其在80 g/L NaCl下較原始菌株L-14耐鹽能力提高8.41%,產酸量提高15.69%,達到8.989 g/L。同時研究發現突變菌株L14U2-3耐酸、耐膽鹽、耐鹽(NaCl)能力均優于原始菌株L-14,可用于紅酸湯高鹽發酵,簡化辣椒脫鹽工序,提高生產效率,降低生產成本,緩解工業化生產過程中紅酸湯主要原料辣椒脫鹽處理時所帶來的營養成分流失和水污染問題,助力酸湯產業發展。