基于穩定同位素比值的不同產地枸杞特征分析及判別

連思雨,朱姍姍,張紫娟,謝瑜杰,范春林,陳輝*,王明林*

1(山東農業大學 食品科學與工程學院,山東 泰安,271018) 2(中國檢驗檢疫科學研究院,北京,100176)

枸杞顏色鮮艷、口感較好,富含胡蘿卜素、維生素及氨基酸等成分,因其較高的營養價值和藥理作用作為高值產品深受大眾喜愛[1-2]。研究表明,不同產地枸杞受氣候、光照等因素影響品質存在較大差異[3],其市場價格差異在數倍到十倍之間。建立切實可行的枸杞產地判別方法,不僅能改善枸杞市場現狀,增強消費者購買信心,而且有利于枸杞生產者進行品牌建設,提高經濟利益,同時也維護了消費者的權益[4],對保護枸杞產業合理有序發展發揮一定的作用。

近年來,國內外利用穩定同位素溯源的相關研究明顯增加[5]。RASHMI等[6]和OCVIRK等[7]分別研究了意大利小麥中δ13C、δ15N值和啤酒花中δ13C、δ15N、δ34S值,肯定了穩定同位素與地理環境的關系；PIANEZZE等[8]測定了意大利紅皮蒜樣品中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S 5種穩定同位素比值分析意大利樣品,使用SIMCA分析軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和判別(discriminant analysis,DA)分析,結合線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)和K近鄰算法(K nearest neighbor,K-NN)等方法建立模型；KANG等[9]測定海參中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O 4種同位素比值實現產地判別。同時,穩定同位素技術在國內也取得一定成果,張建輝等[10]測定湖南3個產地茶葉樣品中5種重金屬元素同位素比值,結合SAS進行聚類分析和判別分析,判別分析結果為86.96%；佘僧等[11]綜述了近年來穩定同位素分析技術結合PCA、LDA和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)等化學計量學方法在蜂蜜的產地識別及品種判別方面應用的研究進展。由此可見,穩定同位素技術進行高值產品的產地溯源方面應用已經較為成熟,此外,其在中藥[12-13]、乳肉制品[14-15]以及谷物果蔬[16-18]等各類產品的產地判別方面也得到了廣泛應用。穩定同位素以其方便、可靠、準確、高效的特點在農產品產地判別方面表現出非常樂觀的應用前景。

近幾年,應用色譜、色譜-質譜和紅外光譜測定有機物和礦物元素對不同產地枸杞進行差異化研究的報道相對較多[19],但是利用穩定同位素進行枸杞溯源的研究并不多見。孟靖[20]測定了青海、寧夏和甘肅枸杞中檸檬烯、四甲基吡嗪等具有代表性的揮發性化合物的碳穩定同位素值;BERTOLDI等[21]測定意大利和亞洲共21份枸杞樣品中5種輕穩定同位素比值以及57種礦物元素含量和14種類胡蘿卜素,這些研究仍存在前處理技術要求較高、判別準確率較低以及枸杞樣本量較少等局限。張森燊[22]測定枸杞以及土壤中的20種礦物元素以及同位素進行產地判別,判別模型傾向于對中寧枸杞與周邊地區枸杞的區分,對青海產區尚未提及。因此,建立準確可靠的模型對枸杞主要產地進行判別是很有必要的。

本文應用穩定同位素測定了采自青海、寧夏和新疆3個地區共97份地理信息可靠的枸杞樣品的5種穩定同位素比值,應用LDA和支持向量機(support vector machine,SVM)分別建立了不同產地枸杞判別模型。本文對測定的枸杞穩定同位素比值進行分析,不僅為枸杞產地鑒別提供了基礎數據,而且應用有效的化學計量法建立青海、寧夏和新疆3個主產區的判別模型,為枸杞產地判別提供了有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集地理信息來源可靠的枸杞樣品97份,其中青海38份、寧夏33份、新疆26份。穩定同位素標準物質IAEA-CH-7(δ2H=-100.3‰VSMOW)、IAEA-601(δ18O=23.3‰)、USGS43(δ34S=+10.46‰,δ15N=+8.44‰)均為美國地質勘探局Reston穩定同位素實驗室研制；穩定同位素標準物質炭黑GBW04407(δ13C=-22.43‰VPDB)由石油勘探開發科學研究院研制。

1.2 儀器與設備

烘箱,上海精宏實驗設備有限公司；多功能料理機,九陽股份有限公司；超微量天平,梅特勒-托列多儀器上海有限公司；Flash 2000元素分析儀、Delta V Advantage穩定同位素比值質譜儀,美國賽默飛世爾公司；vario PYRO cube元素分析儀,德國 Elementar 公司；isoprime 100同位素質譜儀,英國 isoprime 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

取適量干果枸杞樣品置于65 ℃烘箱中加熱12～24 h[13],烘干后待枸杞冷卻用料理機粉碎至粉末狀態,裝入100 mL樣品瓶備用。

1.3.2 測定方法

碳、氮、硫同位素比值的測定：取3～5 mg粉末狀枸杞樣品于錫杯(5 mm×8 mm)中壓實包好后直接放入元素分析儀(vario PYRO,elementar)自動進樣器中,在高溫下燃燒、還原,最終生成CO2、N2和SO2,經過吸附與解析的過程,按照N2、CO2、SO2的順序先后進入同位素比率質譜儀(isoprime,elementar)進行檢測。以標準物質炭黑、USGS43進行單點校正,每隔12個樣品插入1個標物。儀器長期標準偏差為0.2‰。

儀器檢測條件：氧化管溫度為1 150 ℃,還原管溫度為850 ℃,通氧時間為70 s,元素分析儀氦氣吹掃流量為230 mL/min,進入質譜儀氦載氣流量為100 mL/min,高純N2、CO2、SO2(純度>99.999%)為參考氣。

氫、氧同位素比值的測定：取約4 mg粉末枸杞樣品,用銀杯(3.2 mm×4 mm)包好壓實后放入元素分析儀(FALSA 2000,Thermo Fisher)自動進樣器中,在高溫下裂解成H2和CO進入同位素比率質譜儀(Delta V Advantage)進行檢測。以標準物質IAEA-CH-7、IAEA-601進行單點校正,每隔6個樣品插入1個標物。儀器長期標準偏差為6‰。

儀器檢測條件：左爐燃燒管溫度為1 450 ℃,色譜柱溫度90 ℃,氦氣流速100 mL/min,高純H2和O2為參考氣。

穩定同位素比值的計算如公式(1)所示：

δ‰=(R樣品-R標準)/R標準×1 000

(1)

式中：R樣品,測試樣品中重同位素與輕同位素豐度比值,即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H、34S/32S；R標準,國際標準樣的重同位素與輕同位素豐度比值。

2 結果與分析

2.1 δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S在不同地區枸杞中的分布

由于植物生長的氣候、大氣成分、海拔、土壤、地形、水源及代謝類型等因素會導致同位素在植物體內發生自然分餾效應,植物體內的同位素比值信息相應地反映植物所處的生長環境信息,基于此,穩定同位素技術在產地溯源方面得到了廣泛應用。

將本文測定的不同產地枸杞樣本中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S導入Origin軟件分析,所得箱線圖反映了不同產地間穩定同位素比值差異趨勢,見圖1。不同產地枸杞中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值均存在顯著差異。

碳同位素比值青海地區最高,平均值為-25.43‰；其次是新疆,δ13C平均值為-26.14‰,范圍為-27.46‰～-25.12‰；寧夏地區最低,38份寧夏枸杞樣品碳同位素比值為-27.06‰,3個產地δ13C值為-27.71‰～-24.06‰；由圖1可知,青海采樣點枸杞樣品δ15N值相對高于其他地區,為1.37‰～9.058‰,平均值為5.08‰,其次是寧夏和新疆,δ15N值分別為0.21‰～4.70‰、-2.64‰～3.92‰,平均值分別為2.68‰和0.62‰；不同地區枸杞中氫穩定同位素比值從高到低依次是新疆、寧夏、青海,平均值分別為-77.91‰、-92.41‰、-101.89‰；氧穩定同位素比值青海最高,平均值為33.68‰,其次是新疆和寧夏,平均值分別為31.44‰、30.72‰,相比氫穩定同位素差異范圍較小；硫穩定同位素比值箱線圖顯示,青海、新疆、寧夏δ34S平均值分別8.10‰、7.45‰、6.84‰,由差異性分析可知,青海和寧夏枸杞δ34S值存在顯著差異,新疆枸杞與青海、寧夏枸杞δ34S值無明顯差異。

a-C；b-N；c-H；d-O；e-S圖1 三個產地C、N、H、O、S穩定同位素比值箱線圖Fig.1 Box-plot of stable carbon,nitrogen,hydrogen,oxygen and sulfur isotope ratios in three common wolfberry producing areas 注：不同小寫字母表差異顯著(P<0.05)

2.2 主成分分析

選取3個地區具有代表性的樣品將數據以指數進行歸一化處理,導入MPP進行主成分分析,根據第1主成分和第2主成分的得分分布圖(圖2)可以看出,青海和寧夏枸杞樣品的距離相對較遠,寧夏枸杞樣品基本位于第1主成分的正半軸,青海的枸杞樣品基本位于第2主成分的負半軸,因此,第1主成分可以基本將青海和寧夏地區的樣品分開。新疆枸杞在第1主成分的正半軸和負半軸均有分布,但基本位于第2主成分的負半軸,前2個主成分可以解釋75.29%的變量。

因子載荷值的絕對值越大,代表該同位素在主成分中的方差貢獻率越大。結合該模型載荷分布圖來看,第1主成分中δ13C值、δ18O值的載荷值在區別枸杞產地時方差貢獻率較大,分別為60.0%和63.3%；在第2主成分中δ15N方差貢獻率最大為74.1%,其次是δ2H。由圖1可知,不同產地枸杞δ13C、δ18O、δ15N、δ2H值變化在同位素箱線圖中差異趨勢均較為明顯,但不同產地枸杞中δ34S值與其他穩定同位素相比差異性相對較弱,這與主成分分析結果一致,δ13C、δ18O、δ15N、δ2H對枸杞產地判別均發揮了不同程度的作用。

■-寧夏；▲-青海；●-新疆圖2 不同地區枸杞PCA得分分布圖Fig.2 PCA score distribution of wolfberry in different regions

結合2.1分析結果,不同產地枸杞中的穩定同位素比值與各地區采樣地點的地理位置以及海拔高度、降水等因素有密切的聯系,采樣點間環境條件的差異影響了不同產地枸杞同位素比值的差異性。

2.3 判別模型建立

在產地溯源研究中,分散的采樣點及龐大的數據量需依靠化學計量學方法進行數據處理,這對結果可視化起到不可或缺的作用,無監督(PCA等)及有監督的識別方法(LDA、SVM等)均被廣泛應用。

LDA是一種有監督判別方法,以投影后類內方差最小,類間方差最大的原則對樣品數據進行降維,實現樣品的分類。PIANEZZE等[8]應用LDA建立蒜的判別模型；與LDA類似,SVM是通過已知樣品集的特點,建立分析模型應用于對未知樣品集的判別,在農產品產地判別及溯源等研究領域也有著廣泛的應用,判別效果較好。因此,本文選用LDA和SVM 2種算法對幾個地區枸杞進行建模。

2.3.1 基于LDA的枸杞產地判別模型

應用LDA算法進行模型驗證時,寧夏枸杞和青海枸杞各有1個樣品被誤判為新疆枸杞,判別率分別為97.4%和97.0%,LDA模型在判別新疆樣品時,18個新疆樣品可以被準確判別,模型驗證對3個產地枸杞的整體判別率為89.7%；交叉訓練時所有青海枸杞樣品均能被準確識別,新疆僅有5個樣品分別被誤判為青海枸杞和寧夏枸杞,交叉訓練模型整體的準確率為93.8%。將不同產地的枸杞樣品的前2個判別函數作模型圖(圖3),可以直觀地看出不同產地來源的枸杞有其各自的空間分布特征,其中寧夏枸杞和青海枸杞分布相對較遠,新疆枸杞和寧夏、青海的枸杞均有不同程度的重合,導致新疆枸杞判別準確率較低,這可能與枸杞樣本量有關,未來實驗將考慮增加實驗樣本,提升枸杞判別的準確率。

■-寧夏；▲-青海；●-新疆圖3 三個產地枸杞樣品前2個判別函數得分圖Fig.3 Scatter plots of wolfberry samples from three producing areas on the first two discriminant functions

2.3.2 基于SVM的枸杞產地判別模型

使用SVM算法在進行模型初始驗證時,寧夏枸杞有1個樣品被誤判為新疆枸杞,模型判別率為97.4%,青海枸杞均被準確識別,判別準確率為100%,新疆枸杞有1個樣品被誤判別為青海枸杞,2個樣品被誤判為寧夏枸杞,判別率相對較低為88.5%。在模型訓練的結果中,青海枸杞和寧夏枸杞均能被準確識別,新疆枸杞有3個樣品被誤判,與模型初始驗證的結果一致。但模型初始驗證和模型訓練時準確率分別為95.9%和96.9%,可以實現大部分枸杞的產地甄別。由表1可知,SVM算法建立的判別模型在初始驗證和模型訓練的準確性相對較高,判別效果明顯優于LDA模型。基于穩定同位素含量結合化學計量法建立青海、寧夏和新疆枸杞的判別模型是可行的。

表1 LDA和SVM模型預測準確率Table 1 The accuracy of LDA and SVM models

3 結論與討論

枸杞作為藥材及養生佳品持續出現在大眾視野,產地來源對其價格產生了較大影響,建立切實可行的產地判別方法尤為重要。植物中的同位素比值受氣候、環境等條件的影響表現出不同的產地特征。青海、寧夏和新疆是目前枸杞的主要原產地,本文通過簡便快捷的前處理過程測定枸杞中穩定同位素比值,結合化學計量法建立產地判別模型實現了這3個產地枸杞的快速判別,具有明顯的優勢和可行性。

枸杞是典型的C3植物,δ13C值通常為-35‰～-20‰[23],本文測定其δ13C值為-27.71‰～-24.06‰,與文獻中報道的結果一致,不同產地枸杞δ13C值存在顯著差異,說明了環境因素對δ13C值的影響,肯定碳同位素在判別不同產地同源植物時的作用。δ15N值變化往往會受到大氣環境、土壤類型等因素的影響,較環境因素而言,化學肥料造成的土壤中含氮量不同導致δ15N值差異的影響要更大。李安等[24]在產地溯源中提到,施用有機肥的農作物樣品中δ15N值明顯高于施用無機化肥樣品,由2.1分析結果可知,青海枸杞δ15N值明顯高于寧夏和青海,近年來青海枸杞產地發展勢頭較好,與施用有機肥是密不可分的。

植物中δ2H值和δ18O值通常受蒸騰作用、降水和海拔等因素的影響,常用作載體進行產地溯源分析[25]。將寧夏產區枸杞中H、O同位素比值導入SPSS軟件以雙變量進行相關性檢驗,結果顯示在0.01水平上相關性顯著,如圖4所示。這與H和O都是水的組成因素,在水循環過程中有著相似的分餾作用有關。氫穩定同位素比值通常隨海拔的升高而降低,3個地區采樣點海拔從高到低依次為青海、寧夏、新疆,氫穩定同位素比值從高到低依次為新疆、寧夏、青海,這與生態規律相吻合；青海枸杞氧穩定同位素比值偏高,這可能與枸杞中自身物質合成影響了氧同位素比值有關[26]。同時,3個地區采樣點緯度范圍相近,當地灌溉方式、降水量的差異也可能對枸杞中氧同位素比值產生不同程度的影響。溯源進程中應考慮緯度效應、海拔效應和大陸效應等多種效應的綜合影響[27]。

大氣中的硫化物、水源中的硫化物(包括大氣降水和海洋水)、化石燃料等因素影響硫穩定同位素豐度變化,其中水源和化石燃料均通過土壤影響植物的生長,青海、寧夏和新疆地區枸杞中S同位素并未表現出顯著差異,這可能與3個主產區均位于西北地區,地質結構相似有關。本文建立以同位素為依據對枸杞主產地進行判別,模型準確率較高,后續試驗將考慮繼續增加采樣量和采樣地點,以建立最優的枸杞產地溯源模型。

圖4 H、O穩定同位素組成相關性分析Fig.4 Correlation analysis of stable isotope compositions of the δ2H and δ18O

本文采用穩定同位素比率質譜儀測定了青海、寧夏和新疆3個地區份共97份枸杞樣品中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S 5種穩定同位素比值組成。基于箱線圖、單因素方差分析及主成分分析等化學計量法分析各同位素比值差異,進一步肯定各同位素在枸杞產地判別中的重要作用。結合LDA和SVM兩種算法建立枸杞判別模型,SVM判別模型初始驗證和模型訓練的準確率分別為95.9%和96.9%,相對優于LDA模型,可為實現枸杞產地判別提供依據。