生物轉化生產稀有糖醇
——阿洛醇(蒜糖醇)研究進展

溫鑫,寧宇航,林慧彬,任一林,林建群*,林建強*

1(微生物技術國家重點實驗室(山東大學),山東 青島,266237) 2(山東省中醫藥研究院,山東 濟南,250014) 3(青島龍鼎生物技術有限公司,山東 青島,266108)

國際稀有糖協會(International Society of Rare Sugars,ISRS)定義稀有糖為自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物[1]。阿洛醇(C6H14O6),又稱為蒜糖醇,是一種稀有糖醇和低能量甜味劑,在自然界中含量極低,但具有重要生理功能,可廣泛應用于食品、醫藥、化工等領域[2]。

根據IZUMORI提出的稀有糖轉化策略(Izumoring策略),單糖以及糖醇之間可以通過D-塔格糖3-差向異構酶、醇脫氫酶、醛糖異構酶和醛糖還原酶等酶實現相互轉化,而且阿洛醇處于D/L-型糖轉化的樞紐位置,經相應的酶催化可以得到D/L-阿洛酮糖和D/L-阿洛糖等高價值稀有糖[3]。

目前,阿洛醇主要采用生物轉化方法生產,利用多酶反應和輔酶再生系統分別由D-葡萄糖(D-glucose)、D-果糖(D-fructose)和D-阿洛酮糖(D-psicose)生物合成阿洛醇。如圖1,葡萄糖異構酶(glucose isomerase,GI)可催化D-葡萄糖為D-果糖,D-阿洛酮糖3-差向異構酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)或D-塔格糖 3-差向異構酶(D-tagatose 3-epimerase,DTE)可催化D-果糖為D-阿洛酮糖,D-阿洛酮糖經核糖醇脫氫酶(ribitol dehydrogenase,RDH)和甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase,FDH)催化最終得到阿洛醇[1]。本文對生物合成阿洛醇(蒜糖醇)的生物酶、生產工藝、應用領域及研究進展進行了綜述,對阿洛醇(蒜糖醇)生物轉化技術發展進行了展望。

GI-葡萄糖異構酶；DTE-D-塔格糖3-差向異構酶；DPE-D-阿洛酮糖3- 差向異構酶；RDH-核糖醇脫氫酶；FDH-甲酸脫氫酶圖1 由D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖生產阿洛醇流程圖Fig.1 Scheme of allitol production from D-glucose, D-fructose and D-psicose

1 阿洛醇的應用

1.1 低熱量甜味劑

隨著經濟的日益發展,人民生活水平的提高,肥胖的人數越來越多。高糖飲食是導致肥胖的一個重要原因。因此,尋求有甜味但熱量低的糖取代高熱量高消耗的糖極為必要。目前常用的代糖甜味劑,口感仍不及蔗糖、果糖等天然甜味劑,有必要開發即有保健功能,又有良好口感的新型甜味劑以滿足市場需求。稀有糖作為一種低熱量碳水化合物對人體健康大有裨益。如今,D-阿洛酮糖等稀有糖已作為低熱量甜味劑開始應用于食品中[4]。同樣,阿洛醇具有低熱量、低吸收的特點,且具有重要生理活性,可以作為甜味劑、膨脹劑應用于食品行業,有很好的市場前景[2]。

1.2 藥物及藥物合成中間體

2009年,OOSAKA給小鼠飼喂阿洛醇,通過觀察小鼠的腹瀉情況來評估阿洛醇的通便功效,并研究了阿洛醇對腸道運輸和腸道含水量的影響,結果發現阿洛醇可以增加小腸內的含水量,促進小腸運輸,發揮通便功效,可用于制備單糖瀉藥,治療便秘[5]。此外,阿洛醇是合成氨雜糖的重要中間體,可以用于制備抗糖尿病、癌癥和包括艾滋病在內的病毒感染的藥物[2]。

1.3 生產其他D/L-型稀有糖的底物

根據Izumoring策略,阿洛醇處于D/L-型糖轉化的樞紐位置,經合適的酶或細胞催化可以得到其他D/L-型稀有糖,例如D-阿洛酮糖、L-阿洛酮糖、D-阿洛糖和L-阿洛糖等[3]。L-型稀有糖是合成抗癌、抗病毒藥物的前體。目前,L-型稀有糖的研究引起廣泛關注,從阿洛醇出發尋找合適的酶生產L-型稀有糖具有重要的研究價值。

1.4 木質文物保藏處理劑

糖醇飽和法是保護受水浸漬的有機文物,特別是木質文物的有效方法。該方法對于消除糖醇結晶中的雜質是很重要的,這可以通過混合一種具有抗結晶效果的糖來實現。經研究發現,阿洛醇具有與傳統抗結晶劑相似的性能,且在強真空中也能保持晶體結構,成為綜合性能最好的木質文物保藏處理劑(http://www.kagawa-isf.jp/glycobio/english/pdf/culture_01.pdf)。

2 阿洛醇生產方法

2.1 自然提取法

自然界中的阿洛醇主要存在于鼠刺和紫色粉孢牛肝菌中,含量微少。從1 kg新鮮鼠刺葉片和485 g紫色粉孢牛肝菌中可分別提取出14 和1.2 g阿洛醇。大規模提取阿洛醇既消耗大量的原材料,又不利于環境保護,而且生產成本高,不適用于阿洛醇的大規模生產[6-7]。

2.2 化學合成法

1973年,英國人BALLARD和STACEY從含有13 gD-阿洛糖,4 g硼氫化鈉和85 mL水的反應體系中得到11.3 g阿洛醇[8]。2010年,科學家提出順-3-己烷-1,2,5,6-四醇經氧化可同時產生阿洛醇和半乳糖醇[2]。2016年,JUMDE等人通過區域選擇性氧化還原反應催化葡萄糖得到阿洛醇(圖2)[9]。化學合成法具有反應速率快,效率高的優點,但是利用該方法合成阿洛醇,要么反應底物本身也是稀有糖,原料來源受到限制,要么反應過程復雜,容易生成副產物甚至毒性副產物,導致分離純化困難,使得阿洛醇產率和純度降低。因此,化學合成法不利于阿洛醇的商業化生產。

圖2 氧化還原法由葡萄糖合成阿洛醇[9]Fig.2 Allitol synthesized from glucose by chemical oxidation and reduction reactions[9]

2.3 生物轉化法

當前,阿洛醇生產主要采用生物轉化的方法,通過酶催化或者微生物全細胞催化的方式由D-葡萄糖、D-果糖或D-阿洛酮糖生產阿洛醇[2]。雖然生物轉化法生產阿洛醇也具有一些不足,例如生物催化劑的催化活性和環境耐受性仍有待提高等,但是相比提取和化學合成方法,生物轉化法具有簡便高效、反應條件溫和、無毒性副產物、對環境無污染、成本低廉、產量高等優點,是當前稀有糖醇生產的主要方法。

3 阿洛醇生物轉化所涉及的生物酶

3.1 酮糖 3-差向異構酶

阿洛醇可由D-阿洛酮糖生物轉化而來,而D-阿洛酮糖可由酮糖 3-差向異構酶由D-果糖生物轉化而來。其中,DTE和DPE都可以實現D-果糖和D-阿洛酮糖之間的相互轉化[10-11]。IZUMORI等首次從Pseudomonassp.ST-24中發現了DTE,該酶最適底物為D-塔格糖,但可以轉化D-果糖為D-阿洛酮糖[12]。之后,來自于Rhodobactersphaeroides[13]的DTE也被報道可用于D-阿洛酮糖的生物轉化。DTE對D-阿洛酮糖具有較高的底物特異性。來自于Agrobacteriumtumefaciens[14],ClostridiumcellulolyticumH10[15],和Ruminococcussp.[16]的DTE也得到相應的研究和應用。此外,來自于Mesorhizobiumloti的L-核酮糖 3-差向異構酶(L-ribulose 3-epimerases,LRE)也可催化D-果糖為D-阿洛酮糖[17]。

3.2 RDH

RDH可以轉化D-阿洛酮糖為阿洛醇。RDH屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族(short-chain dehydrogenases/reductase family,SDR),它是一種NADH-依賴型醇脫氫酶,在生物轉化法生產阿洛醇的過程中發揮重要作用。目前,在Enterbacteragglomerans221e[18],KlebsiellapneumoniaeIFO 3321[19]和ProvidenciaalcalifaciensRIMD 1656011[20]中已經發現并鑒定得到RDH。不同來源的RDH底物專一性不同。例如,當以D-果糖為底物時,來源于Enterbacteragglomerans221e的RDH除了可將D-果糖催化為阿洛醇外,還可將D-果糖催化為D-山梨醇,不利于阿洛醇的生產[18-19]。相比之下,來源于KlebsiellapneumoniaeIFO 3321和ProvidenciaalcalifaciensRIMD 1656011的RDH對阿洛醇具有很高的底物專一性,由D-果糖生產阿洛醇不產生其他副產物[2,19-20]。

3.3 FDH

RDH需要NAD+/NADH輔酶,催化合成阿洛醇過程中消耗大量NADH。NADH價格高,額外添加導致極高的成本,難以工業應用。為此,需要建立NADH生物再生系統。NAD+依賴型的FDH可有效地將甲酸(或甲酸鹽)氧化為CO2,同時將NAD+還原為NADH(圖1),實現RDH所需NADH輔酶再生,通過酶偶聯法實現阿洛醇的高效生產。FDH在自然界中分布廣泛,既存在于細菌(Pseudomonassp.101[21],Staphylococcusaureus[22]等)、酵母菌(Candidaboidinii[23],OgataeaparapolymorphaDL-1[24]等)、絲狀真菌(Neurosporacrassa[25]等)中,也存在于植物(大豆、擬南芥、橡樹等)和其他高等真核生物中[26]。20世紀90年代中期,研究人員經比較發現,來自于細菌的FDH比來自酵母的FDH更加穩定,酶活性也更高[27]。此后,對來自于細菌中的FDH研究尤為廣泛。FDH作為輔酶再生系統具有以下優點：其一,其催化的還原反應不可逆；其二,反應所需底物甲酸鹽價格低廉,而且很多酶對甲酸鹽具有很高的耐受性,對酶的活性影響小；其三,反應產生的副產物CO2對酶活性幾乎沒有影響,而且作為氣體很容易地從反應體系中溢出,能夠有效地省去后期繁瑣的分離操作[26]。

4 酶轉化生產阿洛醇

4.1 酶轉化D-阿洛酮糖生產阿洛醇

2000年,TAKESHITA等利用RDH(來自于KlebsiellapneumoniaeIF0 3321)和FDH成功實現了由D-阿洛酮糖轉化生產阿洛醇,在30 ℃,pH 8.0條件下反應48 h后,得到10 g/L阿洛醇,底物幾乎全部轉化[19]。2016年,HASSANIN等報道了來自于ProvidenciaalcalifaciensRIMD 1656011的RDH不僅能催化核糖醇為D-核酮糖,還能將D-阿洛酮糖轉化為阿洛醇[20]。同年,HASSANIN等使用該RDH和來自于OgataeaparapolymorphaDL-1的FDH將20 mgD-阿洛酮糖在6 h內催化生成(16.7±0.62) mg 阿洛醇,并最終得到純度為95%的阿洛醇晶體[24]。

4.2 酶轉化D-果糖生產阿洛醇

TAKESHITA等在利用多酶促反應成功實現由D-阿洛酮糖生產阿洛醇的同時,又在反應體系中加入了來自于PseudomonascichoriiST-24的DTE酶,該酶能夠催化D-果糖生成D-阿洛酮糖,進而經RDH和FDH將D-阿洛酮糖催化為阿洛醇。在相同條件下反應48 h后,10 g/L的D-果糖同樣幾乎全部轉化成阿洛醇,并且沒有任何副產物生成[19]。

雖然酶法轉化可實現由D-阿洛酮糖或D-果糖生產阿洛醇,阿洛醇轉化率高,所得阿洛醇晶體的純度較高,但是該法需要額外添加輔酶NAD+/NADH,導致生產成本高,而且需要酶的分離純化或固定化,增加了工藝復雜性和生產成本。

5 微生物全細胞轉化生產阿洛醇

5.1 微生物全細胞轉化D-阿洛酮糖生產阿洛醇

MUNIRUZZAMAN等利用Enterobacteragglomerans221e實現了由D-阿洛酮糖生產阿洛醇,在30 ℃,pH 9.0條件下反應24 h后,0.5%的D-阿洛酮糖有97%轉化成阿洛醇[18]。2014年,HAN等利用KlebsiellaoxytocaG4A4實現了由D-阿洛酮糖生產阿洛醇,當底物D-阿洛酮糖的濃度為0.25%時,37 ℃,pH 8.0,約反應36 h后,阿洛醇的轉化率達到87%[28]。2018年,HASSANIN等構建了能夠同時表達RDH(ProvidenciaalcalifaciensRIMD 1656011)和FDH(OgataeaparapolymorphaDL-1)的重組菌E.coliBL21 Star(DE3) pETDuet-1-RDH-FDH,并利用該菌進行全細胞生物轉化,當底物D-阿洛酮糖的濃度為2.0%時,30 ℃,pH 7.0,反應48 h生成了19.2 mg阿洛醇[29]。本實驗室構建了能夠同時表達RDH(ProvidenciaalcalifaciensRIMD 1656011)和FDH(Pseudomonassp.101)的重組菌,并利用該菌進行微生物全細胞轉化,可有效地實現由D-阿洛酮糖生產阿洛醇,底物濃度為90 g/L時轉化率達到64.3%。為了克服生物轉化反應中間產物的擴散限制和避免中間產物對細胞正常代謝的干擾,本實驗室還發明了一種用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架,該RNA支架將RDH和FDH錨定在相鄰空間的位置,使人工合成途徑的重組酶分子在空間上相互靠近,形成人工合成通路,促進阿洛醇的高效合成并減少對宿主菌正常代謝的干擾,當利用RNA支架錨定RDH和FDH的重組菌株轉化D-阿洛酮糖時,阿洛醇的產量具有明顯提高[30-31]。

D-阿洛酮糖作為稀有糖價格較高。為此,本實驗室利用DPE實現了以D-果糖生產D-阿洛酮糖,并分別利用酶催化法和模擬移動床色譜分離兩種分離純化方法得到了高純度D-阿洛酮糖,最后利用冷卻結晶法得到大量高純度D-阿洛酮糖晶體[32-34],為阿洛醇生產提供重要原料。

5.2 微生物全細胞轉化D-果糖生產阿洛醇

為了降低使用阿洛醇生產的原料成本,可以使用D-果糖為生產原料(圖1)。2015年,ZHU等構建了重組菌E.coliBL21 Star(DE3) pCDF-rdh-fdhpET-dpepACYC184 M-glf,該菌含有3種不同抗性的重組質粒,能夠同時表達DPE(Ruminococcussp.)、RDH(Klebsiellaoxytoca)、FDH(Candidamethylica)和GLF(促葡萄糖/果糖轉運膜蛋白,Zymomonasmobilis)4種酶,利用此菌催化500 mmol/LD-果糖最終能得到48.62 g/L阿洛醇[35]。2020年,本實驗室構建了能夠同時表達DPE、RDH和FDH的雙質粒重組菌,并利用補料培養獲得大量菌體,用于轉化D-果糖為阿洛醇,在底物D-果糖質量濃度100 g/L,45 ℃,pH 7.0條件下,反應4 h,阿洛醇轉化率達到63%[36]。考慮到雙質粒菌株的穩定性差,而且培養雙質粒菌株需要添加2種不同抗性的抗生素,使得生產成本增加,本實驗室又構建了能夠同時表達DPE、RDH和FDH的單質粒重組菌,并利用該菌進行全細胞生物轉化,在底物D-果糖的質量濃度為100 g/L,45 ℃,pH 6.0條件下,反應3 h,阿洛醇的轉化率同樣達到了63%,并利用結晶法得到了高純度阿洛醇晶體[37]。使用單一質粒,菌株穩定性更好,而且菌株培養過程只需要添加一種抗生素,極大地提高了工藝穩定性并降低了生產成本。

5.3 采用微生物全細胞和酶相結合的方法由D-葡萄糖生產阿洛醇

雖然D-果糖成本低于D-阿洛酮糖,但仍大幅高于D-葡萄糖。D-葡萄糖轉化生產D-果糖工藝成熟,葡萄糖異構酶可高效催化上述轉化(圖1)。因此,將葡萄糖異構酶引入阿洛醇生產流程,可實現由D-葡萄糖生物轉化阿洛醇。2020年,本實驗室利用固定化葡萄糖異構酶和能夠同時表達DPE、RDH和FDH的重組菌作為混合催化劑以50 g/LD-葡萄糖為底物生產得到12.7 g/L阿洛醇,首次利用廉價底物D-葡萄糖生物轉化阿洛醇,為大規模、低成本生產阿洛醇建立了切實可行的技術路線[36]。

綜上所述,通過酶轉化法和微生物全細胞轉化法可分別實現由D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖生物轉化生產阿洛醇(表1)。但相比于微生物全細胞轉化法,酶轉化工藝更加復雜。首先,酶轉化法涉及酶的提取,甚至酶的分離純化和酶的固定化,并且容易導致酶的損失；其次,酶轉化法需要額外添加價格昂貴的輔酶NAD+/NADH。以上原因導致生產工藝流程復雜,生產成本提高,不利于阿洛醇的工業化生產。微生物全細胞轉化法生產阿洛醇可以有效地避免上述問題,采用離心或過濾的簡單方式可得到具有催化活性的菌體,用于阿洛醇的催化生產,而且催化過程不需要額外添加輔酶NAD+/NADH,可以直接利用胞內的輔酶參與反應。該工藝簡單,生產成本低,有利于阿洛醇的工業化生產。利用酶與細胞結合的方法,以廉價底物D-葡萄糖生產阿洛醇,可進一步降低生產成本,有利于大規模工業生產。

6 展望

阿洛醇作為一種稀有糖具有重要的生理功能和應用價值。當前,阿洛醇的生產主要采用生物轉化法,一是酶轉化法,二是微生物全細胞轉化法。其中,微生物全細胞轉化法與酶轉化法相比不需要細胞破碎和添加輔酶,具有明顯的工藝和成本優勢。但是,生物轉化法生產阿洛醇,生物催化劑活性以及環境耐受性等仍有待提高,輔酶再生系統仍有待進一步完善。例如,可以采用酶分子理性設計、酶分子結構突變和高通量篩選等方式對酶分子進行進一步改造和優化；對主反應及輔酶再生反應通路進行優化設計以期得到高反應活性的催化菌株；對反應過程進行系統性優化,以進一步提高阿洛醇生產水平和生產效率。

表1 利用酶轉化法和微生物全細胞轉化法由D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖生產阿洛醇Table 1 Production of allitol from D-glucose,D-fructose and D-psicose by using enzymatic catalysis and whole-cell catalysis