新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉和啶蟲脒對人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的毒性作用

黃鈺婷，李敬堯，張琪，王丹，周群芳，盧曉霞,*

1. 地表過程分析與模擬教育部重點實驗室，北京大學城市與環境學院，北京 100871 2. 中國科學院生態環境研究中心環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085

新煙堿類殺蟲劑(neonicotinoid insecticide)是一類具有優越殺蟲活性的殺蟲劑。1985年，德國拜耳公司(Bayer)成功開發出第一種商用新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉(imidacloprid, C9H10ClN5O2)[1]。此后，不斷有新的新煙堿類殺蟲劑被開發出來，廣泛用于農業、景觀以及動物身上害蟲的防治。目前，新煙堿類殺蟲劑是全球殺蟲劑中體量最大的品種，全球銷售額約為34億美元，約占全球殺蟲劑銷售額的20%，其代表產品吡蟲啉、噻蟲嗪和啶蟲脒等憑借其低毒、高效、廣譜的特點，在農產品種植領域擁有極大的市場份額。其中，吡蟲啉2014年的全球銷售額已超過11億美元，啶蟲脒(acetamiprid, C10H11ClN4，1996年由日本曹達株式會社開發出并實現商業化)2014年的全球銷售額接近3億美元[2]。

隨著新煙堿類殺蟲劑的大量使用，其在環境中的殘留對生態安全、糧食安全以及人類健康的潛在影響也引起了學術界的廣泛關注。已有研究表明，土壤[3]、水[4]、蔬菜水果[5]、甚至牛奶[6]等物質中都有不同程度的新煙堿類殺蟲劑的檢出。呂正標[7]測定了中國杭州市自來水樣品中新煙堿類殺蟲劑的殘留情況，發現檢出率最高的為吡蟲啉(87%)，其次為啶蟲脒(83%)和噻蟲胺(54%)，平均殘留濃度最高的為啶蟲脒(5.8 ng·L-1)，其次為吡蟲啉(4.0 ng·L-1)和烯啶蟲胺(2.5 ng·L-1)。譚穎等[8]研究了中國北京市當地市場蔬菜水果樣品中各種新煙堿類殺蟲劑的殘留情況，發現吡蟲啉和啶蟲脒的檢出率均達100%，濃度均值分別為0.73～1.11 μg·kg-1和1.07～1.55 μg·kg-1。Wang等[9]對中國山東某農村及周邊城市的295份人體尿液樣本(農村235份，城市60份)中的吡蟲啉進行了檢測，結果顯示農村和城市樣本中吡蟲啉檢出率分別為100%和95%，殘留濃度中位數分別為0.16 μg·L-1和0.15 μg·L-1。Chen等[10]檢測了中國無錫市120份成人血清樣品中的9種新煙堿類殺蟲劑的濃度，結果顯示吡蟲啉檢出率為28.3%，噻蟲胺為16.7%，噻蟲啉為14.2%，啶蟲脒為12.5%，濃度范圍為32.0～427 pg·mL-1。

新煙堿類殺蟲劑是煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)的激動劑，對昆蟲有很好的選擇性[11]。nAChR通過結合突觸前膜釋放的神經遞質乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)發生膜電位去極化，增強對Na+、K+和Ca2+的通透性，從而使信號在細胞之間傳遞。突觸間的乙酰膽堿酯酶可以降解ACh，使神經元恢復到極化狀態。新煙堿類殺蟲劑如吡蟲啉和啶蟲脒也可與nAChR結合引起信號傳遞，但他們不能被乙酰膽堿酯酶降解，使得nAChR不停地受到刺激，沖動傳導無法中斷，從而擾亂昆蟲正常的神經活動，最后導致死亡[12]。

近幾年來，一些研究表明吡蟲啉和啶蟲脒對哺乳動物甚至人類的神經發育有一定的毒性效應。在流行病學研究中，Yang等[13]發現孕婦住處吡蟲啉的使用量與胎兒無腦畸形有正相關關系。Keil等[14]發現407個出生前暴露過吡蟲啉的兒童得自閉癥的概率稍高于262個未暴露的兒童。在體內實驗研究中，Bal等[15]發現暴露于濃度>10 mmol·L-1的吡蟲啉不到1 min即可損害具有煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)的小鼠耳蝸核星狀細胞的膜特性，如膜電位的顯著去極化。在體外實驗中，Kimura-Kuroda等[16]以新生大鼠小腦神經元為對象，發現在表達了nAChRsα3、α4、α7亞基mRNA的小腦神經元中，濃度>1 μmol·L-1的吡蟲啉和啶蟲脒與煙堿一樣可引起明顯的興奮性Ca2+內流。

目前關于吡蟲啉和啶蟲脒等新煙堿類殺蟲劑對人的神經毒性效應與機制仍知之甚少。本文以人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞為模型，采用體外細胞實驗，研究不同濃度吡蟲啉和啶蟲脒暴露對細胞活力、細胞形態、nAChRsα7亞基的mRNA和蛋白表達、乙酰膽堿酯酶活性以及氧化應激的影響，為這2種殺蟲劑的健康風險評價提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細胞和試劑

本實驗采用的人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所國家實驗細胞資源共享服務平臺。吡蟲啉(純度99.82%)和啶蟲脒(純度99.45%)購自美國百靈威科技有限公司，并溶解于經0.22 μm濾膜過濾的二甲基亞砜(DMSO)備用。吡蟲啉和啶蟲脒的分子結構與理化性質如表1所示。細胞培養過程中使用的DMEM高糖培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS，不含鈣、鎂、酚紅)購自美國HyClone公司，胎牛血清、雙抗混合液(10 000 Units·mL-1青霉素及10 000 μg·mL-1鏈霉素)以及0.25%胰蛋白酶(含EDTA)購自美國Gibco公司。

1.2 細胞暴露實驗

SK-N-SH細胞培養于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，選取對數生長期細胞進行實驗。

在細胞活力測試中，將對數生長期的SK-N-SH細胞按照5×105個·mL-1的密度，在96孔板中每孔均勻鋪200 μL，置于培養箱(37 ℃、5% CO2)內，貼壁生長24 h，之后棄去舊培養基，用PBS緩沖液清洗細胞一次，然后每孔加入200 μL加藥培養基在培養箱內暴露24 h。吡蟲啉和啶蟲咪的暴露濃度分別設置了7個水平(0.6、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 mmol·L-1)和11個水平(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mmol·L-1)，同時設置了一個溶劑對照(0.1% DMSO)。每組設置5個平行。

在細胞形態、nAChRsα7亞基的mRNA和蛋白表達、乙酰膽堿酯酶活性和氧化應激測試中，將對數生長期的SK-N-SH細胞按照5×105個·mL-1的密度，在六孔板中每孔均勻鋪3 mL，置于培養箱(37 ℃、5% CO2)內，貼壁生長24 h，之后棄去舊培養基，用PBS緩沖液清洗細胞一次，然后每孔加入3 mL加藥培養基在培養箱內暴露24 h。吡蟲啉和啶蟲咪的暴露濃度分別設置了3個水平(0.01、0.1和1.0 mmol·L-1)，同時設置了一個溶劑對照(0.1% DMSO)。每組設置3個平行。暴露濃度的設置基于細胞活力實驗，并參考相關文獻[18-19]。

1.3 細胞指標測定

1.3.1 細胞活力測定

細胞活力測定使用Alamar Blue檢測試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。細胞暴露完成后，棄去100 μL培養基，然后每孔加入10 μL Alamar Blue檢測試劑，在培養箱(37 ℃、5% CO2)內避光孵育4～6 h，待培養基的顏色由靛青藍開始變成粉紅色時，測定每孔在530 nm激發光激發條件下激發出的590 nm發射光的強度，此光強值與每孔中的活性細胞數成正比。根據暴露組與溶劑對照組中細胞活力的比值與1的差值，計算細胞相對抑制率。

1.3.2 細胞形態觀察

在倒置光學顯微鏡(重慶澳浦光電技術有限公司)下觀察細胞形態，顯微鏡放大倍數為目鏡16×物鏡40。

1.3.3 nAchRα7亞基mRNA表達的測定

使用實時熒光定量PCR儀(美國ABI 7500 Fast)測定細胞中nAchRα7亞基mRNA表達水平。細胞暴露完成后，棄去培養基。每孔加入1 mL Trizol(美國Thermo Fisher Scientific公司)，冰上裂解5 min。將每孔中吹打均勻的液體加入的1.5 mL離心管(A管)中，加入200 μL氯仿進行萃取，蓋緊蓋子。劇烈晃動15 s，充分混勻后室溫靜置5 min。離心機在4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min。離心后將收集上層無色液體至1.5 mL干凈離心管(B管)，加入500 μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫孵育10 min。離心機在4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min。棄上清，每管加入1 mL用DEPC水(中國北京誠業科技有限公司)配制的75%乙醇充分洗滌RNA沉淀。離心機在4 ℃、7 500 r·min-1條件下離心10 min。重復洗滌操作一次。棄去B管上清，適度晾干，然后加入20 μL無酶水，輕彈混勻，測濃度。根據Go ScriptTMReverse Transcription System試劑盒(美國Promrga公司)的說明，將RNA反轉錄為cDNA。定量PCR實驗前于70 ℃在15 min內去除反轉錄酶。實驗中用到的基因的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如表2所示，內參基因為β-Actin基因。按照擴增試劑盒SYBR Green Supermix(中國北京誠業科技有限公司)的要求配制20 μL反應混合液，實時熒光定量PCR反應程序為：95 ℃預熱30 s，循環數為40，每個循環中95 ℃反應15 s，60 ℃反應1 min。使用2-△△CT的計算方法計算qPCR中實驗組相對對照組的mRNA表達量倍數，以對照組為1進行標準化。

1.3.4 nAchRα7亞基蛋白表達的測定

采用Weston Blot法測定nAchRα7亞基蛋白表達水平。細胞暴露完成后，棄去培養基，用預冷的PBS清洗2次(置于冰上操作)。向每孔中加入100 μL細胞裂解液，并用干凈的細胞刮刀將貼壁細胞刮下。收集裂解液中的細胞至2 mL離心管中，在冰上裂解1 h。裂解完畢后，14 000 r·min-1離心15 min(4 ℃)，收集上清液于另一離心管中，棄去沉淀，使用BCA法測定上清液的蛋白質濃度。上樣緩沖液與樣品按1∶3體積比混合于600 μL離心管中，95 ℃加熱15 min使蛋白質變性。在12孔預制膠中每孔上樣18 μL進行電泳，電泳電壓恒壓100 V，時間為70 min。電泳結束后，將膠取下，恒流270 mA轉PVDF膜60 min，得到的PVDF膜先用含5%脫脂奶粉的TBST溶液進行封閉1 h，然后用一抗(抗nAchRα7，美國Abcam公司)孵育膜過夜。孵育完畢后，用TBST洗膜3次，然后用二抗(山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor? 488)，美國Abcam公司)孵育80 min。孵育完畢后，用TBST洗膜3次。將PVDF膜放在一張保鮮膜上。使用ECL(美國Thermo Fisher公司)顯影后，用ImageJ軟件進行灰度分析，根據計算結果與蛋白質濃度之比，獲得目標蛋白人nAchRα7亞基的相對表達量。β-actin蛋白作為上樣參考。將曝光過一次的膜用TBST清洗3次，然后使用膜再生液處理，洗掉膜上結合的一抗。重新用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉膜1 h，重新孵育β-actin的一抗過夜。之后步驟同nAchRα7的處理。

表2 RT-qPCR使用的引物序列Table 2 Primer sequences used in RT-qPCR

1.3.5 乙酰膽堿酯酶活性測定

采用人乙酰膽堿酯酶(AChE)酶聯免疫分析試劑盒(上海研謹生物科技有限公司)，利用雙抗體夾心法測定樣品中的AChE活性。細胞暴露完成后，棄去培養基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2次。用0.05%胰蛋白酶將細胞從六孔板上消化并收集到2 mL離心管中，2 000 r·min-1離心20 min(4 ℃)，棄去上清液，用PBS清洗沉淀2次，2 000 r·min-1離心20 min(4 ℃)，棄去上清液，用PBS重懸細胞，至細胞濃度達到1×106個·mL-1。在液氮中反復凍融收集到的細胞3次，2 000 r·min-1離心20 min(4 ℃)，收集上清液并使用BCA法測定其中的蛋白質濃度(PierceTMBCA Protein Assay Kit試劑盒，美國Thermo Fisher公司)。在96孔板微孔中包被固定好人AChE抗體，加入樣品并在37 ℃下孵育30 min，使樣品中的AChE與固定的抗體結合。用洗滌液洗滌微孔5次，再加入有辣根過氧化物酶(HRP)標記的AChE抗體，37 ℃孵育30 min，使新加入的抗體包被在AChE上，形成抗體-抗原-酶標復合體。用洗滌液洗滌微孔5次，依次加入底物過氧化脲與3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)。HRP催化過氧化脲與TMB反應，生成藍色產物。藍色產物在酸環境下轉變為黃色，通過測定其在450 nm波長的吸光度，與標準樣品比對，定量檢測加入樣品中AChE的活性濃度。計算結果與蛋白濃度之比，可得AChE在細胞中相對活性濃度。

1.3.6 細胞氧化應激測定

還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值常作為指示生物體內氧化應激的指標[22]。本實驗中采用細胞內GSSG/GSH的變化表征氧化應激。利用總谷胱甘肽試劑盒(中國碧云天公司)測定細胞內谷胱甘肽含量。細胞暴露完成后，棄去培養基，用PBS洗滌細胞一次，離心收集細胞，棄去上清。加入細胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑，利用液氮和37 ℃水浴對樣品進行2次快速的凍融，4 ℃或冰浴放置5 min，10 000 r·min-1離心10 min(4 ℃)，然后取一部分上清液用于總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的測定，另一部分加入GSH清除試劑，用于測定細胞內GSSG含量。向兩部分樣品中分別加入蛋白去除試劑和總谷胱甘肽檢測工作液，在25 ℃下孵育5 min，再加入0.5 mg·mL-1NADPH混勻，立即測定其在412 nm下的吸光度?？偣入赘孰暮颗c氧化型谷胱甘肽含量相減，即得到還原性谷胱甘肽含量。

1.3.7 轉錄組分析

將0.1 mmol·L-1吡蟲啉暴露組和溶劑對照組的細胞用0.05%胰蛋白酶(含EDTA)從培養皿上消化下來，用PBS緩沖液洗凈，每組設置3個平行，交付上海生工生物工程股份有限公司用Illumina Hiseq 2500進行全RNA測序分析。在高通量測序的結果中篩選出吡蟲啉暴露組和溶劑對照組基因表達量差異顯著的基因，在相關生物信息學數據庫當中查詢其功能，并歸納出表達變化基因的功能。

1.4 數據處理

使用統計軟件SPSS Statistics 20.0對數據進行分析，采用T檢驗方法檢驗結果顯著性，顯著性水平設為0.05。

2 結果(Results)

2.1 吡蟲啉和啶蟲咪暴露對SK-N-SH細胞活力的影響

SK-N-SH細胞在不同濃度吡蟲啉和啶蟲咪培養液中暴露24 h后的細胞活力和細胞活力抑制率如圖1所示。與對照組相比，吡蟲啉的10%抑制濃度(IC10)約為1.5 mmol·L-1。當吡蟲啉濃度<1.2 mmol·L-1時，細胞活力沒有受到顯著影響(P>0.05)；當吡蟲啉濃度≥1.5 mmol·L-1時，細胞活力顯著降低(P<0.05)，且有明顯的劑量-效應關系(P<0.05)。由于吡蟲啉的溶解度有限，無法觀察到吡蟲啉的50%抑制濃度(IC50)值。與對照組相比，啶蟲脒的IC10約為2.0 mmol·L-1，IC50約為10.6 mmol·L-1。當啶蟲脒濃度<1 mmol·L-1，細胞活力沒有受到顯著影響(P>0.05)；當啶蟲脒濃度≥1 mmol·L-1時，細胞活力顯著降低(P<0.05)，且有明顯的劑量-效應關系(P<0.05)。由于通常情況下人體內新煙堿類殺蟲劑的暴露劑量較低[8,23]，根據細胞活力實驗結果，設定了3個梯度的低濃度水平(0.01、0.1和1 mmol·L-1)進行后續暴露實驗。在倒置光學顯微鏡下觀察，與溶劑對照相比，0.01～1 mmol·L-1吡蟲啉/啶蟲脒暴露下的細胞形態無明顯變化。不同濃度吡蟲啉暴露下的細胞形態如圖2所示。

圖1 不同濃度吡蟲啉(a)和啶蟲脒(b)對細胞活力的影響注：DMSO表示二甲基亞砜溶劑對照(0.1% DMSO)，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，與溶劑對照比較。Fig. 1 Effects of imidacloprid (a) and acetamiprid (b) at different concentrations on cell viabilityNote: DMSO stands for dimethyl sulfoxide solvent control (0.1% DMSO); *represents P<0.05, **represents P<0.01, ***represents P<0.001, as compared to the solvent control.

圖2 溶劑對照和3種濃度吡蟲啉暴露下的細胞形態(20×20)注：(a) 溶劑對照；(b) 0.01 mmol·L-1吡蟲啉；(c) 0.1 mmol·L-1吡蟲啉；(d) 1 mmol·L-1吡蟲啉。Fig. 2 Cell morphology in solvent control and in groups exposed to different concentrations of imidacloprid (20×20)Note: (a) solvent control; (b) 0.01 mmol·L-1 imidacloprid; (c) 0.1 mmol·L-1 imidacloprid; (d) 1 mmol·L-1 imidacloprid.

2.2 吡蟲啉和啶蟲咪暴露對SK-N-SH細胞nAchR α7亞基mRNA和蛋白表達的影響

SK-N-SH細胞在溶劑對照和3個濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)吡蟲啉和啶蟲咪培養液中暴露24 h后nAchRα7亞基mRNA表達水平的變化如圖3所示。與溶劑對照組相比，1 mmol·L-1的2種殺蟲劑暴露組中nAchRα7亞基的mRNA表達均顯著上升(P<0.05)。

SK-N-SH細胞在溶劑對照和3個濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)吡蟲啉和啶蟲咪培養液中暴露24 h后nAchRα7亞基蛋白表達的比較如圖4和圖5所示。與溶劑對照組相比，1 mmol·L-1的2種殺蟲劑暴露組中nAchRα7亞基的蛋白表達均顯著上升(P<0.01)。這個結果與mRNA的結果一致。

圖3 不同濃度吡蟲啉(a)和啶蟲脒(b)對細胞內nAChR α7亞基mRNA含量的影響注：*表示P<0.05，與溶劑對照相比。Fig. 3 Effects of imidacloprid (a) and acetamiprid (b) at different concentrations on the content of nAChR α7 subunit mRNA in cellsNote: *represents P<0.05, compared with the solvent control.

圖4 不同濃度吡蟲啉組細胞內nAChR α7亞基凝膠電泳蛋白質條帶圖(a)和含量(b)注：***表示P<0.001，與溶劑對照相比。Fig. 4 Protein band diagram (a) and content (b) of nAChR α7 subunit gel electrophoresis in cells under exposure to different concentrations of imidaclopridNote: ***represents P<0.001, compared with the solvent control.

圖5 不同濃度啶蟲脒組細胞內nAChR α7亞基凝膠電泳蛋白質條帶圖(a)和含量(b)注：**表示P<0.01，與溶劑對照相比。Fig. 5 Protein band diagram (a) and content (b) of nAChR α7 subunit gel electrophoresis in cells under exposure to different concentrations of acetamipridNote: **represents P<0.01, compared with the solvent control.

2.3 吡蟲啉和啶蟲咪暴露對SK-N-SH細胞乙酰膽堿酯酶活性的影響

SK-N-SH細胞在溶劑對照和3個濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)吡蟲啉和啶蟲咪培養液中暴露24 h后AChE活性的比較如圖6所示。與溶劑對照組相比，0.1 mmol·L-1和1 mmol·L-1吡蟲啉暴露組中AChE活性顯著降低(P<0.01)，0.01 mmol·L-1吡蟲啉暴露組中AChE活性也降低，但沒有統計學上的顯著性差異(P>0.05)，3個濃度啶蟲脒暴露組中AChE活性無明顯變化(P>0.05)。

2.4 吡蟲啉和啶蟲咪暴露對SK-N-SH細胞氧化應激的影響

SK-N-SH細胞在溶劑對照和3個濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)吡蟲啉和啶蟲咪培養液中暴露24 h后GSSG/GSH的比較如圖7所示。與溶劑對照組相比，1 mmol·L-1吡蟲啉暴露組中GSSG/GSH顯著上升(P<0.05)，0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1吡蟲啉暴露組中GSSG/GSH有明顯上升，但沒有統計學上的顯著性差異(P>0.05)，3個濃度啶蟲脒暴露組中GSSG/GSH也有上升，但沒有統計學上的顯著性差異(P>0.05)。

2.5 吡蟲啉暴露對SK-N-SH細胞轉錄組的影響

以上研究結果顯示，在相同暴露條件下，吡蟲啉對細胞的影響大于啶蟲脒。為進一步揭示吡蟲啉的影響，取0.1 mmol·L-1吡蟲啉暴露組和溶劑對照組進行了轉錄組測序，并與已有的數據庫比對，確定表達變化基因的功能。與對照組相比，0.1 mmol·L-1吡蟲啉暴露組出現了很多有顯著表達差異的基因，其中一些主要富集在神經退行性疾病如亨廷頓病、帕金森病和阿爾茲海默病等相關通路，如圖8所示。

圖6 不同濃度吡蟲啉(a)和啶蟲脒(b)對細胞內乙酰膽堿酯酶(AChE)相對活性的影響注：**表示P<0.01，與溶劑對照相比。Fig. 6 Effects of imidacloprid (a) and acetamiprid (b) at different concentrations on the relative activity of acetylcholinesterase (AChE) in cellsNote: **represents P<0.01, compared with the solvent control.

圖7 不同濃度吡蟲啉(a)和啶蟲脒(b)對細胞內氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)的影響注：*表示P<0.05，與溶劑對照相比。Fig. 7 Effects of imidacloprid (a) and acetamiprid (b) at different concentrations on intracellular oxidized glutathione/reduced glutathione (GSSG/GSH)Note: *represents P<0.05, compared with the solvent control.

3 討論(Discussion)

吡蟲啉和啶蟲咪都屬于第一代新煙堿類殺蟲劑(氯代煙堿型)，但部分結構不同。吡蟲啉屬于N-硝基胍類，而啶蟲咪屬于氰基脒類，這使得兩者與nAChR的結合能力不同，因而毒性也不同。在細胞活力測試中，吡蟲啉和啶蟲咪對SK-N-SH細胞的IC10分別約為1.5 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1(暴露24 h)，這表明吡蟲啉對SK-N-SH細胞活力的抑制大于啶蟲咪。新煙堿類殺蟲劑的主要作用靶點為nAChR，即殺蟲劑中的藥效基團與nAChRs的氨基酸殘基相互作用[17]。在脊椎動物中，目前已經識別出17種不同的nAChRs亞基(α1～α10、β1～β4、γ、δ、ε)，除α8外，其余亞基在人類中都存在，這些亞基的多種組合方式構成了nAChRs功能的多樣性[24-25]。nAChRα7是中樞神經系統中分布最多的一種nAChRs亞型，與大腦的學習、記憶以及感覺門控等認知功能有關。nAChRs通過結合突觸前膜釋放的神經遞質乙酰膽堿，對Na+、K+和Ca2+的通透性增強[12]，從而使電信號在細胞之間傳遞。突觸間的AChE可以降解乙酰膽堿，終止乙酰膽堿對突觸后膜的興奮作用，維持正常的神經傳導活動。此外，AChE還參與細胞的發育和成熟，能促進神經元發育和神經再生。本研究中，暴露于1 mmol·L-1的吡蟲啉或啶蟲咪24 h均使SK-N-SH細胞內nAchRα7亞基的蛋白表達顯著上升，這可能是吡蟲啉和啶蟲咪與nAchRα7結合后細胞為應對乙酰膽堿結合位點減少而產生的一種補償機制。0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1的吡蟲啉或啶蟲咪與nAchRα7亞基的結合較少，因而對nAchRα7亞基的蛋白表達影響不明顯。0.1 mmol·L-1和1 mmol·L-1吡蟲啉對SK-N-SH細胞內AChE活性有顯著的抑制效應，這與有機磷的作用類似[26]，表明吡蟲啉可能會與AChE結合，抑制其活性，或通過其他方式抑制AchE活性。3個濃度(0.01、0.1和1 mmol·L-1)啶蟲咪對AchE活性均無影響，表明啶蟲咪與AChE不會結合。吡蟲啉和啶蟲咪對AChE活性影響的不一致，與2種殺蟲劑的藥效基團不同有關。

圖8 與溶劑對照相比，0.1 mmol·L-1吡蟲啉暴露組顯著差異基因富集通路Fig. 8 Compared with solvent control, enrichment pathways of significantly different genes in 0.1 mmol·L-1 imidacloprid exposure group

氧化還原態平衡是機體內環境穩定的基本內涵之一，它可以影響到基因的轉錄、細胞信號的轉導、酶和生物大分子的活性、細胞和器官的功能，以及細胞的增殖、分化、凋亡、壞死等許多生理、病理生理過程。因此，監測細胞的氧化-還原態非常重要[27]。GSH和GSSG是體內的一個氧化還原對，可較好地反映人體內氧化還原狀態。本研究中，不同濃度的吡蟲啉或啶蟲咪均使GSSG/GSH上升，但只有1 mmol·L-1的吡蟲啉使GSSG/GSH顯著上升，其余不顯著。

在轉錄組水平上，0.1 mmol·L-1吡蟲啉暴露可引起上千個基因表達發生變化，包括與神經退行性疾病(亨廷頓舞蹈病、帕金森病和阿爾茨海默病)有關的基因和與酒精性脂肪性肝病及氧化磷酸化有關的基因，這些基因之間聯系十分緊密。除此之外，與泛素蛋白、剪接體、核糖體、RNA轉移有關的基因表達也出現顯著變化，但是這些基因之間聯系不密切。轉錄組結果可為下一步研究指明方向。

綜上所述，吡蟲啉和啶蟲脒作為nAChRs的激動劑，可與乙酰膽堿競爭結合位點。結合了吡蟲啉或啶蟲脒的nAChRs，無法行使其正常功能。細胞為了對抗這種因乙酰膽堿受體效價下降所造成的功能下降，一方面提高nAChRs亞基的表達量以增加未結合殺蟲劑的nAChRs的量，另一方面降低AChE的活性(在吡蟲啉暴露中發現)，提高乙酰膽堿與nAChRs結合的概率。吡蟲啉和啶蟲脒與nAChRs結合后，氧化應激增強，尤其是吡蟲啉。在本研究中，除細胞活力外，其余各指標未觀察到明顯的劑量-效應關系，可能與2種殺蟲劑復雜的致毒機制有關。