代表性二級處理、三級處理和濕地生態修復技術對城鎮污水人源干細胞毒性的削減

宋京洋，李澤昌，楊婧，王思予，池勾劍，崔源源，趙靜，劉薇

大連理工大學環境學院，工業生態與環境工程教育部重點實驗室，大連 116024

污水經處理后回用于農田灌溉、城市景觀補給、洗車和工業用水，甚至被用于飲用水，是應對淡水資源稀缺的重要替代水源。目前，污水處理廠通常以傳統的活性污泥和膜生物反應器等處理技術為基礎，盡管處理后排水的理化參數滿足當地或行業相應的排放標準，但仍殘留低濃度有毒物質或形成毒性產物[1]。例如，Xue等[2]研究發現，現行的污水處理工藝(例如砂濾、混凝、活性炭吸附和消毒)對內毒素的處理效果較低，再生水的回用使內毒素的人體暴露水平升高。此外，某二級處理排水樣品中檢測到了遺傳毒性作用，而進水并未檢測出遺傳毒性，可能在處理過程中形成了遺傳毒物[3]。再生水中殘留的有毒有害污染物可以通過多種暴露途徑直接或間接對人體健康產生有害影響。因此，須對再生水回用進行綜合毒性評估，有利于保障再生水回用的安全性[4]。歐美許多國家已開始推行毒性評估廢水管理法律法規[5]。發光細菌、藻類和魚類等水生生物毒性評估結果無法直接外推至人體健康，基于大鼠小鼠等哺乳動物實驗仍存在種屬差異的問題，同時受倫理學和周期成本等限制。

體外生物毒性測試在復合型污染特征下可敏感、準確地量化環境混合物的綜合生物效應[6]，但目前仍較為缺乏面向人體健康的體外生物毒性模型。本研究選擇人骨髓間充質干細胞(hBMSCs)為體外模型，評估典型二級處理、三級處理和濕地修復技術對污水綜合毒性的削減。人源干細胞是一種前景良好的體外毒理學模型，目前已應用于典型環境污染物的毒性預測、評估和毒性機制解析，但在環境復合污染毒性評估中的應用極為有限。筆者在前期研究中，利用hBMSCs研究地表水的毒性特征，結果表明基于hBMSCs的測試對水體復合污染在分子和細胞水平造成的有害效應具有良好的靈敏性、重現性及人體健康相關性[7-8]。此外，本研究將基于人源干細胞的綜合毒性評價結果與常用的發光菌急性毒性測試進行比較。研究結果有助于更好地了解人源干細胞對水體復合污染的毒性響應特征，為排水的人體健康效應評估以及提升水處理技術的毒性削減效能提供科學依據和參考方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集及前處理

水樣采自大連市、沈陽市和哈爾濱市的4個城鎮二級污水處理廠(A～D)、天津某再生水廠(E)和海口市某濕地公園(F)。采集各廠進水、主要工藝出水和最終出水，以超純水作為流程空白。城鎮二級污水處理廠(A～D)主要工藝均由活性污泥法和紫外消毒工藝組成，且進水主要來源為生活污水混有少量的工業廢水。再生水廠(E)的進水主要來源為多個城鎮二級污水處理廠排水，經混凝、微濾、反滲透和臭氧氧化三級處理工藝再次處理后排放回用。濕地公園(F)的進水主要為生活污水，預處理后經梯級潛流濕地和河流型濕地處理排放。A～F廠最終出水化學需氧量(COD)和氨氮均達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》一級A標準，并回用于城市雜用水、景觀用水和河道補給(圖1)。

采集水樣貯存在塑料桶中，立即運回實驗室。用0.7 μm(Waters, GF/B, 47 mm)玻璃纖維濾膜過濾水樣后，在實驗室進行COD和氨氮理化參數的測定[9]。將水樣進行富集濃縮，采用HLB(6 mL, 500 mg, OASIS, Waters, USA)萃取柱萃取水中有機物，用二氯甲烷和甲醇進行洗脫，將洗脫液經氮吹后用200 μL二甲基亞砜(DMSO)定容[10]。

1.2 發光菌急性毒性實驗

明亮發光桿菌T3小種(PhotobacteriumphosphoreumT3spp)購自浙江清華長三角研究院(浙江，中國)。將1 mL復蘇液注入裝有凍干粉的安瓿瓶中，充分混勻。2 min后在暗室中可肉眼觀察到菌液發光，即復蘇完成。采用3% NaCl(m∶m)稀釋濃縮菌液至合適濃度，作為后續測試菌液。實驗采用3% NaCl作為空白對照，并用3% NaCl稀釋水樣。根據預實驗已確定正式實驗濃度范圍，設定不同梯度濃度的水樣作為實驗組。明亮發光桿菌菌液與水樣充分混勻15 min后，用原子摩爾冷光檢測儀(Lumin Max-C, Maxwell Sensors Inc)測定明亮發光桿菌的發光強度。每個實驗組設置3個平行，重復實驗結果的相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)均<30%。發光菌的發光強度相對抑制率與各工藝出水急性毒性成正比，計算公式如下：

1.3 細胞毒性實驗

人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)購自廣州賽業公司(廣州，中國)。培養條件控制為37 ℃、5% CO2和飽和濕度，細胞復蘇、傳代至6代進行實驗。細胞生長至匯合度達到85%以上時，進行消化接板。含有0.1% DMSO(V∶V)的培養基設為對照組，根據預實驗已確定正式實驗濃度范圍，用含有0.1% DMSO的培養基將水樣萃取物稀釋為不同的濃度梯度作為實驗組。每個濃度設置3個平行，重復實驗結果的RSD均<30%。暴露48 h后吸出暴露液，加入配制的CCK-8工作液，設定僅含有CCK-8工作液的背景空白孔，37 ℃孵育1.5～2 h后，用酶標儀(Spark, Tecan)450 nm波長下測量吸光度，并根據如下公式計算細胞毒性。

圖1 代表性城鎮二級、三級污水處理廠和濕地修復技術處理流程和采樣點分布Fig. 1 Treatment process and sampling points of representative urban secondary and tertiary sewage treatment plants and wetland restoration technique

1.4 數據分析

根據濃度-效應關系計算水樣萃取物對發光菌和hBMSCs產生毒性效應強度分別為20%和50%的濃度即EC20和EC50。由于EC20和EC50的大小與急性毒性效應強弱呈反比，為更直觀地評價2種模型的急性毒性，故采用1/EC20和毒性單位(toxicity unit, TU)來進行比較。根據如下公式計算TU值：

TU=1/EC50

使用SPSS 16.0的單因素分析法進行數據顯著性差異分析。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 城鎮二級、三級污水廠和濕地修復技術排水的發光菌急性毒性

盡管各個工藝水樣在未經富集濃縮條件下(即稀釋度100%)對發光菌沒有產生顯著的急性毒性。進一步將水樣富集濃縮后進行暴露，發光抑制效應呈明顯的劑量依賴性(圖2)。部分水樣的有機萃取物在稀釋度100%(REF1)時對發光菌產生顯著的急性毒性，主要原因可能為水樣中的有機萃取物相對于水中的其他組分毒性更強。4個二級城鎮污水處理廠中，A、B和C最終排水的發光抑制效應較進水均有所減弱，經二級處理工藝后分別削減了88.9%、57.1%和66.7%。但其中經D廠工藝處理后，發光菌的發光抑制作用顯著增強了1倍。這說明盡管大部分二級處理可以有效去除水中毒性物質，但過程中潛在毒性副產物的生成也主要取決于不同的水質特點和處理的工藝條件。與本研究相似，某污水廠排水的生物發光抑制作用在物種敏感度分布模型(SSD)中都超過了影響5%水生生物的危險濃度(HC5)的上限，對水生生物可能造成較高風險[11]。三級城鎮污水處理廠(E)進水經混凝、微濾和反滲透處理后，對發光菌無明顯毒性。但經臭氧消毒后，毒性較反滲透出水增強，但仍略低于進水。比較1/EC20，再生水E廠對于進水的發光菌急性毒性的削減率為66.8%。濕地公園(F)修復技術對進水的發光菌急性毒性削減了45.6%。

2.2 城鎮二級、三級污水廠和濕地修復技術排水對人源干細胞的細胞毒性

城鎮二級、三級污水處理廠和濕地公園進水和各主要工藝出水對hBMSCs產生的細胞毒性呈現明顯的劑量-效應關系(圖2)。4個二級城鎮污水處理廠(A～D)主要采用活性污泥法結合紫外消毒工藝，隨著工藝的深入，細胞毒性顯著降低。大連某污水處理廠A的主要工藝特點為改良A2O工藝結合紫外消毒，A廠各工藝出水的TU分別為0.06、0.03和0.02，出水細胞毒性低于進水。大連某污水處理廠B的主要工藝為序批式活性污泥法(SBR)結合紫外消毒工藝。由B廠各工藝出水的EC50可計算得到進水和出水的TU分別為0.11和0.03，細胞毒性總體削減率為35.0%。哈爾濱某污水處理廠C對細胞毒性的削減率為40.0%。沈陽某污水處理廠D進水和出水的TU分別為0.05和0.02，細胞毒性削減率為60.0%。

天津某再生水廠E的三級處理工藝，主要包括混凝、微濾結合反滲透及臭氧化消毒。經混凝處理后，污水細胞毒性沒有顯著變化，提示混凝對細胞毒物的削減能力較低。經微濾和反滲透單元處理后，污水的細胞毒性逐漸降低，比較1/EC20，微濾的毒性削減率為29.9%。但是經臭氧消毒后，細胞毒性反而升高了10.8%。與發光菌急性毒性測試結果一致，提示可能在臭氧消毒過程中產生了毒性較強的消毒副產物。與本研究結果相似，有文獻報道臭氧消毒處理后，污水對大鼠的急性毒性[12]和細胞遺傳毒性升高[13]。但也有研究與本研究結果不同，加拿大蒙特利爾某污水處理廠的臭氧消毒工藝使雌激素活性降低98.0%以上，雄激素活性去除68.0%以上，而抗雌激素活性保持不變[14]。表明廢水的特性可能會影響臭氧消毒過程中毒性的變化。

海口某濕地公園F的水樣的細胞毒性隨著再生水萃取物濃度的升高而降低。進水的細胞毒性(抑制率)范圍為42.7%～54.0%，出水用于當地景觀湖的生態補給，其細胞毒性為50.4%～84.9%。比較各工藝排水的1/EC20，預處理和人工濕地對水體污染的細胞毒性削減率分別為45.1%和49.4%，總削減率為72.3%。結果表明該生態修復工藝對于二級處理工藝排水中有毒有害物質能夠進一步去除。出水用于湖泊和河流生態補給，有利于提高再生水景觀回用的安全性。

圖2 城鎮二級、三級污水廠和濕地修復技術水樣有機萃取物對發光菌和人骨髓間充質干細胞(hBMSCs) 毒性效應的濃度-效應關系注：REF表示相對富集倍數，NC表示陰性對照；數據代表平均值±樣本標準誤差(SE)，n=3；*P≤0.05、 **P≤0.01、***P≤0.001，與對照組相比。Fig. 2 Concentration-response relationship of the toxicity caused by organic extractions of water samples from urban secondary and tertiary sewage treatment plants and wetland effluents in luminescent bacteria and human stem cellsNote: REF stands for related fold enrichment; NC stands for negative control; data represents mean±SE, n=3; *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001, compared with the control.

2.3 不同處理工藝對污水發光菌毒性和人細胞毒性的削減

采用A～F進出水的TU值或1/EC20計算削減率，對比城鎮二級、三級處理廠和濕地修復技術對發光菌和人源干細胞的綜合毒性去除效果(圖3)。代表性二級處理、三級處理和濕地生態修復技術的對于人源干細胞毒性的削減率分別為59.8%、-10.8%和49.9%，對發光菌急性毒性的削減率分別為74.6%、66.8%和25.0%。二級處理和三級處理技術對污水hBMSCs細胞毒性的削減率低于發光菌急性毒性，但濕地修復技術對細胞毒性的削減率高于發光菌急性毒性。結果提示，濕地修復技術對污水細胞毒性可能具有良好的削減能力。此外，二級處理技術和濕地生態修復技術對于綜合毒性的削減率低于COD和NH3-N的削減率，提示污水中殘留的難降解有機污染物毒性相對較強。

2.4 2種受試生物模型的比較

通過比較水樣萃取物對于發光菌和人源干細胞的毒性效應強度，分析排水綜合毒性評價的物種靈敏度。污水有機萃取物對hBMSCs的毒性高于發光菌，66.7%(14/21)水樣品對于hBMSCs細胞毒性的TU值高于發光菌急性毒性測試結果(圖4)。因此，在檢測排水的毒性效應中，人源干細胞比發光菌更為靈敏。對于反映水處理工藝過程中的毒性削減趨勢，發光菌急性毒性監測測定得到的毒性削減率平均是人源干細胞相應劑量值的1.5倍，這說明污水對發光菌的急性毒性相對較容易削減，而殘留的難降解有機污染物對人源干細胞毒性較強，提示排水中有毒有害污染物對人體健康的潛在危害。此外，還可能和不同測定方法本身的特點及污水處理工藝的實際運行條件有關[15]。

2.5 水體綜合毒性與理化參數的相關性分析

人源干細胞毒性和發光菌毒性的TU和COD、氨氮呈顯著正相關關系(圖5)。Ma等[16]報道，高濃度廢水的COD可能與發光菌毒性存在明顯的相關性，而低濃度廢水的毒性與COD的相關性則不太明顯。Roig等[17]發現，某污水處理廠污水污泥中的總氮與通過水樣萃取物的Microtox?試驗獲得發光菌的EC50值呈顯著負相關，與本研究結果相一致。但對比實驗結果測定的2種受試生物的1/EC20,發現一般毒性結果與COD、氨氮的結果無相關關系，說明低效應濃度/無效應濃度與理化指標無明顯相關性。已有研究結果表明理化參數的降低并不等同于毒性的削減。應結合毒性實驗作為水質理化指標監測的重要補充[18]，對于保障再生水水質安全具有重要意義。

傳統的水處理方法無法有效去除微量污染物[19]。盡管系統中半揮發性有機物(SVOC)的總濃度在μg·L-1或更低水平，但它們對人體的負面影響日益引起人們的關注。人源干細胞和發光菌的TU值與城鎮二級、三級中檢測到的SVOC組分濃度進行相關性分析，結果表明，hBMSCs的TU值與各工藝排水中SVOC的總濃度呈顯著正相關關系(P≤0.01，r=0.45)。單獨分析城鎮二級和三級的TU與各自的理化參數和SVOC總濃度相關性，毒性指標均與SVOC總濃度呈現顯著正相關關系。再一次提示污水中殘留的有機污染物會產生較強的細胞毒性。盡管污水中有機微污染物的濃度水平遠遠低于其效應濃度，但大量不同的污染物之間可能會通過聯合作用產生有害影響[20]。

圖3 不同處理工藝對發光菌和人源干細胞毒性的削減效果注：a城鎮二級污水處理廠(A、B、C)削減率均值； b毒性指標采用“1/EC20”進行削減率計算；COD表示化學需氧量； SVOC表示半揮發性有機物；ND表示由于濕地 水樣未進行SVOC濃度測定，所以無SVOC削減率結果。Fig. 3 Removal of toxicity on luminescent bacteria and human stem cells by different treatment processesNote: a indicates average reduction of urban secondary sewage treatment plants (A, B, C); b indicates “1/EC20” is used to calculate the reduction; COD stands for chemical oxygen demand; SVOC stands for semi-volatile organic compounds; ND stands for no SVOC reduction of wetland effluents due to the lack of SVOC concentration measurement.

圖4 不同處理工藝排水對hBMSCs和發光菌綜合 毒性的毒性單位(TU)值的比較注：ND表示未檢測出。Fig. 4 Comparison of toxicity unit (TU) for integrate toxicity evaluation of effluent from different treatment processes in luminescent bacteria and human stem cellsNote: ND represents not detected.

圖5 污水TU、理化參數及SVOC總濃度相關性分析注：a城鎮二級、三級處理工藝排水中SVOC總濃度；*P≤0.05、**P≤0.01、***P≤0.001，與對照組相比。Fig. 5 Correlation analysis of sewage TU, physico-chemical parameters and total concentration of SVOCNote: a means total SVOC concentration of urban secondary and tertiary sewage treatment plants; *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001, compared with the control.

城鎮污水再生回用是解決淡水資源危機和水資源污染的重要措施，但再生水中殘留的有毒有害污染物在其回用過程中對生態系統和人體健康造成潛在威脅。本研究利用人源干細胞測試典型污水處理技術對污水綜合毒性的削減效果，結果提示污水處理廠排水中殘留的難降解有機污染物對人源干細胞具有較強的有害效應，細胞毒性強于發光菌急性毒性，二級處理技術對細胞毒性的削減率為74.6%，低于COD和NH3-N的去除率，三級處理過程中經混凝、微濾和反滲透處理后，出水無顯著細胞毒性，但經臭氧消毒后最終排水的細胞毒性較進水無顯著變化，提示人源干細胞對于消毒副產物形成較為敏感。此外，濕地修復技術對污水細胞毒性削減率為49.4%，對污水綜合毒性的削減可能具有良好的前景。初步研究結果表明人骨髓間充質干細胞對水體污染物毒性響應較靈敏，應進一步研究排水對干細胞分化潛能的影響。干細胞的增殖和分化與個體發育密切相關，適于篩查污染物的發育毒性，而發育毒性正是消毒副產物等水體污染物的重要健康危害之一。研究結果為再生水水質安全性評價以及城鎮污水資源化技術研發提供參考依據和方法。需要指出的是，本研究所選取的污水處理項目較為有限，毒性指標限于一般毒性，仍需面向更大范圍的污水處理廠進行包括遺傳毒性和發育毒性等敏感指標的毒性評估。