氟蟲腈對意大利蜜蜂工蜂幼蟲及幼齡工蜂的亞致死效應

李佳歡，齊素貞，吳黎明，黃少康,*

1. 福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)，福州 350000 2. 中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093

蜜蜂(Apis)是一種對農業(yè)生產十分重要的授粉昆蟲[1-2]，同時蜜蜂生產的蜂蜜、蜂花粉、蜂王漿和蜂膠等蜂產品均是具有很高營養(yǎng)價值的綠色保健食品[3]。隨著全球污染的日益加重，蜜蜂也遭受著環(huán)境污染帶來的生存壓力以及多種病蟲害的侵襲，由此引發(fā)的蜂群崩潰綜合癥(Colony Collapse Disorder)在全球范圍內引起了廣泛關注[4-6]。在眾多影響蜜蜂健康的因素中，殺蟲劑的使用一直具有很大的爭議。殺蟲劑是重要的農業(yè)生產物質，是現(xiàn)代農業(yè)生產不可缺少的重要組成。自19世紀70年代以來，有機合成農藥的迅速發(fā)展使得農藥的種類和性質都發(fā)生了翻天覆地的變化，大量廣泛施用農藥造成了環(huán)境殘留的問題，且有些藥劑會污染植物的花粉和花蜜，導致蜜蜂暴露風險的增加[7]。

氟蟲腈(fipronil)是苯基吡唑類的代表性殺蟲劑，化學名稱為5-氨基-1-(2,6-二氯-4,4,4-三氟甲基苯基)-4-三氟甲基亞硫酰基吡唑-3-腈。氟蟲腈在水體和土壤中降解緩慢，半衰期較長[8]，極易在環(huán)境及作物中蓄積[9]。鑒于氟蟲腈的殘留和環(huán)境風險，歐盟規(guī)定氟蟲腈不得用于人類食品產業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖，我國亦規(guī)定其在蔬菜中的最大殘留限量(MRL)為0.02 mg·kg-1[10]，且自2009年10月1日起，除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外全面限制使用氟蟲腈[11]。雖然氟蟲腈的使用量大幅降低，但近幾年我國多地土壤及蔬菜中氟蟲腈檢出率依然較高(違禁農藥不合格率中氟蟲腈占比14.97%)[12]，如重慶近郊農用地的部分普通白菜中氟蟲腈的殘留量達1.312 mg·kg-1[13]，華南某市部分蔬菜基地土壤中氟蟲腈的殘留量最高可達33.09 mg·kg-1[14]。

氟蟲腈以昆蟲γ-氨基丁酸(GABA)受體為作用靶點，通過與GABA受體非競爭性結合，可以干擾受體門控氯離子通道，導致昆蟲神經和肌肉過度興奮而死亡[15]。由于這一特殊的作用機制，氟蟲腈對甲殼類水生生物和蜜蜂具有極高風險。據(jù)報道，氟蟲腈對蜜蜂劇毒，其對蜜蜂的急性經口半數(shù)致死劑量(LD50)為0.00383 μg·蜂-1[16]，這種高致死作用可能是導致法國20世紀90年代蜜蜂大量死亡的重要原因[17]。除較高的急性致死毒性外，亞致死劑量的氟蟲腈亦可顯著影響蜜蜂的健康。研究發(fā)現(xiàn)8 μg·L-1的氟蟲腈會引起工蜂癲癇、震顫和麻痹，運動能力下降，雄蜂生育能力下降[18-19]；2.5 μg·L-1的氟蟲腈還可影響蜜蜂咽下腺的形態(tài)以及蜜蜂腸道菌群多樣性[20-21]。這些作用劑量低于環(huán)境中氟蟲腈的殘留水平，因此，環(huán)境殘留水平上氟蟲腈對蜜蜂的風險不容忽視。

蜜蜂是一種敏感的生物指示物，其不同發(fā)育階段對污染物的響應可能不同，目前關于氟蟲腈對蜜蜂幼蟲和幼齡工蜂的毒性作用研究還很缺乏。因此，本研究以意大利蜜蜂幼蟲和新出房成年工蜂為研究對象，采用人工飼喂的方法研究了亞致死劑量下氟蟲腈對蜜蜂幼蟲及工蜂的慢性毒性。結果發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈可顯著干擾蜜蜂幼蟲的發(fā)育，幼蟲化蛹率顯著降低、死亡率顯著增高(P<0.05)；幼齡工蜂對氟蟲腈的耐受濃度相對較高，暴露7 d時各處理組中死亡率均較低(<20%)，但當暴露時間延長至14 d時，高濃度(10 μg·L-1)處理組中蜜蜂死亡率高達(65.0±17.7)%，這說明氟蟲腈對幼齡工蜂具有一定的時間累積毒性(time reinforced toxicity, TRT)效應。此外，本文還檢測了整只幼蟲及7 d、14 d時幼齡工蜂的頭腹部組織的氧化應激酶超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)、解毒酶谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)及乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的變化，結果表明在本研究條件下，氟蟲腈在低暴露劑量下即可顯著干擾蜜蜂幼蟲和成蜂機體穩(wěn)態(tài)，引發(fā)顯著的氧化損傷和神經毒性。本研究一方面補充了亞致死劑量下氟蟲腈對蜜蜂幼蟲和成蜂風險評估數(shù)據(jù)的不足，另一方面可為未來指導氟蟲腈的安全使用和管理制定提供參考。此外，本研究也揭示了蜜蜂不同發(fā)育階段對農藥的敏感性差異，未來可為不同作用機理、不同施用方式的農藥或環(huán)境污染物制定特異的風險評估模型，提高風險評估工作的精準化。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試生物與試劑

意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)由中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所蜂場提供。氟蟲腈原藥(97%純度)購自海利爾藥業(yè)集團股份有限公司，色譜純級丙酮購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，葡萄糖和果糖購自上海玉博生物科技有限公司，酵母提取物購自英國OXOID公司，水為娃哈哈純凈水，121 ℃濕熱滅菌后使用；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(P006)購自上海碧云天生物技術有限公司；酶活力測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 氟蟲腈暴露濃度的設置

據(jù)文獻報道，氟蟲腈對意大利蜜蜂的48 h-LD50為0.00383 μg·蜂-1。結合預實驗結果，本研究中蜜蜂幼蟲的氟蟲腈暴露濃度為10-3、10-2、0.1、1和10 μg·L-1；成蜂的暴露濃度為1、5和10 μg·L-1。

藥液配制：以丙酮為溶劑，配制濃度為1 000 mg·L-1的氟蟲腈儲備液。以蜜蜂幼蟲人工配方飼料為稀釋劑，配制含氟蟲腈濃度為10-3、10-2、0.1、1和10 μg·L-1的幼蟲試驗飼料；以50%蔗糖溶液為稀釋溶劑，配制氟蟲腈濃度分別為1、5和10 μg·L-1成蜂試驗藥液；以不含丙酮和不含氟蟲腈的幼蟲飼料或50%蔗糖溶液為空白對照。

1.3 蜜蜂幼蟲的暴露與培養(yǎng)

幼蟲暴露處理參照經濟合作與發(fā)展組織(OECD)頒布的OECD 237準則、中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準(NY/T 3085—2017)和本實驗室已發(fā)表的方法進行[22-23]。簡言之試驗開始3 d前，將隔王板放入實驗蜂群，并在隔王板間放入一張空蜂脾，隨后將蜂王移入并限制其在空脾上產卵12 h；控王產卵結束后，將蜂王移出，隔王板和卵脾保持在蜂箱內待卵孵化。3 d后，蜂卵孵化為1日齡(d)幼蟲，實驗開始。將1 d幼蟲轉移至預先準備好的每孔含20 μL人工飼料的48孔板中，并在人工培養(yǎng)箱中(35 ℃±1 ℃，相對濕度95%)培養(yǎng)，2 d時不飼喂，3 d時剔除死亡幼蟲，將同批次備用健康幼蟲補入并飼喂20 μL含氟蟲腈的飼料；隨后在第4、5和6天時分別飼喂每只幼蟲30、40和50 μL含氟蟲腈的幼蟲飼料。實驗設置3個蜂群，每16只幼蟲來自一個蜂群，設為一個重復，每個暴露濃度設置3個重復，共計48只幼蟲。

在飼喂期間每天記錄幼蟲死亡數(shù)，以移蟲針輕觸幼蟲，幼蟲不動則認為死亡。試驗開始后的第7天，停止飼喂，第8天時將其轉移至24孔板中化蛹，每天檢查蛹的死亡和發(fā)育情況，更換無菌紙，保證潔凈化蛹環(huán)境，統(tǒng)計幼蟲最終的化蛹率和羽化率。重復此實驗，在第8天時收集幼蟲樣本，經pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液潤洗擦干后，-80 ℃冷凍保存待后續(xù)生化指標分析。

1.4 新出房工蜂的暴露與培養(yǎng)

暴露開始前，將蜂群中待出房的封蓋子脾轉移至人工培養(yǎng)箱中(35 ℃±1 ℃，相對濕度50%)羽化。工蜂出房后24 h內，將其轉移至貯蜂籠內。每籠20只幼齡工蜂，饑餓2 h后飼喂50%蔗糖溶液(空白對照)或含不同濃度的氟蟲腈試驗藥液(處理組)。飼喂劑量為1 mL·籠-1·天-1，每天更換試驗藥液并觀察記錄蜜蜂死亡情況。每籠為一個重復，每個試驗濃度設置3個重復。新出房工蜂設置2個時間處理，一組飼喂7 d后收集每籠中的蜜蜂頭部(整只頭)和腹部(整只腹部)組織，一組飼喂14 d后收集，樣品-80 ℃冷凍保存待后續(xù)分析。

1.5 酶活力的檢測

蜜蜂組織粗酶液的制備和生化指標檢測參照各試劑盒說明書進行。首先準確稱取蜜蜂組織樣品質量，按試劑盒要求加入與質量相對應體積的樣品提取液或生理鹽水，然后置于冰上研磨，破碎勻漿后4500 r·min-1離心10 min，取上清液轉移至新的離心管中。采用Bradford蛋白測定試劑盒制備蛋白標準溶液，酶標儀(Spectra Max i3，美谷分子儀器(上海)有限公司，中國)測定蛋白標準溶液和樣品吸收值，繪制蛋白濃度標準曲線并計算樣品蛋白濃度；隨后根據(jù)各試劑盒方法測定目標酶活力或產物的含量變化。具體方法可參考本實驗室已發(fā)表的文章[24]。每個濃度組3個樣品處理，每個樣品重復測定3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各檢測指標結果均以平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用Graphpad prism 7.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，結合Tukey’s HSD檢驗比較處理組與對照組之間的顯著性差異，各處理組間生存曲線的顯著性差異分析采用Graphpad prism 7.0軟件中l(wèi)og-rank(Mantel-Cox)test模型進行。文中*表示P<0.05，**表示P<0.01，差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 氟蟲腈對蜜蜂幼蟲發(fā)育的影響

氟蟲腈可顯著影響蜜蜂幼蟲的發(fā)育和死亡。空白對照組中幼蟲的平均死亡率為(22.92±2.95)%，略高于OECD 237準則的要求，但根據(jù)文獻報道，當觀測化合物效應濃度范圍時，蜜蜂幼蟲人工飼養(yǎng)對照死亡率可適當放寬至20%～25%，故本研究中的幼蟲實驗仍在可接受范圍內[25-26]。由圖1(a)可知，氟蟲腈可顯著增加幼蟲的死亡率，在設定的10-3、10-2、0.1、1和10 μg·L-1處理組中，幼蟲的死亡率比對照組顯著增加22.92%～47.92%(P<0.05)，但在蛹期階段氟蟲腈處理組中的死亡率與對照組無顯著差異。幼蟲死亡率的增高導致其化蛹率和羽化率顯著降低，且與對照組差異顯著(P<0.05)(圖1(b))。

圖1 氟蟲腈對蜜蜂幼蟲死亡(a)和發(fā)育(b)的影響注：(a)圖中灰色部分為幼蟲死亡率，白色部分為蛹期死亡率，每個柱形圖代表幼蟲和蛹期的死亡率累積之和，其中*代表對照組 與處理組之間幼蟲死亡率差異顯著；字母a、b代表對照組與處理組之間幼蟲和蛹的總死亡率之和差異顯著； 對照組與處理組之間蛹期死亡率差異不顯著，未標記。Fig. 1 Effect of fipronil on death (a) and development (b) of honeybee larvaeNote: In Figure (a), the gray part is the larvae mortality rate, while the white part is the pupal mortality rate; each column represents the cumulative sum of the larvae and pupal mortality rates, in which *represents the significant difference in the larvae mortality rate between the control group and the treatment group; the letters a and b represent the significant difference in the sum of the total mortality of larvae and pupae between the control group and the treatment groups; there was no significant difference in pupa stage mortality between the control group and the treatment groups.

2.2 氟蟲腈對蜜蜂幼蟲酶活力的影響

亞致死劑量的氟蟲腈可顯著誘導蜜蜂幼蟲體內的氧化應激反應。由圖2可知，氟蟲腈各處理組中的SOD酶活力與對照組相比無顯著差異，而CAT酶活力則顯著高于對照組(202.49±8.95) U·g-1protein (P<0.05)，且隨氟蟲腈暴露濃度增加而增加(圖2(b))。丙二醛(MDA)是脂質過氧化反應的終端產物，在空白對照組中其含量為(0.47±0.08) nmol·mg-1protein，在10-3μg·L-1氟蟲腈暴露組中，MDA含量顯著下降至0.1 nmol·mg-1protein(P<0.0001)，而在0.1 μg·L-1和1 μg·L-1處理組中其含量顯著升高至0.79 nmol·mg-1protein和0.95 nmol·mg-1protein，與對照組相比差異顯著(P<0.01) (圖2(c))。

GSH含量變化(圖2(d))與CAT變化相似，在低濃度10-3μg·L-1和10-2μg·L-1處理組中，GSH含量與對照組(84.97±2.83) μmol·g-1protein相比無顯著差異，但在0.1 μg·L-1和1 μg·L-1組中GSH含量顯著升高，最高含量為(150.00±6.75) μmol·g-1protein(P<0.0001)。GST酶活力變化與其他指標變化不同，所有氟蟲腈處理組中的GST酶活力均顯著低于對照組(69.95±1.82) U·mg-1protein (P<0.01)，但各個處理組間的GST酶活力維持在相近水平(圖2(e))。

圖2 氟蟲腈對蜜蜂幼蟲酶活力的影響注：SOD表示超氧化物歧化酶，CAT表示過氧化氫酶，MDA表示丙二醛，GSH表示谷胱甘肽，GST表示谷胱甘肽轉移酶， AChE表示乙酰膽堿酯酶；*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比。Fig. 2 Effects of fipronil on enzyme activities in bee larvaeNote: SOD means superoxide dismutase; CAT means catalase; MDA means malondialdehyde; GSH means glutathione; GST means glutathione transferase; AChE means acetylcholinesterase; *indicates P<0.05, **indicates P<0.05, compared with the control.

對照組中蜜蜂幼蟲的AChE活力為(0.09±0.01) U·mg-1protein，經氟蟲腈暴露8 d后，AChE活力在10-3μg·L-1和1 μg·L-1組中顯著下降61.4%和58.7% (P<0.01)，在10-2μg·L-1組中變化不顯著，但在0.1 μg·L-1處理組中比對照組升高1.6倍(P=0.0122)。

2.3 氟蟲腈對幼齡工蜂的影響

氟蟲腈對幼齡工蜂生存的影響結果如圖3所示。在暴露期間，對照組蜜蜂在7 d和14 d時的累積死亡率均<10%，滿足化合物對蜜蜂毒性測定的要求。氟蟲腈處理組中，暴露7 d時，1 μg·L-1和5 μg·L-1處理組中的死亡率<10%，10 μg·L-1處理組中的死亡率<20%；1 μg·L-1和5 μg·L-1處理組中幼齡工蜂的死亡率有所增加，但仍<20%，而10 μg·L-1處理組中幼齡工蜂的死亡率顯著增至(65.0±17.7)%，與處理組相比差異顯著(P<0.0001)。

圖3 氟蟲腈對幼齡工蜂存活率的影響注：**表示P<0.01,與對照組相比。Fig. 3 Effect of fipronil on the survival rate of young adult beesNote:**indicates P<0.01, compared with the control.

與幼蟲相似，SOD對氟蟲腈反應不敏感，氟蟲腈暴露7 d和14 d后，幼齡工蜂腹部SOD活力與對照組相比無顯著變化(圖4(a))。CAT酶活力(圖4(b))在暴露7 d時變化趨勢不固定，相比于對照組(110.13±8.96) U·g-1protein，在1 μg·L-1處理組中CAT活力顯著上升至(132.80±4.27) U·g-1protein(P=0.0125)，但在5 μg·L-1處理組中CAT酶活力顯著下降至(85.37±8.42) U·g-1protein(P=0.0077)，而10 μg·L-1處理組中的CAT活力為(118.80±6.28) U·g-1protein，與對照組相比差異不顯著。當暴露時間持續(xù)到14 d時，對照組中CAT酶活力為(93.00±6.40) U·g-1protein，而氟蟲腈各處理組中的CAT酶活力則隨暴露濃度的增加顯著下降了17.6%、12.2%和87.2%(P<0.05)。

GST活力在7 d和14 d的對照組中分別為(76.68±1.78) U·mg-1protein和(92.09±8.29) U·mg-1protein，在氟蟲腈暴露期間，各處理組中的GST酶活力均低于對照水平(圖4(c))。GSH含量在暴露7 d時無顯著變化；在暴露14 d時則呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，1 μg·L-1與10 μg·L-1處理組中GSH含量分別為(47.41±4.66) μmol·g-1protein、(41.73±3.42) μmol·g-1protein，與對照組相比(62.82±2.69) μmol·g-1protein分別顯著降低了32.5%、50.5%(P<0.05)(圖4(d))。

氟蟲腈暴露7 d和14 d時，成蜂腹部MDA含量在低濃度處理組(1 μg·L-1和5 μg·L-1)中變化均不顯著。在高濃度10 μg·L-1處理組中，MDA含量在7 d時為(1.33±0.17) nmol·mg-1protein，顯著低于對照組(1.91±0.15) nmol·mg-1protein，降低了30.4%(P=0.0073)；14 d時，MDA含量為(2.87±0.30) nmol·mg-1protein，相比對照組MDA含量(2.07±0.22) nmol·mg-1protein，顯著升高了38.4%(P=0.0113)(圖4(e))。

3 討論(Discussion)

蜜蜂是非常重要的授粉昆蟲，在農業(yè)生產和生態(tài)環(huán)境安全中發(fā)揮著重要作用，蜜蜂的減少會嚴重影響各種作物的產量和生態(tài)多樣性，因此對包含農藥在內的多種環(huán)境污染物進行全面的風險評價不僅可以預防其對蜜蜂造成較大的損害，更可以為農藥的使用、污染物的治理等提供參考和依據(jù)[27]。

3.1 亞致死劑量氟蟲腈對蜜蜂存在生存風險

氟蟲腈與新煙堿類殺蟲劑具有相似的化學結構、作用機制和毒性作用，在2015年時，二者銷售份額占全球殺蟲劑市場的1/3[28]。氟蟲腈對蜜蜂的生存風險已多有報道，Holder等[17]通過室內生物測定結合蜂群模擬實驗發(fā)現(xiàn)氟蟲腈可以導致蜜蜂大量死亡，且具有TRT效應，相比于吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑，氟蟲腈對蜜蜂的風險更高，導致蜂群死亡的可能性更大。本研究中發(fā)現(xiàn)在10 μg·L-1劑量下，氟蟲腈暴露7 d不會引發(fā)顯著的蜜蜂死亡，但當暴露時間延長至14 d時，蜜蜂死亡率顯著增加，這也在一定程度上證明了氟蟲腈的TRT效應。氟蟲腈所引發(fā)的蜜蜂高死亡率與其作用機理密切相關。氟蟲腈作用于GABA受體，可影響昆蟲大腦的重要結構，Jacob等[29]利用光學顯微鏡和透射電鏡觀察了不同劑量氟蟲腈對無刺蜂(Scaptotrigonapostica)原腦蘑菇體肯氏細胞(Kenyon cells)形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)經口攝入劑量低至0.24 ng a.i.·μL-1、局部接觸劑量低至0.27 ng a.i.·bee-1時均可觀察到固縮肯氏細胞(細胞凋亡)數(shù)量的增加，說明氟蟲腈可激發(fā)顯著的神經細胞損傷。氟蟲腈對蜜蜂繁殖和行為的影響是導致蜜蜂死亡的另一重要因素。El Hassani等[30]在室內條件下評估了亞致死劑量氟蟲腈對蜜蜂行為的影響，發(fā)現(xiàn)1 ng·蜂-1的劑量處理1 h后即可顯著降低蜜蜂的蔗糖敏感性，0.5 ng·蜂-1的劑量則可干擾蜜蜂的嗅覺記憶。Kairo等[31]研究發(fā)現(xiàn)0.1 μg·L-1氟蟲腈可以影響蜜蜂雄蜂的生育能力，降低蜂王的繁殖力，影響下一代蜂卵的質量和發(fā)育。Zaluski等[18]發(fā)現(xiàn)致死或亞致死劑量的氟蟲腈可導致蜜蜂運動行為顯著減少，且當蜂群暴露于氟蟲腈時，孵化卵的數(shù)量、工蜂卵所占的面積以及發(fā)育的幼蟲和蛹的數(shù)量都有降低，這也證明了氟蟲腈對蜜蜂幼蟲的高風險性。Silva Cruz等[32]觀察了氟蟲腈處理下蜜蜂幼蟲腸道形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)氟蟲腈處理組中大多數(shù)的幼蟲會出現(xiàn)中腸細胞質中的空泡消失，染色質壓實的現(xiàn)象。目前關于氟蟲腈對蜜蜂幼蟲的直接毒性評價還很少，本研究發(fā)現(xiàn)亞致死劑量的氟蟲腈對蜜蜂幼蟲存在較高的生存風險，其可顯著降低幼蟲化蛹率和羽化率，導致發(fā)育失敗。

圖4 氟蟲腈暴露后幼齡工蜂腹部組織酶活力變化注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比。Fig. 4 Enzyme activity changes in abdomen of the young adult bees after exposure to fipronilNote:*indicates P<0.05, **indicates P<0.01, compared with the control.

綜合文獻報道和本研究中的結果可知，氟蟲腈在μg或ng水平即可引發(fā)顯著的蜜蜂生存風險，而據(jù)報道，氟蟲腈在水稻田地表水中的檢出濃度不低于9 μg·L-1，在居民區(qū)地表水中的檢出濃度則高達12.6 μg·L-1[33-34]。在巴西，農藥的使用量和蜂群損失量一直居高不下，Castilhos等[35]隨機采集并測定了中毒非洲化蜜蜂體內的氟蟲腈和新煙堿類殺蟲劑的殘留情況，發(fā)現(xiàn)氟蟲腈的檢出率高達為55.3%，檢出劑量為0.7～23 ng·g-1蜜蜂，最高可達539.7 ng·g-1蜜蜂。這些都說明環(huán)境中殘留氟蟲腈對蜜蜂仍存在很高風險，結合文獻和本文中的研究結果，氟蟲腈對蜜蜂的安全性低，在亞致死劑量下即可顯著干擾蜜蜂幼蟲發(fā)育和成蜂生存，因此在很長一段時間內都不應忽視氟蟲腈殘留對蜜蜂的風險。

3.2 亞致死量氟蟲腈誘導蜜蜂氧化脅迫

氧化脅迫是生物體對抗外源脅迫時產生的一種常見反應，在維持生物體體內穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[36]。Wang等[37]對氟蟲腈引起的氧化損傷和代謝機理進行了詳細的綜述，整理發(fā)現(xiàn)氟蟲腈在多種生物體內/體外均可引起的顯著的氧化壓力，增加活性氧自由基(ROS)或活性氮自由基(RNS)的生成、引發(fā)線粒體損傷，干擾ERK、JNK和AKT等代謝通路，導致更嚴重的DNA、脂質和蛋白等大分子的過氧化和損傷。本研究中，蜜蜂幼蟲和幼齡工蜂體內SOD和CAT酶活力、MDA含量發(fā)生顯著變化，說明亞致死劑量氟蟲腈可誘導蜜蜂氧化應激反應。但是SOD在蜜蜂幼蟲和成蜂中的變化均不顯著，這說明SOD對氟蟲腈引發(fā)的氧化壓力不敏感，可能不是監(jiān)測氟蟲腈氧化脅迫的靈敏指標。

值得注意的是，蜜蜂幼蟲或成蜂體內各酶活力或產物含量變化與氟蟲腈暴露時間/劑量的效應關系并不十分明確，如在成蜂暴露體系中，CAT酶活力在暴露7 d時整體呈現(xiàn)上升趨勢而14 d則呈下降趨勢；MDA含量在低濃度時無顯著變化，但在高濃度10 μg·L-1處理組中，暴露7 d時MDA含量顯著低于對照組，而14 d時顯著高于對照組。這可能與蜜蜂對外界脅迫的時間適應機制相關。Chakrabarti等[38]發(fā)現(xiàn)氟吡呋喃酮可顯著增加蜜蜂體內ROS/RNS的濃度，但蜜蜂暴露10 d時體內ROS/RNS濃度顯著低于暴露6 h時的濃度水平，說明蜜蜂在長期接觸外源毒性物質時可自發(fā)調節(jié)自身生理反應，緩解其帶來的危害，但對于毒性較高的化合物或當暴露時間足夠長時，蜜蜂的這種適應機制仍然不能達到保護自身的目的。Mulvey和Cresswell[39]研究了吡蟲啉、噻蟲嗪和氟蟲腈對熊蜂的時間依賴毒性，發(fā)現(xiàn)氟蟲腈不易被降解、排出體外，對熊峰的生存具有顯著的劑量效應關系和很強的TRT效應，噻蟲嗪與氟蟲腈作用相似但TRT效應中等，而吡蟲啉僅在最高濃度處理組中出現(xiàn)死亡和TRT效應。Simon-Delso等[40]亦發(fā)現(xiàn)了啶酰菌胺對蜜蜂的TRT效應，推測這可能是由于蜜蜂長期接觸毒性物質，導致體質變弱，降低了處理有毒物質的能力。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)氟氯苯氰菊酯暴露對蜜蜂也具有相似的時間效應[41]，因此建議未來應加強對環(huán)境濃度下農藥或其他環(huán)境污染物對蜜蜂在個體及群體上的時間-依賴風險評估，尤其是低劑量的長期暴露風險，建立相應風險閾值，降低化合物對蜜蜂等授粉昆蟲的影響。

3.3 亞致死劑量氟蟲腈激活蜜蜂解毒反應

蜜蜂對外源物的解毒方式主要包括細胞色素P450s、羧酸酯酶(carboxylesterases)、GST和藥物轉運蛋白4個途徑[42]，其中GST是昆蟲體內常見的解毒酶，通過催化GSH與環(huán)氧化合物結合，可以促進大量被細胞色素P450家族氧化的化合物的二次代謝，轉化多種內源性和外源性化合物，包括除草劑和殺蟲劑等[43]。本研究中，氟蟲腈暴露處理的幼蟲體內GST酶活力均顯著低于對照組，與此相對應的，GSH在幼蟲體內的含量隨氟蟲腈暴露濃度的上升而逐漸上升；成蜂體內GST酶活力在氟蟲腈處理組中亦顯著低于對照組，但GSH含量變化在暴露7 d時不顯著，在暴露14 d后GSH的含量開始隨氟蟲腈濃度的增加而逐漸下降；由此推測GST介導了氟蟲腈在蜜蜂體內的降解代謝。本研究結果與Nielsen等[44]的報道相似，Nielsen等[44]測定了氟氯苯氰菊酯對不同階段蜜蜂解毒酶的影響，發(fā)現(xiàn)氟氯苯氰菊酯暴露可顯著增加蜜蜂幼蟲和蛹期的GST活力，但在采集蜂內GST活力顯著降低。此外，Smirle[45]早在1993年就發(fā)現(xiàn)幼齡工蜂所具有的解毒酶特異性低，導致了幼齡工蜂對各種環(huán)境氧化物更敏感。值得注意的是，與其他昆蟲相比，西方蜜蜂基因組中解毒和免疫基因數(shù)量相對較少[42,46]，以GST為例，西方蜜蜂體內僅含有10個GST相關功能基因，且主要為σ類型，解毒能力的不足也是導致蜜蜂對外源物敏感的一個重要原因。氟蟲腈誘導的GST和GSH變化也證明了二者在蜜蜂應對外界脅迫時發(fā)揮著積極的保護作用。

3.4 亞致死量氟蟲腈影響蜜蜂AChE活力

AChE是評價神經毒性化合物的常用指標[47]。本研究中蜜蜂幼蟲和成蜂頭部AChE活力顯著降低，再次證明了氟蟲腈對蜜蜂的神經毒性。Roat等[48]以10 pg氟蟲腈·蜂-1的劑量飼喂非洲化蜜蜂5 d，發(fā)現(xiàn)氟蟲腈會導致幼齡工蜂腦部某些蛋白質表達模式的改變，造成神經化學壓力，神經元蛋白質發(fā)生錯誤折疊，細胞凋亡率升高，損害突觸形成，大腦發(fā)生退化，導致記憶和學習功能障礙。但Carvalho等[49]發(fā)現(xiàn)氟蟲腈暴露48 h后不會影響蜜蜂頭部的AChE活力，造成這種差異的原因可能是由于氟蟲腈的作用靶標是GABA受體，短時間暴露時可能不會誘導AChE活力變化，而當暴露時間較長時，蜜蜂受到的神經損傷較重，可通過AChE活力變化表現(xiàn)出來。據(jù)報道，多種農藥可影響蜜蜂AChE活力，如吡蟲啉、噻蟲胺和高滅磷等，進而影響蜜蜂正常的生理功能，導致蜂群崩潰死亡[50-52]。

昆蟲AChE是殺蟲劑的重要靶標之一，其突變及表達量的變化均是導致昆蟲產生抗藥性的主要原因[53-54]。昆蟲具有2個AChE基因，其在不同季節(jié)、昆蟲不同組織內表達不同，且功能不同，在頭部AChE主要承擔水解神經遞質等催化功能，而在其他組織內可能具有與催化作用無關的生理功能[55]。Kim等[56]對蜜蜂AChE基因表達量和表達部位測定時發(fā)現(xiàn)，AChE1主要在蜜蜂頭部和腹部表達且表達量高于AChE2，最高表達量出現(xiàn)在春冬季節(jié)，AChE2表達量隨季節(jié)變化不明顯，在一年各月份中均可表達。此外，不同分工蜜蜂體內的AChE分布不同，Shapira等[57]研究發(fā)現(xiàn)采集蜂頭部AChE活力顯著低于內勤蜂，這也可能是采集蜂對農藥敏感性較高的原因之一。本研究中僅針對蜜蜂幼蟲和幼齡工蜂頭部AChE的活力進行了測定，未來可針對不同季節(jié)、不同日齡、不同級型和不同蜜蜂組織AChE進行監(jiān)測，探索其在蜜蜂中毒預警中應用的可能。

綜合本研究的發(fā)現(xiàn)可知，亞致死劑量的氟蟲腈對蜜蜂幼蟲和幼齡工蜂均可產生顯著的影響，且這種影響會隨著暴露濃度和時間的延長而加劇，對蜜蜂健康造成的更大的風險。為避免蜂群接觸到高殘留劑量的氟蟲腈，應嚴格遵守用藥規(guī)定和蜂群管理措施，盡可能的保證蜂群中各個級型蜜蜂的健康。除農業(yè)生產外，氟蟲腈亦是一種重要的衛(wèi)生殺蟲劑，可以殺滅跳蚤、螨和虱等衛(wèi)生害蟲，氟蟲腈被世界衛(wèi)生組織列為“對人類有中等毒性”的化合物，在環(huán)境或生物體內代謝產生氟甲腈、氟蟲腈硫醚和氟蟲腈砜3種代謝物，而這3種代謝物的毒性要高于氟蟲腈原藥[58]。鑒于氟蟲腈的使用特點和對蜜蜂的高風險性，未來的研究一方面可以圍繞環(huán)境中氟蟲腈代謝產物是否對蜜蜂存在暴露風險開展，另一方面可以通過新型生理指標(腸道菌群、基因表達和代謝組學變化等)的應用進一步評價氟蟲腈單一或與其他藥物協(xié)同作用時對蜜蜂的毒性作用。