根表鐵膜對鳳眼蓮吸收環丙沙星的影響

馮嵐，嚴巖，韓建剛

1. 南京林業大學土木工程學院，南京 210037 2. Ecological Complexity and Modeling Laboratory, Department of Botany and Plant Sciences, University of California, Riverside, CA, 92521, USA 3. 江蘇省環境科學研究院太湖水污染防治研究中心，南京 210042 4. 南京林業大學環境與生物學院，南京 210037 5. 南京林業大學南方現代林業協同創新中心，南京 210037 6. 江蘇洪澤湖濕地生態系統國家定位觀測研究站，洪澤 223100

抗生素被廣泛地應用在畜牧業和水產養殖業。近年來，抗生素藥物在生態環境中造成的影響引起了國內外學者乃至公眾的廣泛關注[1]，其中水生生態環境海洋、湖泊、濕地甚至是飲用水中經常檢測到抗生素的存在[2-5]。抗生素在水生態系統的水體中檢測水平可從μg·L-1達到mg·L-1[6-7]，而在沉積物中的水平可從μg·kg-1達到mg·kg-1[7-8]。環境中殘留的抗生素通過食物鏈擴散和生物擴大效應威脅到人類的健康安全[9]。其中，氟喹諾酮類抗生素環丙沙星(ciprofloxacin, CIP)由于具有廣譜性抗菌活性而被廣泛應用，經常在環境中被檢出[10-11]。因此，生態環境中抗生素去除問題備受人們關注。

近年來，高級氧化法、生物炭吸附法和膜過濾技術等方法能夠高效地去除環境中抗生素[12-14]。但這些方法成本較高，且易造成二次污染，不能廣泛地被推廣應用。植物修復是一種高效、低成本和生態安全技術，植物通過吸收、轉化和降解等方式去除水體中抗生素[15-16]。水生植物為了適應淹水和其他環境脅迫會在根際表面形成鐵氧化物膠膜(簡稱鐵膜)，其中，水環境中鐵離子濃度是根表鐵膜形成的主要影響因素[17]。植物根表鐵膜通過吸附和共沉淀等作用對磷、砷等具有較強的吸附和降解能力[18-19]，然而，也有研究表明植物根表鐵膜阻礙營養元素或金屬離子的吸收[18]。目前，水生植物根表鐵膜對抗生素吸收的影響還鮮有報道。

本試驗中通過探究根表鐵膜對漂浮植物鳳眼蓮吸收抗生素CIP的影響，分析不同濃度鐵離子處理下鳳眼蓮根表鐵膜形成量和根系生理生化變化及對水質的影響，揭示根表鐵膜對CIP的吸附特征及根系對CIP的吸收特征，為植物修復抗生素污染的水體提供理論支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

漂浮植物鳳眼蓮(Eichhorniacrassipe)采集于南京師范大學植物園的池塘中。抗生素CIP純度>98%，化學試劑甲醇和乙腈(色譜純)、磷酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、連二亞硫酸鈉、石蠟和檸檬酸鈦等均為分析純，均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

在南京師范大學植物園溫室中開展試驗。選用的鳳眼蓮體內未檢測到CIP殘留，自來水沖洗植株，在實驗桶中用1/2 Hoagland溶液培養7 d。完全隨機區組實驗設計，CIP濃度設置為0.1 mg·L-1，Fe2+(FeSO4·7H2O)濃度設為0、10、20、50、100和150 mg·L-16個水平，共6個處理。用1/2 Hoagland營養液配制處理液，從培養的植株中選取質量和大小相似的3株放入裝有100 L處理液的實驗桶中，每桶視為1個處理，3次重復，共計18個桶。試驗桶的表面和四周用錫紙包裹，避免抗生素光降解。期間定期地添加去離子水補充桶中蒸發的水分。處理第7天分別測定植物根表鐵膜量、根表CIP含量、根系泌氧量、根系孔隙度、根系活力和植物根系中CIP的含量以及水質指標。

1.3 測定項目與方法

植物根系內抗生素測定[20]：取1.0 g在冷凍干燥機(Biosafer-10A，賽飛，中國)中冷凍干燥后的植物，于研缽中研磨均勻后置于50 mL離心管中，加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaine提取液。Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液配制：稱取檸檬酸12.9 g、磷酸氫二鈉27.5 g、乙二胺四乙酸二鈉37.2 g,溶于水中并定容1 L(pH 4)。先用渦旋振蕩器震蕩30 s，再用超聲震蕩器震蕩15 min，最后將離心管置于8 000 r·min-1的條件下離心10 min，傾出上清液于另一個清潔的50 mL離心管中，剩余的殘渣按以上步驟重復提取2次，合并上清液于50 mL離心管中后9 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液用微孔濾膜進行過濾，最后將濾液用超純水稀釋至200 mL，加入約40 μL鹽酸調節水樣pH為3.0左右，加入0.2 g Na2EDTA。將Oasis HLBSPE小柱(6 mL，500 mg)進行富集凈化。上樣前，HLB小柱依次用6 mL甲醇和6 mL超純水以及6 mL 10 mmol·L-1Na2EDTA緩沖溶液(pH 3)進行活化；上樣時，流速控制在10 mL·min-1左右；上樣后，先用10 mL水清洗HLB小柱，然后在負壓下抽干1 h；最后用6 mL甲醇洗脫。洗脫液在35 ℃下用氮氣吹干濃縮至1 mL以下，最后用40%甲醇水溶液定容至1 mL，待測。CIP的提取液使用高效液相色譜儀(Agilent 1290，安捷倫，美國)進行定量分析，色譜柱為Zorbax 300SB-C18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，柱溫30 ℃，流動相為乙腈和0.025 mol·L-1磷酸水溶液(體積比為15∶85)，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL，DAD檢測波長為278 nm。

根表鐵膜的測定：采用連二亞硫酸鈉-檸檬酸鈉-重碳酸鈉法(DCB法)進行測定，將根系用去離子水清洗干凈并剪成約1 cm長，將根裝入250 mL的三角瓶中，然后依次加入0.3 mol·L-1檸檬酸鈉40 mL、1 moL·L-1碳酸氫鈉5 mL，最后加入3 g連二亞硫酸鈉，搖勻后在室溫條件下震蕩3 h，然后將根系取出并用去離子水重復清洗3次，將清洗液和提取液倒入100 mL容量瓶中，最后定容至刻度。采用原子吸收分光光度法測定提取液中的鐵。采用DCB提取液中鐵含量與DCB提取后根系干質量之比計算根表鐵膜量。

植物根表抗生素的測定：樣品提取方法同根表鐵膜的提取方法，抗生素測定采用高效液相色譜法，方法同上。根表吸附的抗生素含量是用DCB提取液中抗生素量與DCB法提取后根系干質量之比表示[21]。

根系泌氧量的測定：采用檸檬酸鈦比色法對植物根系泌氧量進行測定。在500 mL燒瓶中加入195 mL 0.1倍Hoagland營養液，然后再通入高純氮15 min去除營養液中的氧氣。選取生長情況相近3株植物，將其所有根系浸沒于培養液中進行光照培養，同時設一組無植物的空白對照處理組。在營養液表面緩慢地倒入約2 cm厚的液體石蠟，在石蠟層下加入5 mL檸檬酸鈦溶液并輕輕地搖勻，上述所有操作均在氮氣吹掃的條件下進行。植物組與對照組都在恒溫培養箱中按設定溫度培養3 h后，取營養液樣品3 mL在527 nm處進行比色分析，然后計算根系泌氧量[22]。

植物根系孔隙度的測定：采用Kludge的方法[23]測定植物根系的孔隙度。將25 mL比重瓶裝滿水稱重，記為P，將植物根系清洗干凈后去除表面的水體，稱取0.3 g的植物根系裝入比重瓶中，稱重記為Pr。然后將裝有植物根系的比重瓶抽真空2 h，取出的根系用研缽磨碎后放入比重瓶，裝滿水后稱重記為Pgr。則根系孔隙度可以表示為：

(1)

式中：Por為根孔隙度(%)；r為根質量(g)。

1.4 數據處理

試驗結果的顯著性分析采用那肯氏新復極差多重比較法(DMRT)，以0.05作為顯著性水平。數據分析、作圖采用SPSS 19.0(IBM，美國)和Origin 8.0(Originlab，美國)。

2 結果(Results)

2.1 環境因子的變化特征

在CIP濃度為0.1 mg·L-1條件下，水溶液中溶解氧含量隨著Fe2+離子處理濃度的增加而顯著降低(圖1(a))，Fe2+離子濃度為0 mg·L-1處理組，水體中溶解氧含量是10 mg·L-1處理組1.0倍，是20 mg·L-1處理組1.2倍，是50 mg·L-1處理組1.2倍，是100 mg·L-1處理組1.4倍，是150 mg·L-1處理組1.5倍。水溶液中pH值隨著Fe2+離子濃度的增加而顯著降低(圖1(b))，Fe2+離子濃度為10 mg·L-1的處理組，水體中pH值是20 mg·L-1處理組1.0倍，是50 mg·L-1處理組1.6倍，是100 mg·L-1處理組1.6倍，是150 mg·L-1處理組1.7倍。水溶液中氧化還原電位(OPR)值隨著Fe2+離子處理濃度的增加而增加(圖1(c))，在處理濃度為100 mg·L-1和150 mg·L-1時，OPR值顯著高于其他處理濃度組，分別比對照組高213 mV和346 mV。

圖1 Fe2+不同濃度條件下水環境因子變化特征注：具有相同小寫字母表示Fe2+不同濃度條件，溶解氧、pH和 氧化還原電位差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Characteristics of water environmental factors under different Fe2+ concentrationNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference in dissolved oxygen, pH and redox potential under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

2.2 鳳眼蓮根系生理生化變化特征

在CIP濃度為0.1 mg·L-1條件下，0 mg·L-1Fe2+處理組，鳳眼蓮根系孔隙度比10 mg·L-1處理組增加7.19%，比20 mg·L-1處理組增加3.84%，比50 mg·L-1處理組降低4.74%，比100 mg·L-1處理組降低2.30%，比150 mg·L-1處理組增加0.71%(圖2)，隨著鐵濃度的增加，鳳眼蓮根系孔隙度呈現出先增加后降低的趨勢。

圖2 Fe2+不同濃度對根系孔隙度的影響注：具有相同小寫字母表示Fe2+不同濃度條件，根孔隙度差異不顯著。Fig. 2 Effects of different Fe2+ concentrations on root porosityNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between root porosity under different Fe2+ concentration conditions.

在CIP濃度為0.1 mg·L-1條件下，隨著水溶液中Fe2+濃度逐漸增加，鳳眼蓮根系泌氧量的變化情況如圖3所示。Fe2+濃度為0 mg·L-1處理組，鳳眼蓮根系泌氧量比10 mg·L-1處理組增加27.27%，比20 mg·L-1處理組降低22.72%，比50 mg·L-1處理組增加4.45%，比100 mg·L-1處理組降低4.45%，比150 mg·L-1處理組降低18.18%。隨著Fe2+濃度的增加，鳳眼蓮根系泌氧量呈現出先增后降趨勢，在20 mg·L-1時最高。

在CIP濃度為0.1 mg·L-1條件下，水溶液中Fe2+濃度逐漸增加，鳳眼蓮根系活力的變化如圖4所示。Fe2+濃度為150 mg·L-1處理組，鳳眼蓮根系活力是0 mg·L-1處理組1.9倍，是10 mg·L-1處理組1.7倍，是20 mg·L-1處理組1.6倍，是50 mg·L-1處理組1.4倍，是100 mg·L-1處理組1.2倍，但不同濃度處理間無顯著差異(P>0.05)。

2.3 鳳眼蓮根表鐵膜量的變化特征

在CIP濃度為0.1 mg·L-1條件下，隨著水溶液中添加Fe2+濃度增加，鳳眼蓮根表鐵膜量逐漸增加。Fe2+濃度為150 mg·L-1處理水平下鳳眼蓮根表鐵膜量是0 mg·L-1處理組1.9倍，是10 mg·L-1處理組1.5倍，是20 mg·L-1處理組1.5倍，是50 mg·L-1處理組1.2倍，是100 mg·L-1處理組1.1倍(圖5)。Fe2+濃度>50 mg·L-1時，各濃度處理下的鳳眼蓮根表鐵膜量顯著高于對照處理(P<0.05)。

圖3 Fe2+不同濃度對根系泌氧量的影響注：具有相同小寫字母表示Fe2+不同濃度條件，根系泌氧量 差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 3 Effects of different Fe2+ concentrations on radial oxygen lossNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between radial oxygen loss under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

圖4 Fe2+不同濃度對根系活力的影響注：具有相同小寫字母表示Fe2+不同濃度條件，根系活力差異不顯著。Fig. 4 Effects of different iron concentrations on root activityNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between root activity under different Fe2+ concentration conditions.

圖5 Fe2+不同濃度對根表鐵膜量的影響注：具有相同小寫字母表示Fe2+不同濃度條件，鐵膜量 差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 5 Effects of different Fe2+ concentrations on root iron plaqueNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between amount of iron film under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

2.4 鳳眼蓮根系表面和根系中CIP濃度變化

在CIP濃度為0.1 mg·L-1條件下，隨著水溶液中Fe2+濃度的增加，鳳眼蓮根系表面吸附的CIP濃度逐漸增加(圖6)，Fe2+濃度為150 mg·L-1處理組，鳳眼蓮根表吸附CIP濃度是0 mg·L-1處理組2.1倍，是10 mg·L-1處理組1.6倍，是20 mg·L-1處理組1.3倍，是50 mg·L-1處理組1.2倍，是100 mg·L-1處理組1.1倍。

在CIP濃度為0.1 mg·L-1條件下，水溶液中添加Fe2+濃度逐漸增加，鳳眼蓮根系中CIP濃度顯著降低(圖7)。隨著水體中Fe2+濃度的增加，鳳眼蓮根系中CIP濃度逐漸降低，濃度為0 mg·L-1處理組，鳳眼蓮根系中CIP濃度是10 mg·L-1處理組3.5倍，是20 mg·L-1處理組11.5倍，是50 mg·L-1處理組12.9倍，是100 mg·L-1處理組22.9倍，是150 mg·L-1處理組36.2倍。

3 討論(Discussion)

環境介質中鐵離子的有效性和溶解性影響植物根表鐵膜的形成，其中Fe2+含量是直接影響根表鐵膜數量的重要因素[24]。水體中添加Fe2+后，水環境中的溶解氧含量和pH值降低，主要由于水體中Fe2+氧化為Fe3+，且添加的Fe2+(FeSO4·7H2O)是酸性[25-26]。然而，鳳眼蓮根表鐵膜量逐漸增加，與已有的研究結果相似[27-28]。

圖6 Fe2+不同濃度對根表抗生素環丙沙星(CIP)濃度的影響注：具有相同小寫字母表示Fe2+不同濃度條件，根表抗生素CIP差 異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 6 Effects of different Fe2+ concentrations on ciprofloxacin (CIP) contents of rootNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between root surface antibiotics CIP under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

圖7 不同濃度Fe2+對根系中CIP濃度的影響注：具有相同小寫字母表示Fe2+不同濃度條件，根系中CIP差異 不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 7 Effects of different Fe2+ concentrations on the CIP concentrations in rootNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between CIP in roots under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

在抗生素CIP脅迫下，Fe2+不同濃度對鳳眼蓮根系生理生化影響各異。植物根系孔隙度能夠較好地表示植物根部通氣組織的發達程度[29]，Fe2+不同濃度對鳳眼蓮根系孔隙度無顯著影響。水生植物根部生長在水中或底泥內，長期處于缺氧或者無氧條件，其根部的各項生理生化活動都需要植株向下輸氧，植物根系越發達所需的氧氣含量就越大，所需釋放氧氣的速率也較大[30]。已有研究顯示，植物根系孔隙度與根系泌氧量有正相關性[31]，而本研究中鳳眼蓮根系孔隙度與根系泌氧量無顯著相關性，且不同濃度Fe2+處理下鳳眼蓮根系泌氧量未達到顯著差異(P>0.05)。植物根系活力直接反映根的生長情況和活力水平，直接影響著莖葉部分的生長與營養狀態[32-33]。可能與鳳眼蓮的根系結構有關。鳳眼蓮根系被誘導形成根表鐵膜后，促進了根系不定根活力的增加，添加Fe2+濃度最大時，鳳眼蓮根系活力越強，在一定程度上影響著其對物質的吸收作用。

植物根系表面對有機污染物具有吸附作用[34]，Fe2+濃度越高，鳳眼蓮根表吸附CIP濃度就越高，可能是由于植物根表鐵膜上具有較多的負電荷基團，能夠增加CIP吸附點位[35]，且Fe2+不同濃度處理下鳳眼蓮根表鐵膜量與根表抗生素濃度呈正相關(r=0.954)，說明鳳眼蓮根表鐵膜對CIP具有吸附作用。在CIP濃度為0.1 mg·L-1條件下，水溶液中添加Fe2+(FeSO4·7H2O)濃度逐漸增加，鳳眼蓮根系中CIP的濃度顯著降低。鳳眼蓮根系中CIP濃度與根表鐵膜量和根表CIP濃度變化規律相反。鳳眼蓮根表吸附的CIP含量越多，進入根系中的含量就越低，鳳眼蓮根表鐵膜量的增加阻礙了根系對抗生素的吸收，可能由于鳳眼蓮根表上鐵離子濃度增加，與抗生素發生絡合反應而阻礙了根系對抗生素的吸收[36-38]。

根表鐵膜作為營養物質和污染物進入植物體內的第一道防線，已經成為環境科學研究中的熱點問題，研究其作用機理和調控機制具有重要的生態環境意義。目前主要研究集中在對污染物脅迫下，植物根表鐵膜對污染物的吸收影響及植物根系生理生化變化，對植物根系分泌物、根際微生物等影響鐵膜的形成及發揮效應還有待進一步探究。