典型四環素類抗生素的預測無效應濃度和風險評估

陳麗紅，李強，肖欣欣，孟甜，張瑜，魏占亮，曹瑩

中國環境科學研究院環境檢測與實驗中心，北京 100012

四環素類抗生素是一類廣譜抗生素，主要包括天然類(四環素、土霉素和金霉素等)及半合成衍生物(強力霉素、甲烯土霉素和二甲胺四環素等)，其中使用最多的是土霉素、四環素和金霉素[1]，主要應用于臨床治療和水產養殖業中。據統計，我國每年約生產2.1×105t抗生素，其中，四環素類抗生素是生產和使用比例均較大的一類[2]。由于抗生素不能完全被機體吸收，未被吸收利用的抗生素會通過各種方式進入水體以及土壤環境中。進入環境中的抗生素會誘導大量耐藥性致病菌的出現，從而給生態環境安全帶來嚴重威脅[3-5]。

已有研究表明，中國農業土壤中土霉素、四環素和金霉素的平均質量分數范圍分別為0～8 400﹑0～2 450和0～5 520 μg·kg-1[6]。與國外調查相比，中國農業土壤中四環素類抗生素污染較嚴重。例如，西班牙、荷蘭和意大利農業土壤中土霉素的平均質量濃度分別為15.7～105.4﹑0.67和127～216 μg·kg-1，西班牙農業土壤中四環素平均質量濃度范圍為18.8～64.3 μg·kg-1，丹麥農業土壤中金霉素的質量濃度范圍為0.6～15.5 μg·kg-1[7-9]。

化學物質風險評價技術指導文件(Technical Guidance Document on Risk Assessment, TGD)針對現有和新化學物質，提出預測無效應濃度(predicted no effect concentration, PNEC)作為風險評價的生態安全閾值[10]，其推導方法與水質基準的定值方法基本一致[11]。推導方法主要有評價因子法(evaluation factor, AF)、物種敏感度排序法(species sensitivity rank, SSR)、物種敏感度分布法(species sensitivity distribution, SSD)和平衡分配法。在我國，楊燦[12]通過SSD法推導出四環素水質慢性PNEC值為0.758 μg·L-1；杜雪[13]和秦延文等[14]采用評價因子法，推導出土霉素的水質急性PNEC值分別為4.5 μg·L-1和1.04 μg·L-1。然而，針對四環素類抗生素在淡水沉積物和土壤中的PNEC值和對應風險尚未報道。

本研究以四環素和土霉素為例，基于我國本土生物物種的毒性數據。利用SSR法推導水質PNEC值，同時與SSD法的計算結果進行了比對。采用平衡分配法推導沉積物和土壤的PNEC值，并應用提出的PNEC值對我國部分地區水質、淡水沉積物和土壤的暴露生態風險進行了初步評估，研究結論可為四環素類抗生素水質、淡水沉積物和土壤標準制定提供建議，為我國四環素類抗生素污染監測和生態系統保護提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 四環素和土霉素生態毒性數據篩選

生態毒性數據來自國內外已發表的文獻和報告。篩選原則為：(1)為我國本土物種；(2)所有毒性數據都要求有明確的測試終點、測試時間及對測試階段或指標的詳細描述；(3)對于同一物種在同一毒性終點有多個毒性值時，求幾何平均值[15]。

1.2 水質PNECwater的推導方法

1.2.1 物種敏感度排序法(SSR)

采用SSR法計算四環素和土霉素的最終慢性值(FCV)[16]。計算步驟為：(1)搜集與篩選數據；(2)求每個物種的物種平均慢性值(SMCV)和每個屬的屬平均慢性值(GMCV)；(3)從高到低對GMCV排序；(4)對GMCV設定R個級別(1～N)；(5)計算SMCV的累積概率(P)，P=R/(N+1)；(6)選擇累積概率最小的4個屬平均慢性值，用這4個屬平均慢性值和它們的累積概率計算最終慢性值(FCV)。計算公式如下：

(1)

(2)

(3)

FCV=eA

(4)

式中：S、L和A為計算中采用的中間符號，沒有特殊含義；GMCV為屬平均慢性值；P為累積概率；FCV為最終慢性值。

在慢性數據缺乏的情況下，可以采用急慢性比值法計算FCV。首先，通過與求得FCV類似的方法先獲得最終急性值(FAV)，FCV為FAV與最終急慢性比(FACR)的比值。

PNECwater為FCV和最終植物值(FPV)兩者中的最小值，FPV是用藻類所做的96 h實驗或者是用水生維管束植物所做的慢性實驗得出的結果中的最小值。

1.2.2 物種敏感度分布法(SSD)

采用荷蘭公共健康與環境研究所(RIVM)推薦的EXT 2.0風險評估軟件擬合SSD曲線[17]，并計算HC5(5%物種危害濃度，單位為μg·L-1)，PNECwater計算公式如下：

PNECwater=HC5/AF

式中：AF為評價因子，取值范圍為1～5，該研究中AF取值5[18-19]。

1.3 淡水沉積物PNECsusp的推導方法

由于缺乏淡水沉積物的生物毒性數據，因此PNECsusp采用平衡分配法進行推導[20]，計算公式如下：

(5)

RHOsusp=Fsolidsusp·RHOsolid+Fwatersusp·RHOwater

(6)

(7)

Kpsusp=FOCsusp·Koc

(8)

式中：PNECsusp為沉積物環境預測無效應濃度(mg·kg-1)；PNECwater為水環境預測無效應濃度(mg·L-1)；RHOsusp為懸浮物體積密度(kg·m-3)，Ksusp-water為懸浮物-水分配系數(m3·m-3)，Kpsusp為污染物在懸浮物中的固-水分配系數(L·kg-1)；其他參數及取值列于表1中，Koc為有機碳-水分配系數(L·kg-1)，其值從EPI Suite V4.10軟件獲得，優先使用軟件數據庫中的實測值，沒有實測值則采用軟件計算值。

1.4 土壤PNECsoil的推導方法

1.4.1 平衡分配法

由于土壤生物利用率及毒性效應與土壤性質有關，不同類型土壤試驗數據不能相比較，因此應將試驗結果轉化為標準土壤數據。無觀察效應濃度(NOEC)與半數致死/有效濃度(L(E)C50)的校正公式如下[20]：

(9)

式中：Fom土壤(標準)為標準土壤中有機質的比率(kg·kg-1)，默認值為3.4%；Fom土壤(試驗)為試驗土壤中的有機質比率(kg·kg-1)。

如果無法獲得土壤生物毒性數據，采用平衡分配法計算PNECsoil[20]，公式如下：

(10)

PNECsoil的計算公式類似于PNECsusp，Ksoil-water為土壤-水分配系數(m3·m-3)，其余參數的釋義及取值列于表1。

1.4.2 評估因子法

如果獲得土壤毒性數據，采用評估因子法計算PNECsoil，如表2所示。

如果僅獲得一項土壤生物毒性數據，需同時采用平衡分配法和評估因子法計算，選擇PNECsoil較低值。

1.5 生態風險評估

采用風險商值(risk quotient, RQ)法[20]對我國部分地區淡水沉積物和土壤中四環素和土霉素的暴露風險進行評估，將四環素和土霉素的暴露濃度除以獲得的PNEC值，得到RQ。若RQ>1，則有風險；若RQ<1，則無風險。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 四環素和土霉素水質PNECwater

2.1.1 SSR法推導四環素水質PNECwater

四環素的水生生物急性毒性數據篩選結果如表3所示，共獲得5門8科10個急性毒性數據[12,21-23]。同時獲得3門3科3個慢性毒性數據(表4)[12,24]。由于慢性毒性數據沒有達到3門8科的最低要求，故采用計算FCV的方法先推導FAV值。選擇最敏感的4屬：浮萍棘尾蟲(Stylonyciia屬)、大型溞(Daphnia屬)、天藍喇叭蟲(Stentor屬)和綠藻(Pseudokirchneriella屬)，依據式(1)～(4)求得四環素的FAV為0.532 μg·L-1。再采用FAV除以FACR求得FCV值。其中，FACR為斑馬魚、大型溞和扁藻的急慢性比率(ACR)的幾何平均值(表4)。PNECwater為FCV和FPV兩者中的最小值，在比較四環素對浮游植物及大型水生植物的毒性數據后，FPV采用文獻報道的綠藻(Chlorophyta)3 d-NOEC(0.002 mg·L-1)，最終得到四環素的PNECwater值為0.115 μg·L-1。

表1 化學物質風險評價技術指導文件(TGD)中默認的環境參數[20]Table 1 The default environmental parameters in Technical Guidance Document on Risk Assessment (TGD)[20]

2.1.2 SSD法推導四環素水質PNECwater

由于四環素慢性毒性數據不足，將表3中急性毒性數據除以FACR得到慢性毒性數據。利用RIVM推薦的EXT 2.0風險評估軟件分析慢性毒性數據，擬合曲線如圖1所示，得到PNECwater為4.32 μg·L-1。

表2 推導土壤環境預測無效應濃度(PNECsoil)的評估因子[20]Table 2 Assessment factors for devivation of predicted non-effect concentration of soil (PNECsoil)[20]

表3 四環素的水生生物急性毒性值Table 3 Acute toxicity data of tetracycline for freshwater species

圖1 四環素的慢性物種敏感度分布曲線注：SMCV表示種平均慢性值。Fig. 1 The chronic species sensitivity distribution curves of tetracyclineNote: SMCV stands for species mean chronic value.

2.1.3 SSR法推導土霉素水質PNECwater

土霉素的水生生物慢性毒性數據篩選結果如表5所示。共獲得4門10科12個慢性毒性數據[25-35]，已達到3門8科的最低要求。選擇最敏感的4屬：金頭鯛(Sparus屬)、斑點叉尾鮰(Ictalurus屬)、近頭狀偽蹄形藻(Pseudokirchneriella屬)和水蘊草(Egeria屬)，計算出土霉素的PNECwater為4.93 μg·L-1。

2.1.4 SSD法推導土霉素水質慢性PNECwater

土霉素SSD曲線擬合結果如圖2所示，求得HC5為114 μg·L-1，PNECwater為22.8 μg·L-1。

本研究采用SSR法推導四環素和土霉素的PNECwater，同時與SSD法的計算結果進行了比對，選擇PNECwater較低者用于風險表征。因此，四環素和土霉素的PNECwater值為0.115 μg·L-1和4.93 μg·L-1(表6)。

2.2 四環素和土霉素淡水沉積物PNECsusp

由于缺乏四環素和土霉素的淡水沉積物毒性數據，本研究采用平衡分配法計算PNECsusp。除Koc以外的參數均采用TGD的默認值。按照式(5)～(8)求得四環素和土霉素的PNECsusp分別為423 μg·kg-1和1.78×104μg·kg-1(濕質量)。

表4 四環素的最終急慢性比率(FACR)Table 4 Final acute to chronic ratio (FACR) of tetracycline

表5 土霉素的水生生物慢性毒性值Table 5 Chronic toxicity data of oxytetracycline for freshwater species

表6 四環素和土霉素的預測無效應濃度(PNEC)值Table 6 Predicted no effect concentration (PNEC) value of tetracycline and oxytetracycline

圖2 土霉素的慢性物種敏感度分布曲線Fig. 2 The chronic species sensitivity distribution curves of oxytetracycline

2.3 四環素和土霉素土壤PNECsoil

采用植物慢性毒性試驗中黑麥草10 d-NOEC值5 mg·kg-1[36]推導四環素PNECsoil值，應用評價因子100，求得PNECsoil為0.05 mg·kg-1(濕質量)。該文獻采用國際經濟合作與發展組織(OECD)試驗標準，默認有機質含量3%(Fom土壤(試驗))，通過式(9)，將NOEC值(5 mg·kg-1)轉化為標準土壤數據NOEC(標準)為5.67 mg·kg-1，得到PNECsoil為0.057 mg·kg-1(濕質量)。

土霉素PNECsoil值采用赤子愛蚯蚓14 d-NOEC值2.56×103mg·kg-1[35]進行推導，應用評價因子100，得到PNECsoil為25.6 mg·kg-1(濕質量)。但由于該文獻試驗中未報道試驗土壤的有機質含量和含水率，因此本研究未對該毒性數據進行標準化處理，因此可能造成PNECsoil值偏低。

由于本研究僅獲得一項土壤生物毒性數據，故同時采用評估因子法以及平衡分配法，選擇PNECsoil較低者用于風險表征。采用平衡分配法求得四環素和土霉素的PNECsoil分別為68.5 μg·kg-1(濕質量)和3.16×103μg·kg-1(濕質量)。因此，四環素PNECsoil采用評價系數法推導的57 μg·kg-1(濕質量)，土霉素采用平衡分配法推導的3.16×103μg·kg-1(濕質量)。

2.4 我國部分地區水質中四環素類抗生素的生態風險評估

將我國部分地區江河和湖泊中四環素類抗生素的暴露濃度與本研究推導的土霉素PNECwater值(4.93 μg·L-1)相比較[37](表7)。水質中常檢出的四環素類抗生素為土霉素和四環素，由于此類抗生素具有較高的分配系數，容易吸附在懸浮物或沉積物中，在水質中檢出的頻率和暴露濃度較低。結果顯示，所有區域的此類抗生素暴露濃度均未超過土霉素的PNECwater值。

表7 我國部分地區水質中四環素類抗生素濃度Table 7 The concentrations of tetracycline antibiotics in freshwater of China

2.5 我國部分地區淡水沉積物中四環素和土霉素的生態風險評估

將本研究推導的四環素和土霉素PNECsusp與我國部分地區淡水沉積物中暴露濃度進行比較[38-41](表8)，結果顯示，我國大部分地區淡水沉積物中四環素和土霉素濃度均低于PNECsusp值，四環素濃度范圍最低的是遼河(ND～4.82 μg·kg-1)，最高的是海河(2.0～135 μg·kg-1)，表明我國大部分地區淡水沉積物中四環素處于可接受水平，但部分點位四環素濃度高于PNEC值，如海河的少數斷面高達135 μg·kg-1，是PNECsusp的1.47倍，高四環素濃度可能會對底棲水生生物造成危害，值得關注。土霉素濃度范圍最低的是長江三角洲(0.3～14.0 μg·kg-1)，最高的是遼河(2.34～652 μg·kg-1)，均低于PNECsusp，說明我國大部分地區淡水沉積物中土霉素處于可接受水平。

2.6 我國部分地區土壤中四環素和土霉素的生態風險評估

根據收集的四環素和土霉素土壤暴露濃度[42-59]，結合推導的PNECsoil值，計算我國部分地區土壤中四環素和土霉素的RQ值，結果分別如表9和表10所示。由表9可知，25個區域中有5個區域的土壤RQ>1。RQ值從大到小依次為山東省(3.998)>四川省彭州市(3.823)>遼寧省沈陽市(3.512)>浙江省北部(1.561)>珠江三角洲(1.237)。9個區域(四川省彭州市、浙江省寧波市、珠江三角洲、江蘇省徐州市、山東省、天津市、福建省莆田市、浙江省北部、遼寧省沈陽市)的土壤四環素最高值超過本研究提出的PNECsoil57 μg·kg-1，這些土壤存在潛在生態風險，值得關注。

表8 我國部分地區淡水沉積物中四環素和土霉素的含量Table 8 The concentrations of tetracycline and oxytetracycline in freshwater sediments of China

表9 我國部分地區土壤中四環素的含量Table 9 The concentrations of tetracycline in soil of China

表10 中國部分土壤中土霉素的含量Table 10 The concentrations of oxytetracycline in soil of China

由表10可知，我國部分地區土壤中土霉素的含量范圍介于0～8.40×103μg·kg-1[42-43,45-49,51-56,59-62]，將本研究推導出的土霉素PNECsoil與我國部分地區土壤暴露濃度相比較，結果顯示，23個區域中有1個區域的農田土壤(上海市)的平均暴露濃度超過PNECsoil，RQ為1.229。江蘇省徐州市、浙江省北部和上海市的最高值超過本研究提出的PNECsoil3.16×103μg·kg-1，這些土壤具有潛在的生態風險，應當引起重視。

2.7 不確定性分析

生物毒性數據的篩選、不同的PNEC值推導方法、沉積物和土壤中四環素和土霉素的暴露濃度變化是生態風險評估過程中產生不確定性的主要因素。首先，水生生物的區系分布具有很強的地域性，這不僅體現在國內外物種差異中，在我國不同流域中分布的水生生物也存在較大差異，因此受試生物的篩選是水質PNEC推導的重點之一，本研究篩選的水生生物均為我國的本土水生生物。其次，有文獻報道氨氮、鎘等水質PNEC受溫度、pH和溶解性有機碳(DOC)等水質參數的影響[63]，因此，在篩選毒性數據時，需要進一步分析這些參數對毒性數據的影響。但目前尚未有文獻報道水質參數對四環素和土霉素PNEC的影響。此外，不同的推導方法也會影響PNEC值。最后，由于四環素和土霉素在沉積物和土壤中的暴露濃度數據有限，為了更全面精確地了解四環素和土霉素的暴露情況，需要進一步搜集整理并開展全國范圍沉積物和土壤中四環素和土霉素暴露濃度的數據監測。

綜上所述，本研究結果表明：

(1)運用TGD推薦的計算PNEC方法，推導出我國水質、淡水沉積物及土壤中四環素的PNEC值分別為0.115 μg·L-1、423 μg·kg-1(濕質量)和57 μg·kg-1(濕質量)；土霉素的PNEC值分別為4.93 μg·L-1、1.78×104μg·kg-1(濕質量)和3.16×103μg·kg-1(濕質量)。

(2)應用獲得的四環素、土霉素PNEC值對我國部分地區水質、淡水沉積物和土壤進行暴露生態風險評價，結果表明水質無暴露風險，處于可接受水平，沉積物風險區域主要集中在海河，土壤風險區域主要集中在山東省、四川省彭州市、遼寧省沈陽市、浙江省北部、珠江三角洲、浙江省寧波市、江蘇省徐州市、天津市、福建省莆田市和上海市，部分區域點位存在潛在的生態風險。