4,4’-二氨基二苯基甲烷對浮萍(Lemna minor L.)毒性作用

柳燕貞，羅鳳娟，梁燕珍，梅承芳，曾國驅,*

1. 廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，廣州 510070 2. 華南應用微生物國家重點實驗室，廣州 510070 3. 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070 4. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070

4,4’-二氨基二苯基甲烷(4,4’-methylenedianiline, MDA；CAS-No. 101-77-9)是一種重要的化工中間體，是合成聚氨基甲酸酯、二異氰酸酯和還氧樹脂硬化劑等的重要原料。近年來，MDA的使用范圍正在擴大，年產量逐年增加，達400萬t·a-1[1]。MDA是歐盟REACH法規中的高關注物質之一，其對生態環境及人類健康的潛在危害越來越受到重視[2-4]。當釋放到環境中時，MDA首先分配到水體中，使地表水受到污染，隨后再分配到沉積物和土壤隔室中。我們的前期實驗和他人的研究結果表明，MDA并不具有生物蓄積性，但土壤孔隙中的MDA能夠迅速吸附在植物根部表面，從而對水生生物產生毒害作用[5-6]。

浮萍(LemnaminorL.)屬于浮萍科，廣泛分布于各種水體中，能夠靈敏地反映水體污染狀況。利用浮萍的生物學特性將其應用于生態環境修復，取得了顯著的成果[7-9]。然而有關MDA對浮萍的毒性作用尚未見報道。本研究以浮萍(LemnaminorL.)作為受試生物，通過檢測不同濃度的MDA對浮萍生長、葉綠素含量、光合活性、質膜透性和抗氧化酶活性等的影響，初步探討MDA對浮萍的毒性作用，以期為MDA的水生態風險評估提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國)，電子天平(XS205DU型，梅特勒-托利多公司，瑞士)，紫外可見分光光度計(T6型，北京普析通用儀器有限責任公司，中國)，多用途臺式高速離心機(Primo R，Thermo Fisher Scientific，美國)，人工氣候箱(PQX-450B-22H，寧波萊福科技有限公司，中國)，手提式pH測試儀(pH 3210，WTW公司，德國)，溫濕度記錄儀(DSR系列，杭州佐格通訊設備有限公司，中國)，植物效率分析儀(Handy PEA，Hansatech Instrument Ltd.，英國)，便攜式多量程電導儀(HI 8733，HACH公司，美國)。

試劑：4,4’-二氨基二苯基甲烷為分析純，購自美國Sigma公司。其他試劑均為國產分析純，購自中國廣州化學試劑廠。

1.2 受試生物

本次試驗選擇浮萍(LemnaminorL.)為受試生物。試驗植株從廣州珠江獲得，采集自野外，采集地無明顯污染。試驗開始前植株已在試驗用培養基中培養8周以上。試驗開始前7 d，從貯備培養的浮萍中選擇足量的浮萍轉入新鮮無菌Swedish Standard (SIS)培養基中，并在試驗條件下培養7 d。

1.3 MDA對浮萍生長的影響

本試驗按照經濟合作與發展組織(OECD)化學品測試準則中的浮萍急性毒性試驗方法(OECD 221)進行[10]。根據預試驗的結果設置6個MDA濃度梯度，各試驗濃度間隔系數為3.0，即0(空白對照)、0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1。根據MDA在試驗體系中的穩定性，選擇了半靜態的試驗方式，每48 h更換一次MDA試驗溶液，分別在0、48、96、144和168 h時測定新舊溶液的MDA濃度。取擴大培養后葉片完好、大小相近的3株3葉浮萍，采用滅菌SIS培養基對浮萍漂洗3遍，隨機放入裝有滅菌SIS培養基的200 mL培養瓶中，每個濃度設置3個重復。將所有培養瓶置于人工氣候箱中培養，培養溫度為(24±2) ℃，連續供光(光照度在85～135 μE·m-2·s-1)。試驗期間，每天隨機調整試驗瓶的擺放位置，以減少由于光照不同導致的植物生長差異。

1.4 浮萍生長參數及各項生理指標的測定

試驗期間MDA濃度采用Agilent 1260高效液相色譜儀進行測定(色譜柱：BDS HYPERSIL C18，100 mm×2.1 mm，2.4 μm)，柱溫40 ℃；流動相10 mmol·L-1磷酸二氫鈉-乙腈(V∶V=55∶45)，流速0.5 mL·min-1；進樣量2.0 μL；檢測器DAD；檢測波長210 nm)。浮萍的生長參數包括浮萍的形態變化、葉狀體數量、相對生長率、干質量和葉面積的測定。各項生理指標包括葉綠素含量、光系統Ⅱ(PSⅡ)最大光化學效應(Fv/Fm)、質膜透性、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定。浮萍干質量采用60 ℃烘干恒重法(前后2次質量相差≤0.4 mg)進行測定。浮萍葉面積采用軟件Image J將影像數字化以得到浮萍的葉面積。

1.5 葉綠素含量的測定

葉綠素含量的測定采用丙酮提取法[11]。

1.6 葉綠素熒光參數測定

將浮萍進行暗適應30 min，采用植物效率分析儀測定熒光參數。打開調制測量光，測定最小熒光(F0)，然后打開飽和脈沖，測定最大熒光(Fm)，根據公式Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm計算PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)。

1.7 質膜透性測定

采用電導率法測定浮萍質膜透性[12]。

1.8 SOD、CAT和POD活性測定方法

SOD活性的測定采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)法[13]，POD活性的測定采用愈創木酚法[13]，CAT活性的測定采用紫外吸收法[14]。

1.9 數據處理

應用軟件GraphPad Prism 5.0進行統計學分析，采用單因素方差分析(ANPVA)方法進行各試驗組與對照組的顯著性差異檢驗。P<0.05表示有統計學差異。

2 結果(Results)

2.1 MDA對浮萍生長的影響

MDA對浮萍的急性毒性試驗結果如圖1所示，MDA對浮萍葉片數、葉片生長率、葉片干質量和葉面積均有顯著的抑制作用，且抑制程度與MDA的濃度呈正相關。MDA對浮萍葉片生長抑制的7 d半數效應濃度(7 d-EC50)為26.7 mg·L-1，其95%置信限為22.3～32.1 mg·L-1，基于葉片產量抑制的7 d-EC50為0.62 mg·L-1，其95%置信限為0.53～0.74 mg·L-1。基于總葉面積及干質量產量抑制的7 d-EC50均<0.6 mg·L-1。

2.2 MDA對浮萍葉綠素含量及光合活性的影響

植物葉片光合作用產物的積累很大程度上依賴葉綠素的含量。不同濃度MDA處理7 d后，發現浮萍葉綠素含量變化趨勢與浮萍葉片干質量的趨勢一致，隨著MDA濃度的增加，浮萍總葉綠素含量逐漸下降(圖2)。葉綠素熒光技術是一種靈敏的探針，可用于檢測逆境脅迫對植物的危害程度[15]。PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)是葉綠素熒光動力學中重要且敏感的熒光參數[16]。采用便捷的植物效率分析儀檢測MDA處理對浮萍Fv/Fm的影響。結果如圖3所示，隨著MDA濃度的增加，Fv/Fm逐漸降低。0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA處理的浮萍葉片Fv/Fm值分別是對照組的95.8%、93.5%、87.2%、81.9%和75.2%。

2.3 MDA對浮萍質膜透性的影響

采用不同濃度的MDA處理浮萍7 d，發現MDA能夠增加浮萍質膜透性，0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA處理的質膜透性分別是對照組的1.26倍、1.44倍、1.79倍、2.19倍和2.82倍(圖4(a))，說明MDA對浮萍質膜具有明顯的慢性毒性作用。為進一步研究MDA是否對浮萍質膜具有直接毒性作用，將健康植物分別移入含有0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA的培養基中，并抽真空10 min以使MDA滲透到植物中，蒸餾水沖洗后，立即用電導儀測定整個植物的質膜滲透率。結果表明，直接毒性實驗中測得的質膜透性與慢性毒性實驗獲得的結果相似(圖4(b))，這表明MDA可以直接損傷細胞膜。

2.4 MDA對浮萍抗氧化酶活性的影響

MDA對浮萍SOD活性的影響如圖5(a)所示，低濃度MDA處理7 d，浮萍的SOD活性無明顯變化。當MDA濃度達到5.4 mg·L-1時，浮萍SOD活性顯著增加。MDA對浮萍POD活性的影響如圖5(b)所示，MDA濃度依賴地促進浮萍POD的活性。然而，當MDA濃度達到48.6 mg·L-1時，POD的活性顯著降低。MDA對浮萍CAT活性的影響如圖5(c)所示，低濃度MDA(0.6 mg·L-1)處理，浮萍的CAT活性無明顯變化，隨著濃度的增加，浮萍CAT活性逐漸上升，當MDA濃度達到16.2 mg·L-1時，浮萍CAT活性達到最高。

圖1 4,4’-二氨基二苯基甲烷(MDA)對浮萍生長的影響注：(a)MDA對浮萍葉片數的抑制作用；(b)MDA對浮萍葉片生長率的抑制作用；(c)MDA對浮萍葉片干質量 的抑制作用；(d)MDA對浮萍葉面積的抑制作用(*P<0.05)。Fig. 1 The effects of 4,4’-methylenedianiline (MDA) on growth of L. minorNote:(a) Inhibitory effect of MDA on leaf number; (b) Inhibitory effect of MDA on leaf growth rate; (c) Inhibitory effect of MDA on leaf dry weigh; (d) Inhibitory effect of MDA on leaf area (*P<0.05).

圖2 MDA對浮萍葉綠素含量的影響(* P<0.05)Fig. 2 The effects of MDA on chlorophyll contents of L. minor (*P<0.05)

圖3 MDA對浮萍PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm) 的影響(*P<0.05)Fig. 3 The effects of MDA on the maximal photochemical efficiency of PSⅡ (Fv/Fm) of L. minor (*P<0.05)

3 討論(Discussion)

生長抑制是有害物質檢測的重要指標。本研究結果表明，雖然由MDA導致的浮萍死亡率不是很明顯，但是它對浮萍的葉狀體數量、葉片數生長率、葉片干質量和葉面積都有顯著的抑制，說明MDA對浮萍生長具有顯著性的抑制作用，且呈現劑量效應關系。

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，其含量高低能夠反映植物光合作用水平，體現了植株的生長勢和抗逆性。葉綠素含量低，光合作用受到抑制使得植物不能正常新陳代謝，進而導致植物鮮重降低[17]。我們發現隨著MDA處理濃度的升高，浮萍總葉綠素含量逐漸下降，結果與浮萍葉片干質量的變化趨勢一致。Fv/Fm是葉綠素熒光動力學中重要且敏感的熒光參數，可較準確反映植物光合機構的狀態，常用于評估光化學反應對環境脅迫的響應[16]。我們發現隨MDA處理濃度的升高，Fv/Fm逐漸降低，進一步證實MDA脅迫能夠抑制浮萍光合活性。

植物體細胞在正常代謝過程中會產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS會對植物細胞的脂類、蛋白質和DNA等產生氧化損傷。植物細胞內存在相應的抗氧化酶系統，如SOD、POD和CAT等能有效地清除ROS，從而維持ROS動態平衡[18]。研究表明，植物的逆境條件會加劇ROS的產生和積累，當環境脅迫引起的ROS增加超出ROS清除系統的能力時，動態平衡就會被打破，引起膜脂質過氧化使得植物細胞結構和功能受到損傷，從而抑制植物生長[19-20]。我們發現低濃度MDA脅迫下，浮萍SOD、POD和CAT酶活性與對照組相近，說明此處理濃度所造成的脅迫尚未超出浮萍細胞內正常的ROS條件范圍。但是低濃度MDA脅迫依然能夠抑制浮萍葉綠素合成及光合活性，提示MDA可能通過其他的方式對浮萍產生毒性作用。通過測定浮萍質膜透性，我們發現MDA對浮萍質膜具有直接毒性作用，導致質膜透性增加，這可能是低濃度MDA處理導致光合活性降低的主要原因之一。與我們的研究結果相似，Kreslavski等[21]研究發現，多環芳烴(PAHs)對植物的毒性也與其對脂質雙層膜的破壞有關。隨著MDA濃度的進一步升高，浮萍SOD、CAT和POD酶活性增加，說明MDA處理導致浮萍氧化應激反應，以避免ROS對細胞的進一步損傷。當MDA濃度的達到48.6 mg·L-1時，POD活性顯著降低，POD活性降低通常是植物受到嚴重氧化損傷的標志，說明此MDA濃度對浮萍產生了不可修復的傷害。綜上所述，我們認為MDA能夠直接損傷質膜，干擾葉綠體功能并抑制光合活性，而氧化損傷是質膜損傷引起的繼發性應激，繼而引起膜脂質過氧化加劇，質膜損傷，從而進一步抑制浮萍的生長。

圖4 MDA對浮萍質膜透性的影響注：(a)慢性影響；(b)直接影響；*P<0.05。Fig. 4 The effects of MDA on plasma membrane permeability of L. minorNote: (a) chronic effect; (b) direct effect; *P<0.05.

圖5 MDA對浮萍抗氧化酶活性的影響注：(a)MDA對浮萍超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的影響；(b)MDA對浮萍過氧化物酶(POD)酶活性的影響； (c)MDA對浮萍過氧化氫酶(CAT)酶活性的影響；*P<0.05。Fig. 5 The effects of MDA on antioxidant enzyme activity of L. minorNote: (a) The effects of MDA on superoxide dismutase (SOD) activity; (b) The effects of MDA on peroxidase (POD) activity; (c) The effects of MDA on catalase (CAT) activity; *P<0.05.