喜炎平注射液對ARDS患者血清炎性因子和全血苦味受體水平的作用及機制*

湯娜娜，謝登海，楊國輝，寧睿，劉曉嫻，方昊，李莉，劉婷

(1.貴州醫科大學附屬醫院 內科ICU，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院 心內科，貴州 貴陽 550004)

喜炎平注射液是由穿心蓮內酯總磺化物制成的現代中藥注射液，具有抗病毒、抗菌及抗炎等作用，被廣泛用于呼吸系統感染性和炎癥性疾病的臨床治療[1-2]。苦味受體(bitter taste receptors，TAS2R)是與人體感受苦味物質密切相關的一類G蛋白偶聯受體，在全身多個組織器官中均有表達[3]，近年發現TAS2R在呼吸系統的防御機制中發揮重要作用[4-5]。本課題組前期生物學研究表明，TAS2R亞型TAS2R39是膿毒癥并發急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的關鍵基因之一，提示TAS2R及其信號通路可能在ARDS發生機制中發揮重要作用[6]。穿心蓮屬苦味類中藥[7]，喜炎平注射液可否通過調節TAS2R的表達、在治療ARDS中發揮抗炎效應尚無研究報道。本研究通過觀察喜炎平注射液對ARDS 患者炎癥反應的影響，并對其作用機制進行初步探討，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年7月—2021年6月收治的ARDS患者，要求符合“ARDS柏林定義”診斷標準[8]，治療前ARDS分型為輕度或中度[氧合指數(the ratio of arterial blood partial pressure of oxygen to the fraction of inspired oxygen，PaO2/FiO2)為100 mmHg<～≤300 mmHg]、呼吸末正壓≥5 cm H2O、年齡為18～75歲，患者本人或授權委托人同意并簽署知情同意書；排除已知或懷疑對喜炎平注射液或相關成分過敏者，排除妊娠期和哺乳期女性患者，排除有免疫功能缺陷(如長期使用糖皮質激素或免疫抑制劑，惡性腫瘤等)，排除有嚴重肝腎功能異常，排除放棄積極搶救、不愿進行常規治療者。共納入ARDS患者49例，采用隨機數字表法，將患者分為對照組(n=25)和觀察組(n=24)，2組患者的臨床特征見表1。本研究獲得醫院倫理委員會批準實施[2020倫審第(268-01)號]。

1.2 研究方法

1.2.1治療方法 對照組ARDS患者接受ARDS常規治療，包括病因治療、機械通氣、抗感染及營養支持治療等；觀察組ARDS患者在對照組常規治療基礎上聯合喜炎平注射液治療，治療方案為喜炎平注射液(江西青峰藥業有限公司，國藥準字Z20026249)250 mg加0.9%氯化鈉注射液250 mL稀釋，靜脈滴注，1次/d，療程7 d。

1.2.2基本資料和臨床指標收集 收集2組患者治療前的基本資料，包括性別、年齡、病因分類(肺內源性/肺外源性)、PaO2/FiO2及急性生理與慢性健康狀況評分(acute physiology and chronic health evaluation scoring system Ⅱ，APACHE Ⅱ)，記錄2組患者治療過程中藥物不良反應發生情況(包括皮疹、過敏性休克及嚴重肝腎功能不全等)以及治療后的PaO2/FiO2。

1.2.3血清炎性因子檢測 分別于治療前及治療結束時抽取2組患者外周靜脈血標本，3 000 r/min離心10 min，取上清，采用電化學發光法和免疫比濁法分別檢測2組患者血清白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和C反應蛋白(C-reaction protein，CRP)水平，操作嚴格按說明書執行，IL-6和CRP試劑盒均購自美國Roche。

1.2.4全血TAS2R39 mRNA檢測 分別于治療前及治療結束時抽取2組患者外周全血標本2 mL，采用逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)檢測TAS2R39 mRNA的表達；全血標本離心柱吸附法提取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，分光光度計檢測總RNA純度和濃度；采用SYBR Green 染色法進行RT-qPCR擴增，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參，健康志愿者全血RNA樣本作為空白對照，通過2-ΔΔCt公式計算TAS2R39 mRNA的相對表達量；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，TAS2R39上游引物為5′-TGATACCCTGGCTTCTGT-3′、下游引物為5′-TTAGTGGAGTTGGAGGAGTG-3′，GAPDH上游引物為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′、下游引物為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 基本資料

2組患者性別、年齡、病因分類、治療前PaO2/FiO2及APACHE II評分比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，提示2組患者基本資料具有可比性。見表1。

表1 對照組和觀察組患者的基本資料

2.2 治療后PaO2 /FiO2水平及并發癥

2組患者在治療過程中均未發生皮疹、過敏性休克及嚴重肝腎功能不全等藥物不良反應；治療后，觀察組患者的PaO2/FiO2[244.5(190.0，261.5)mmHg]較對照組[225.0(154.0，245.0)mmHg]升高，差異有統計學意義(Z=-2.17，P=0.03)。

2.3 血清 IL-6和CRP水平

治療前2組患者血清 IL-6、CRP水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后2組患者血清IL-6、CRP均較治療前下降(P<0.05)，且觀察組較對照組的水平更低(P<0.05)。見表2。

表2 對照組和觀察組患者血清IL-6和CRP水平比較[M(P25,P75)]

2.4 全血TAS2R39 mRNA

治療前2組患者全血TAS2R39 mRNA水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；對照組患者治療后全血TAS2R39 mRNA水平與治療前比較，差異無統計學意義(P>0.05)；觀察組患者治療后全血TAS2R39 mRNA水平較治療前明顯升高，且高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：(1)與同組治療前比較，P<0.01；(2)與同時點對照組比較，P<0.01。

2.5 TAS2R39 mRNA水平與炎性因子的相關性

Spearman相關分析表明，觀察組患者治療后TAS2R39 mRNA的表達分別與 IL-6(rs=-0.728,P<0.001)和CRP(rs=-0.622，P<0.001)水平呈負相關；對照組患者治療后全血TAS2R39 mRNA的表達與炎性因子IL-6(rs=0.166,P=0.429)和CRP(rs=0.100,P=0.633)的水平無秩相關。

3 討論

ARDS是一種臨床常見的急危重癥，是由于炎癥反應失控造成的急性彌漫性肺損傷，多種肺內、肺外原因均可誘發ARDS，最常見的病因為細菌性或病毒性肺炎[9]。例如目前全球疫情依然嚴峻的新冠肺炎，重癥患者機體可出現過度的炎癥反應即“細胞因子風暴”，引起ARDS等嚴重并發癥，導致患者病情惡化甚至死亡[10-11]。我國在此次抗擊新冠肺炎疫情中取得了重大戰略成果，中西醫結合治療起到重要作用。在多版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中，喜炎平注射液被推薦用于治療重型新冠肺炎患者[12-14]。既往研究表明，喜炎平注射液有多種抗炎機制，如抑制核轉錄因子-κB/絲裂原活化蛋白激酶(nuclear transcription factor-κB/mitogen activated protein kinase，NF-κB/MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)及Janus激酶/轉錄激活因子(the Janus kinase/signal transducer of activators of transcription，JAK/STAT)等多條信號通路[15-16]；抑制多種細胞多種促炎基因的表達，包括環氧合酶-2(cyclooxygenase，COX-2)、IL-6、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[17]；減少氧化應激和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)及內皮素-1(endothelin-1，ET-1)等的生成[7,18-20]。目前有關喜炎平注射液治療ARDS的研究報道少見，在本研究中，觀察組ARDS患者聯合使用喜炎平注射液治療期間未發生明顯藥物不良反應，治療后血清炎性因子IL-6和CRP水平低于對照組、PaO2/FiO2高于對照組，這一結果提示聯合喜炎平注射液治療ARDS，臨床安全性好，能有效改善患者氧合，其機制可能與抑制炎性反應有關。

TAS2R屬于G蛋白偶聯受體，是味覺受體家族成員，人類基因組共編碼25種TAS2R亞型[3]。過去認為TAS2R只存在于口腔味蕾，僅與苦味識別相關，近年發現在呼吸、循環、免疫、消化、中樞神經及生殖等多種系統和組織中均有TAS2R表達，并且發揮不同的生物學功能[21]；呼吸系統氣道上皮細胞的TAS2R能增加氣道纖毛搏動頻率，并可作為前哨受體檢測入侵的革蘭氏陰性菌，觸發防御性殺菌反應[22]；TAS2R可減少依賴免疫球蛋白(immunoglobulinE，IgE)活化的肥大細胞釋放組胺和前列腺素D2，抑制肺巨噬細胞釋放炎性因子[23]；激活TAS2R及其下游信號通路，可舒張氣道平滑肌，作用強于β2受體激動劑[4]。因此，通過多種防御功能，TAS2R有望成為慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等氣道炎癥性疾病新的防治靶點，但TAS2R及其信號通路是否也與ARDS的發生發展相關，目前少有研究報道。本課題組前期生物信息學研究結果表明，TAS2R39可能在ARDS發生機制中發揮重要作用[24]。此外，已有研究認為苦味中藥可經TAS2R途徑遏制氣道炎癥過程[25]。喜炎平注射液屬于苦味中藥，為研究喜炎平注射液能否通過TAS2R在治療ARDS中發揮抗炎作用，本研究檢測了2組患者治療前、后全血TAS2R39 mRNA表達，結果顯示對照組ARDS患者治療前、后全血TAS2R39 mRNA的表達水平無差異，但觀察組ARDS患者經喜炎平注射液聯合治療后全血TAS2R39 mRNA表達上調且與IL-6、CRP水平均呈負相關，此外這2種炎性因子水平較治療前及對照組治療后的水平均有降低，提示喜炎平注射液可能通過上調TAS2R39表達發揮抗炎效應。

綜上所述，喜炎平注射液能改善ARDS患者的氧合功能，其機制可能是通過激活TAS2R途徑來抑制炎癥反應，故本研究結果可為喜炎平注射液輔助治療ARDS的臨床應用提供依據。但本研究尚存不足，如樣本量偏少，未納入重度ARDS患者，只檢測了全血標本TAS2R39 mRNA表達，故后續還需擴大樣本進一步深入研究。