大刺鰍人工繁殖與胚胎發育研究

方 園，吳 真，曾慶祥*，劉 斌，鐘穎良，王海華，彭進榕，黃雅貞，郭 婧

(1.贛州市水產研究所，江西 贛州 341100；2.江西省水產科學研究所，江西 南昌 330039；3.廣州市河盛匯農業科技有限責任公司，廣東 廣州 511300)

大刺鰍(Mastacembelusarmatus)屬于鱸形目(Perciformes)、刺鰍科(Mastacembelidae)、刺鰍屬(Mastacembelus)魚類[1]，主要分布在長江流域以及南方水系中[2]。大刺鰍的肌肉蛋白含量高、氨基酸種類豐富，既有較好的美食口感，也有較高的營養價值[3]。由于大刺鰍野生資源稀少、人工養殖量小，目前，其市場價格高達200元/kg。特別是近年來，部分地區由于過度非法捕撈以及水域生態環境的惡化，我國野生大刺鰍的資源量呈現日益減少的趨勢，因此，發展大刺鰍人工增養殖勢在必行。

目前，國內針對大刺鰍人工繁殖和胚胎發育特征觀察的研究只有少量報道[4-7]。本課題組近年來已經在大刺鰍池塘養殖、生物學特性、人工繁殖、仿生態養殖技術、常見病防治技術等方面開展了相關的試驗研究[8-12]，但在人工繁殖和胚胎發育方面尚未進行系統的研究，為進一步了解大刺鰍繁殖特征，突破大刺鰍規模化高效繁殖技術，掌握大刺鰍胚胎發育情況。筆者于2020年進行了3批次大刺鰍人工繁殖試驗，并觀察其胚胎發育特征。

1 材料與方法

1.1 繁殖前期準備

1.1.1 親本魚的培育與選擇 開春后，水溫穩定在18 ℃以上時，開始投喂全價配合飼料，選擇正規廠家生產的大刺鰍專用飼料，其粗蛋白含量47%以上，并在飼料中適量添加維生素E。隨著水溫的升高，逐步增加飼料投喂量，直至每天投喂量穩定在大刺鰍體重的6%左右。在人工繁殖前2周，適當減少配合飼料投喂量，以減少雌魚體內脂肪積累，保證卵子質量。

選用池塘養殖的3冬齡以上大刺鰍作親本，要求雌魚體重150 g以上、雄魚體重200 g以上。根據曾慶祥等[13]挑選方法，選擇腹部黃白色、膨大柔軟圓潤、生殖孔凸起紅潤、個體略顯粗短的雌性大刺鰍作母本，腹部皮膚灰黑、沒有明顯膨大、游動較激烈、個體粗長的雄性大刺鰍作為父本。雌雄比為5∶1。

將挑選好的大刺鰍親魚暫養在面積約20 m2且已經消毒好的水泥池中，消毒藥物選擇聚維酮碘溶液，按0.25 g/m3(有效碘10%)的劑量全池潑灑，暫養池要求池底及池壁光滑，最好貼有瓷磚，保持水深50 cm，進(排)水方便，進水管與池邊呈45°～60°夾角，使水流呈噴射狀沖擊水面，確保池水呈現循環流動狀態，同時開啟增氧機，保證池內水體中有充足的溶解氧。

1.1.2 孵化池準備 孵化池的構造與親本暫養池基本一致，先用水沖洗去除池中雜物后，使水位保持在50 cm，用10 g/m3高錳酸鉀溶液對孵化池浸泡消毒，30 min后將水排干；用清水沖洗完后將水位保持在40 cm，開啟增氧機，保證水體溶氧充足。開啟加熱棒，將加熱棒溫度設置為28 ℃，在池底放置溫度計，便于觀測和記錄水溫。

1.2 人工催產與授精

1.2.1 人工催產 采用背部肌肉注射法，分2次注射。催產藥物及劑量為：1000 IU/kg絨毛膜促性腺激素(HCG)、10 μg/kg促黃體素釋放激素A2(LRH-A2)和5 mg/kg地歐酮(DOM)，將3種催產素放入燒杯中混合均勻后待用。雌魚第1次按1 mL/kg體重的量注射，約12 h后注射第2次，第2次注射量減半，注射后將水溫加溫至29～30 ℃。雄魚不注射催產素。

1.2.2 人工授精 采用濕法授精，具體步驟：使用適量魚安定將大刺鰍親魚麻醉，用毛巾將雌性親魚魚體上的水分擦拭后擠卵，從腹部前端往生殖孔方向將卵子擠于消毒好的不銹鋼盆中。雄性親魚擠精方法類似，再利用注射器吸取擠出的精子，注入裝有生理鹽水的不銹鋼盆中，混勻后倒入放有卵子的不銹鋼盆中，并用另一個不銹鋼盆反復傾倒以充分混勻，完成授精，最后將受精卵均勻倒入準備好的孵化器、孵化池中進行孵化。孵化過程中水溫保持在28～29 ℃之間，孵化池水體的溶解氧應始終保持在5 mg/L以上，池水pH值在7.2～7.8之間。

1.3 胚胎發育觀察

人工授精后，立即取少量受精卵均勻地鋪于培養皿中，在Olympus顯微鏡下觀察，并用數碼攝像系統拍照，詳細記錄各時期的發育特征和時間，以50%以上胚胎達到某期確定為該發育過程的起始時間，從前一個發育階段到下一個發育階段之間的時間間隔為該階段的發育期間，并通過隨機觀察記錄3個培養皿進行重復觀察驗證。

在卵裂期時，每15 min觀察1次胚胎發育情況，進入囊胚期后每30 min觀察1次胚胎發育情況。

1.4 數據處理

(1)胚胎發育各階段的積溫(℃·h)=此階段胚胎發育時間(h)×水溫(℃)[14]。

(2)催產率(%)=注射催產素后成功擠出卵子的樣本數/總樣本數×100%。

(3)胚胎發育到原腸中期時統計受精卵數和總樣本卵數，受精率(%)=受精卵數/樣本卵數×100%。

(4)孵化率(%)=出苗數/樣本受精卵數×100%。

(5)游標卡尺進行測量卵徑大小、仔魚全長。

2 結果與分析

2.1 人工繁殖情況

分別于5月28日、5月30日、6月1日對大刺鰍進行人工催產繁殖，具體情況見表1。挑選的大刺鰍雌魚體長(32.3±0.05)cm，雄魚體長(44.1±0.05)cm。催產后約10 h，池底有卵子出現后，開始進行人工擠卵。擠出的大刺鰍卵子大部分為成熟卵，呈橙黃色，有少許白色，卵徑(1.94±0.05)mm，沉性卵，具黏性(圖1-a)。3次人工催產獲得的卵重平均約200粒/g，雌性親本平均懷卵量約3036粒/尾，催產率平均為99.20%，受精率平均為82.77%，孵化率平均為77.20%。

表1 人工催產情況

2.2 胚胎發育過程

在28～29 ℃水溫條件下，大刺鰍胚胎發育過程從受精卵到孵出仔魚歷時約50.5 h，主要經過受精卵、胚胎隆起、卵裂期(2細胞、4細胞、8細胞、16細胞、多細胞期、桑葚期)、囊胚期(囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期)、原腸胚期(原腸早期、原腸中期、原腸晚期)、神經胚期(神經胚期、胚孔封閉期)、器官形成期(肌節出現期、視泡期、尾芽期、肌肉效應期、心跳期)、出膜期等8個階段共22個時期。根據胚胎發育各階段的發育時間與水溫關系，得到整個胚胎發育過程總積溫約1454.4 ℃·h。各發育時期主要特征見表2。

表2 大刺鰍的胚胎發育

2.2.1 受精卵 大刺鰍的成熟卵子受精后吸水膨脹，卵徑(2.15±0.05)mm。大約10 min后，形成受精卵，受精卵呈卵圓形，色澤為金黃色或者橘黃色，極性不明顯，在受精卵內部出現多個大小不等的油球(圖1-b)，油球數隨著受精卵的發育而逐漸減少，最后形成少量且較大的油球。

2.2.2 胚胎隆起 受精大約0.6 h后，胚胎中細胞質向動物極方向集中，并向上隆起，形成帽狀的胚盤(圖1-c)。

2.2.3 卵裂期 大刺鰍受精卵卵裂只分布在動物極部分，是典型的不完全卵裂方式。受精后1.2 h，受精卵開始分裂，形成2個大小相等形狀相近的細胞球(圖1-d)。受精1.8 h后，出現第2次分裂，該分裂與第1次分裂方向垂直，形成4個大小相近的細胞球，該時期為4細胞期(圖1-e)。受精后3 h，胚胎開始第3次分裂，形成體積較小的8個分裂球(圖1-f)。受精后3.4 h，胚盤開始第4分裂，形成16個小分裂球，該時期為16細胞期(圖1-g)。受精后4.6 h，胚盤分列出多個分裂球，為多細胞期(圖1-h)。受精后7.0 h，胚盤繼續分裂成桑葚狀，為桑葚期(圖1-i)。

2.2.4 囊胚期 受精后8.2 h，由于胚盤持續分裂，許多個分裂細胞緊密粘接，顯微鏡下難以看出細胞間隙，形成囊胚狀突起結構，此時為囊胚早期(圖1-j)。受精后8.7 h，囊狀突起高度降低，呈下包趨勢覆蓋在卵黃表面，此時為囊胚中期(圖1-k)。受精后9.6 h，囊狀突起呈明顯下包狀態，囊胚層變扁平，即囊胚晚期(圖1-l)。

2.2.5 原腸胚期 受精后13.2 h，囊胚層繼續下包至1/2處，胚層邊緣細胞集中形成胚環結構，此時為原腸胚早期(圖1-m)。受精后16.4 h，下包至2/3處，胚盾出現，進入原腸胚中期(圖1-n)。受精后21.8 h，下包至3/4，胚盾延長，形成胚孔結構，此時為原腸晚期(圖1-o)。

2.2.6 神經胚期 受精后25.5 h，胚盤繼續下包至4/5，未包被的卵黃形成栓狀結構，即卵黃栓。胚盾繼續延長，形成神經板。此時為神經胚期(圖1-p)。受精后29.8 h，進入胚孔封閉期(圖1-q)。

2.2.7 器官形成期 受精后32.5 h，胚體中部出現肌節，此時為肌節出現期(圖1-r)。受精后33.8 h，進入視泡期，這時胚體中出現橢圓形黑點(圖1-s)。受精后35.6 h，尾節呈芽狀出現，此時為尾芽期(圖1-t)。受精后37.7 h，配體出現顫動，此時為肌肉效應期(圖1-u)。受精后40.9 h，胚體中出現明顯的類似管狀心臟，微弱顫動，即進入心跳期(圖1-v)。

2.2.8 出膜期 受精后50.5 h，胚體變長，形成橢圓形，尾巴破膜伸出。剛出膜的仔魚肉眼看除2個黑色眼囊外全身透明，仔魚全長平均(6.52±0.05)mm，卵黃囊寬(1.38±0.05)mm、長(2.72±0.05)mm。顯微鏡下仔魚嘴巴會進行緩慢咬合，心跳有規律，全身紅色血管流動清晰(圖1-w)。

a.成熟卵子；b.受精卵；c.胚胎隆起；d.2細胞期；e.4細胞期；f.8細胞期；g.16細胞期；h.多細胞期；i.桑葚期；j.囊胚早期；k.囊胚中期；l.囊胚晚期；m.原腸早期；n.原腸中期；o.原腸晚期；p.神經胚期；q.胚孔封閉期；r.肌節出現期；s.視泡期；t.尾芽期；u.肌肉效應期；v.心跳期；w.出膜期

3 討論

3.1 大刺鰍的人工繁殖

對于魚類催產激素的使用，目前廣泛使用的有HCG、LRH-A2、DOM、PG等激素。在激素使用比較研究中發現，魚類對HCG、LRH-A2、DOM這3種激素的混合使用敏感度最高，催產率和孵化率都顯著優于單一激素或其他組合。針對大刺鰍人工繁殖技術，目前的研究也發現混合使用HCG、LRH-A2、DOM這3種催產激素的催產效果最好[15]。同樣，本研究嘗試通過2次注射HCG、LRH-A2和DOM混合物，觀察大刺鰍的產卵效率，結果顯示：催產效率明顯上升，催產后約10 h后即可擠出較為成熟的卵子，產卵量約3036粒/尾，表明通過2次激素刺激能提升大刺鰍的產卵效率。

另外，為初步探索大刺鰍催產的最高溫度，筆者將大刺鰍在29～30 ℃的催產溫度下進行試驗，發現大刺鰍亦能有效催產。有研究發現，大刺鰍繁殖時間主要是在春夏季節的4～7月[16]，但是在8月底、9月初的水溫較高時，大刺鰍仍會高效產卵[17]。這說明相對于四大家魚，大刺鰍親本的產卵溫度范圍較廣，具備適當抵抗環境惡化的能力。

催產出的大刺鰍成熟卵子呈橙黃色、易沉底，具有弱黏性，但隨時間的推移，其黏性會降低。大刺鰍卵徑(1.94±0.05)mm，這與薛凌展[7]和李曉雙[6]等的研究結果基本一致。卵重平均200粒/g，雌性親本平均懷卵量約3036粒/尾，這與劉霆[18]和周惠強[19]等調查的大刺鰍懷卵量相近。

3.2 大刺鰍的胚胎發育

本研究通過在28～29 ℃水溫條件下，培養觀察大刺鰍胚胎發育情況，將大刺鰍胚胎發育過程區分為受精卵、胚胎隆起、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期、器官形成期、出膜期等8個階段22個時期，符合“卵裂-胚體形成-器官分化-孵化出膜”的發育順序。

水溫是魚類胚胎發育時間的重要影響因子[20]，并且在適當的溫度范圍，孵化效率與溫度呈正相關[21-22]。薛凌展[7]研究提出：在(25±1)℃的孵化條件下，大刺鰍受精卵歷時65 h孵化出膜，而本試驗中大刺鰍的胚胎在28～29 ℃水溫下發育時間約52 h，減少了約13 h，這為大刺鰍規模化苗種繁殖節約了時間，提高了孵化效率，且孵化率達77.20%，說明大刺鰍胚胎發育在28～29 ℃溫度下的孵化效率較高，28～29 ℃是大刺鰍胚胎發育的適宜溫度。另外，筆者發現大刺鰍胚胎發育總積溫約1454.4 ℃·h，該結果略低于薛凌展[7]的研究(1624.5±58.12)℃·h，這可能與孵化溫度的升高有關。本研究詳細記錄了28～29 ℃環境下大刺鰍胚胎發育各階段的主要特征及發育時間，為今后深入開展大刺鰍的生物學、胚胎學等研究提供了重要的參考資料。另外，本研究提出的大刺鰍人工繁殖技術，可在生產上指導大刺鰍規模化高效繁殖，加快大刺鰍產業發展的進程，增加漁民的養殖收入，促進特色高效水產養殖業的發展。