SOD-肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白的畢赤酵母重組菌株構(gòu)建及表達(dá)

葉芬，周建森，郭靜科，劉樹(shù)滔

(1.福州大學(xué)生物工程研究所，福建 福州 350002；2.福州大學(xué)至誠(chéng)學(xué)院食品與生物工程系，福建 福州 350002)

0 引言

胞外超氧化歧化酶(EC-SOD)較為特殊，它具有獨(dú)特的C端肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(heparin binding domain，HBD).該結(jié)構(gòu)域具有肝素親和性，可特異性地與富含肝素的細(xì)胞表面[5]結(jié)合.因此，EC-SOD可能是保護(hù)細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白免受超氧化物介導(dǎo)的氧化損傷的第一道防線[6]，在預(yù)防和治療氧化損傷相關(guān)的疾病方面，如高脂肪飲食誘發(fā)的肥胖、炎癥和胰島素抵抗[7]等，都具有重大的應(yīng)用潛力.EC-SOD有著很高的應(yīng)用價(jià)值，但是一方面天然EC-SOD在生物體內(nèi)的含量很低，較難通過(guò)分離提取的方式獲得[8-9]，另一方面，通過(guò)基因重組表達(dá)的方式獲得的EC-SOD的活力不高[6, 10-12]，例如，范立強(qiáng)等[10]研究的重組EC-SOD在粉紋夜蛾Tn-5Bl-4細(xì)胞中表達(dá)的比活力只有260 U·mg-1，Shrestha等[11]發(fā)現(xiàn)重組EC-SOD的表達(dá)水平只有220 U·mL-1的酶活力，Bae等[12]的研究顯示重組EC-SOD表達(dá)的比活力為124.7 U·mg-1.這些都限制了EC-SOD的推廣和應(yīng)用.

EC-SOD基因重組蛋白表達(dá)活力不高的原因可能是由于缺乏適當(dāng)?shù)恼郫B和成熟機(jī)制[9].由于EC-SOD本質(zhì)上也是Cu, Zn-SOD，與其他Cu, Zn-SOD明顯不同的只是EC-SOD具有的獨(dú)特C端肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)，而Cu, Zn-SOD具有非常優(yōu)良的重組蛋白高水平表達(dá)，例如鄭屹峰等[13]發(fā)現(xiàn)Cu, Zn-SOD在重組畢赤酵母中的表達(dá)可達(dá)895 U·mL-1.因此解決EC-SOD表達(dá)活力不高的一個(gè)方法是采用Cu, Zn-SOD與HBD的融合表達(dá).基于這種思路，本研究嘗試將人源EC-SOD的HBD與Cu, Zn-SOD編碼序列的基因融合和密碼子優(yōu)化，并導(dǎo)入畢赤酵母，構(gòu)建高水平表達(dá)SOD-HBD融合蛋白的畢赤酵母工程菌，從而為EC-SOD的推廣與應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1) 菌株與質(zhì)粒.P.pastorisX-33、pPICZαA表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；E.coliDH5α購(gòu)自北京Solarbio公司.

2) 儀器與設(shè)備.S1000型PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)BIO-RAD公司；AE-6450型蛋白質(zhì)電泳儀，日本ATTO公司；DYY-5型核酸電泳儀，北京六一儀器廠；JS-380A型凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司；U-1900型紫外分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；電轉(zhuǎn)化儀，美國(guó)BIO-RAD公司.

3) 主要試劑.DNA marker DL5000、EcoR I、XbaI、SacI、PCR mix均購(gòu)自日本Takara公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司；UNIQ-10柱離心式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、NBT所用試劑等購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑藥品均為分析純.

1.2 方法

1) 酵母最適密碼子的優(yōu)化.從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得人源Cu, Zn-SOD的CDS基因序列與人源EC-SOD的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因序列，利用密碼子具有簡(jiǎn)并性的特點(diǎn)，通過(guò)畢赤酵母的密碼子偏好性數(shù)據(jù)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，選取EcoR I和XbaI作為酶切位點(diǎn)，并使得GC含量在總序列中所占比例為40%～60%，將目的基因委托上海生物工程股份有限公司合成.

2) 真核表達(dá)載體pPICZaA-SOD-HBD的構(gòu)建.將合成的目的基因與載體pPICZaA分別進(jìn)行EcoR I和XbaI雙酶切，通過(guò)試劑盒回收的目的基因片段與pPICZaA載體片段，再通過(guò)T4 DNA連接酶, 16 ℃過(guò)夜連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPICZaA-SOD-HBD.隨后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中.抽提質(zhì)粒并進(jìn)行核酸測(cè)序與雙酶切鑒定.

3) 表達(dá)菌株X33/pPICZaA-SOD-HBD的構(gòu)建.將含有表達(dá)載體pPICZaA-SOD-HBD的E.coliDH5α的菌株進(jìn)行高純度質(zhì)粒抽提，SacI酶切線性化，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33表達(dá)菌株，菌落PCR鑒定重組菌，其中設(shè)計(jì)載體通用引物序列為： AOX 1上游引物5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，AOX 1下游引物5’-GGCAAATGGCATTCTGACATCCTC-3’.PCR設(shè)置條件為： 94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；補(bǔ)充延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存.鑒定成功的菌株選取工程菌命名為X33/pPICZaA-SOD-HBD.

4) 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).挑取圓潤(rùn)飽滿的單菌落接種于20 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，直至OD600=2～6；將菌液以1.0%的體積分?jǐn)?shù)接種到20 mL YP液體培養(yǎng)基，添加0.5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)；30 ℃，200 r·min-1，培養(yǎng)3 d，每隔1 d取樣并補(bǔ)加甲醇保持其濃度；10 400 r·min-1，離心2 min，制備發(fā)酵上清液，以未誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照，通過(guò)鹽酸羥胺法[14]測(cè)定上清液的SOD酶活力，SDS-PAGE鑒定，從相對(duì)分子質(zhì)量的角度進(jìn)一步鑒定目的融合蛋白的表達(dá).

5) 融合蛋白搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化.本研究對(duì)融合蛋白搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

① 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化： 將菌液以1.0%的體積分?jǐn)?shù)接種到20 mL YP液體培養(yǎng)基中，添加0.5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，30 ℃，200 r·min-1，將搖瓶誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至7 d，每隔1 d取樣1 mL并補(bǔ)加甲醇保持其濃度，10 400 r·min-1離心2 min，取上清液，于4 ℃保存.所有樣品均進(jìn)行SOD酶活力、蛋白含量的測(cè)定，SDS-PAGE電泳和NBT活性電泳[15]驗(yàn)證，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn).

② 誘導(dǎo)劑量的優(yōu)化： 將菌液以1.0%的體積分?jǐn)?shù)接種到20 mL YP液體培養(yǎng)基，甲醇誘導(dǎo)劑量各調(diào)至體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，30 ℃，200 r·min-1，搖瓶誘導(dǎo)3 d，取樣1 mL并補(bǔ)加甲醇保持其濃度，10 400 r·min-1離心2 min，取上清液，于4 ℃保存.進(jìn)行SOD酶活力測(cè)定，SDS-PAGE電泳，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn).

③ 初始pH值的優(yōu)化： 將菌液以1.0%的體積分?jǐn)?shù)接種到20 mL YP液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)至4.8～5.8，添加0.5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，30 ℃，200 r·min-1，搖瓶誘導(dǎo)3 d，取樣1 mL并補(bǔ)加甲醇保持其濃度，各指標(biāo)的測(cè)試同2)，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn).

6) 融合蛋白搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)條件的正交分析.設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)[16]，分析誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑量和初始pH值對(duì)重組蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，以酶活為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，使用鹽酸羥胺法測(cè)定酶活.

7) 主要檢測(cè)方法.

① 聚丙烯酰銨凝膠電泳(SDS-PAGE)： 取1 mL菌液，10 400 r·min-1離心2 min收集上清.將上清與SDS-PAGE電泳上樣處理液等體積混勻，沸水浴煮5 min.在分離膠質(zhì)量濃度為0.125 g·mL-1、濃縮膠質(zhì)量濃度為0.040 g·mL-1，電壓120 V條件下進(jìn)行電泳.電泳后以0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的R250考馬斯亮藍(lán)染色，最后置于脫色液中脫色至蛋白條帶清晰.

② 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)： 具體操作步驟與SDS-PAGE電泳相似，區(qū)別在于所配置的凝膠、上樣處理液及緩沖溶液均不含有SDS與巰基乙醇，且樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)沸水浴處理.

③ 氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法： 將上清液進(jìn)行Native-PAGE，隨后將凝膠通過(guò)NBT進(jìn)行特異性染色[15].

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

采用 SnapGene 4.0.2、Excel 2010、Origin 2019 64Bit、SPSS 24軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，做載體圖譜、序列比對(duì)及標(biāo)準(zhǔn)差等，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(M±SD)”表示，以0.01

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)載體pPICZaA-SOD-HBD的構(gòu)建

480 bp的目的基因SOD-HBD與3 526 bp的載體pPICZaA構(gòu)建后的表達(dá)載體pPICZaA-SOD-HBD全長(zhǎng)序列為4 016 bp.經(jīng)過(guò)核酸測(cè)序，序列結(jié)果與預(yù)期一致，如圖1所示.雙酶切鑒定電泳圖譜顯現(xiàn)3.5 kb附近的載體片段和486 bp附近的目的片段，如圖2所示.這些結(jié)果表明pPICZaA-SOD-HBD表達(dá)載體構(gòu)建成功.

圖1 pPICZaA-SOD-HBD載體構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction of pPICZaA-SOD-HBD vector

圖2 pPICZaA-SOD-HBD酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of pPICZaA-SOD-HBD by restriction enzyme

2.2 鑒定表達(dá)菌株X33/pPICZaA-SOD-HBD

pPICZaA-SOD-HBD線性化結(jié)果如圖3所示，在4.0 kb左右出現(xiàn)明顯的單一條帶，表明SacI單酶切的質(zhì)粒pPICZaA-SOD-HBD已經(jīng)成功線性化.采用菌落PCR法對(duì)重組畢赤酵母菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示.PCR電泳圖中重組菌株在1 000 bp左右出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期的968 bp一致，對(duì)照組的原始畢赤酵母菌株未出現(xiàn)明顯條帶，表明pPICZaA-SOD-HBD已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到PichiapastorisX33表達(dá)菌株中.

圖3 pPICZaA-SOD-HBD線性化結(jié)果Fig.3 Results of pPICZaA-SOD-HBD linearization

圖4 X33/pPICZaA-SOD-HBD的PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of X33/pPICZaA-SOD-HBD by PCR

2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，離心取得上清液，利用鹽酸羥胺法測(cè)SOD酶活力篩選出酶活高的重組菌株，如圖5所示，24號(hào)菌株中第6號(hào)菌株在搖瓶水平的酶活力達(dá)到381 U·mL-1，故選取第6號(hào)菌株進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn).

甲醇誘導(dǎo)后的第6號(hào)菌株，取0～3 d的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳(見(jiàn)圖6).由圖6可見(jiàn), 大約在25 ku處出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，而且條帶從無(wú)到有顏色逐漸變深.該蛋白條帶的相對(duì)分子質(zhì)量范圍與預(yù)期的蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量相當(dāng).說(shuō)明SOD-HBD融合蛋白很有可能成功在畢赤酵母中進(jìn)行了分泌表達(dá).

圖5 重組菌株篩選結(jié)果(n=3) Fig.5 Screening results of recombinant strains (n=3)

圖6 融合蛋白SOD-HBD的誘導(dǎo)表達(dá) Fig.6 Induced expression of fusion protein SOD-HBD

2.4 融合蛋白表達(dá)條件的探究

2.4.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響

不同誘導(dǎo)時(shí)間下的SOD-HBD表達(dá)情況如圖7所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活與比活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)誘導(dǎo)到第5天時(shí)酶活達(dá)到最高的1 072 U·mL-1，是初始酶活的2.81倍，且比活力為591 U·mg-1.可能的原因是菌體在誘導(dǎo)前期，為適應(yīng)新的生存環(huán)境，前期分泌表達(dá)的外源蛋白較少.當(dāng)逐漸適應(yīng)該環(huán)境后，隨著菌株不斷的生長(zhǎng)與繁殖，融合蛋白的表達(dá)量也會(huì)不斷提高.但在誘導(dǎo)后期，細(xì)胞內(nèi)的代謝廢物等也會(huì)逐漸積累，同時(shí)伴隨著菌株的衰退就會(huì)導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)量降低[17].

不同誘導(dǎo)時(shí)間下的SOD-HBD電泳圖如圖8所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白電泳條帶由淺到深，且在第5天時(shí)顏色最深，第5天后顏色逐漸變淺；與此同時(shí)，在相對(duì)分子質(zhì)量25 ku左右的蛋白條帶也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)，與之前的酶活力變化趨勢(shì)相對(duì)應(yīng).

圖7 不同誘導(dǎo)時(shí)間下的SOD-HBD表達(dá)情況(n=3)Fig.7 SOD-HBD expression under different induction time (n=3)

圖8 不同誘導(dǎo)時(shí)間下的SOD-HBD電泳圖Fig.8 SOD-HBD electrophoretogram under different induction time

NBT活性電泳染色圖如圖9所示，誘導(dǎo)了1～7 d的樣品及市售SOD均出現(xiàn)明顯的白色條帶，而誘導(dǎo)0 d的樣品未出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，表明重組蛋白具有SOD特性；在SDS的作用下該重組蛋白仍然具有SOD特性，且可以看到白色條帶在25 ku左右，如圖10所示，符合預(yù)期的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量.

圖9 NBT活性電泳染色圖Fig.9 NBT reactive electrophoretic staining

圖10 SDS-PAGE與NBT活性電泳相結(jié)合染色圖Fig.10 SDS-PAGE combined with NBT active electrophoresis staining

2.4.2 甲醇誘導(dǎo)劑量對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響

當(dāng)甲醇誘導(dǎo)劑量的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%時(shí)酶活力最高，為795 U·mL-1，是初始酶活的2.09倍, 如圖11所示; 且如圖12所示，誘導(dǎo)劑量的體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)的蛋白條帶濃度最深，說(shuō)明甲醇可以誘導(dǎo)酵母進(jìn)行蛋白的表達(dá)，但是酵母對(duì)甲醇的耐受性是有限的，所以甲醇濃度過(guò)低可能使蛋白表達(dá)不完全，濃度過(guò)高可能抑制了菌體的生長(zhǎng)，從而影響外源蛋白無(wú)法長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)[18].

圖11 不同誘導(dǎo)劑量下的酶活情況(n=3)Fig.11 Enzyme activity at different induced doses (n=3)

圖12 不同誘導(dǎo)劑量下的蛋白電泳圖Fig.12 Electrophoretic images of different induced doses of protein

2.4.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響

培養(yǎng)基初始的pH值對(duì)微生物的繁殖與產(chǎn)物合成具有一定影響，調(diào)整不同的pH值對(duì)融合蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，如圖13所示，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值調(diào)整為5.4時(shí)的酶活力最高，可以達(dá)到673 U·mL-1，提高了76.6%.如圖14所示，初始pH=5.4時(shí)的條帶濃度最深，表明過(guò)酸過(guò)堿會(huì)直接影響菌體的生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體死亡而將蛋白酶釋放，使得外源蛋白發(fā)生降解[13].

圖13 不同初始pH值下的酶活情況(n=3)Fig.13 Enzyme activity at different initial pH values (n=3)

圖14 不同初始pH值下的蛋白電泳圖Fig.14 Electrophoretic images of proteins at different initial pH values

2.4.4 融合蛋白表達(dá)條件的正交分析

為獲得最適搖瓶表達(dá)條件，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在3因素中選取3個(gè)水平, 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1～3所示.

表1 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的因素及水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀比較結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

如表2所示，4號(hào)實(shí)驗(yàn)組酶活最高，可達(dá)1 120.2 U·mL-1，是初始酶活的2.94倍；正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，各個(gè)因素對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響次序依次為： 誘導(dǎo)時(shí)間>誘導(dǎo)劑量>初始pH值.最佳搖瓶條件為A2B1C2，即誘導(dǎo)時(shí)間為5 d，初始pH值為5.2，誘導(dǎo)劑量體積分?jǐn)?shù)為1.0%.

根據(jù)表3所示的方差分析結(jié)果，表明誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白的表達(dá)水平有顯著性，初始pH值范圍為5.2～5.6和誘導(dǎo)劑量的體積分?jǐn)?shù)范圍在0.5%～1.5%對(duì)重組蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性.

3 結(jié)語(yǔ)

本研究利用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建出X33/pPICZaA-SOD-HBD表達(dá)菌株，并通過(guò)甲醇誘導(dǎo)篩選出酶活力達(dá)到381 U·mL-1的菌株.為進(jìn)一步提高該融合蛋白的表達(dá)量，本研究進(jìn)行了單因素與正交實(shí)驗(yàn)，單因素結(jié)果表明，誘導(dǎo)時(shí)間為第5天時(shí)酶活是初始酶活的2.81倍，比活力為591 U·mg-1，甲醇誘導(dǎo)劑量體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)的酶活是初始酶活的2.09倍；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為5.4時(shí)酶活提高了76.6%.通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得最佳搖瓶條件, 誘導(dǎo)時(shí)間為5 d，初始pH值為5.2，誘導(dǎo)劑量的體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，酶活可達(dá)到1 120.2 UmL-1，是初始酶活的2.94倍.總體而言，本研究提高了重組EC-SOD的蛋白表達(dá)水平，在一定程度上解決了其難提取且表達(dá)量低的問(wèn)題，后期實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究融合蛋白分離純化和理化性質(zhì)，為重組EC-SOD蛋白的推廣與應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)與實(shí)踐基礎(chǔ).