諾爾斯鏈霉菌固態發酵條件的優化研究

谷 軍，張曉彥，于德水

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

鏈霉菌是一種應用比較廣泛的微生物，以菌體發酵產生的刺激代謝產物為主，在農業產品中多用于生長調節抗病毒等制劑。諾爾斯鏈霉菌(streptomyces noursei)是高等的放線菌，其產生的代謝產物在水稻條紋葉枯病、水稻立枯病、大豆根腐病防治中具有良好的應用效果[1]。

微生物發酵產品多采用液體深層發酵的生產工藝，此工藝和發酵設備較為成熟，產品純度較高[2-4]，工藝條件容易控制，發酵罐的體積較大，生產穩定。但是液體深層發酵存在一些缺點，如發酵產品不能直接使用，需要提取，因而生產成本高，由于排出大量廢水，還需要解決環境污染問題等。相反，固體發酵生產成本低，產品孢子數高，發酵過程中產生的代謝產物蓄積在發酵載體中[5]，故而效果更加明顯。近年來，部分產品采用固體發酵生產，獲得的技術經濟指標都優于液體深層發酵工藝[6]，因此固體發酵逐漸受到人們的重視，固體發酵設備也取得了一定的發展。為了開發諾爾斯鏈霉菌菌劑產品，需要對該菌的固體發酵生產工藝條件進行研究，促使其實現生產應用。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株。諾爾斯鏈霉菌(Streptomyces noursei)，黑龍江省科學院微生物研究所保藏。

培養基。試管培養基：可溶性淀粉2%，KNO30.1%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.05%，瓊脂2%。液體種子培養基：玉米淀粉1%，豆餅粉1% ，NaCL 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.01%，MgSO4·7H2O 0.01%。固體種子培養基：玉米粉50 g，麩皮20 g，豆餅粉20 g，稻殼粉10 g，水50 g。

1.2 方法

1.2.1 諾爾斯鏈霉菌固體培養方法

液體種子的培養方法：將100 mL液體種子培養基裝入到500 mL三角瓶中，8層紗布封口，121℃滅菌30 min，冷卻后接入諾爾斯鏈霉菌孢子，30℃，搖床培養3 d，搖床轉速為150 r/min。

固體種子的培養方法：將配好的固體種子培養基50 g裝入到500 mL三角瓶中，瓶口直徑4.5 cm，紗布封口，滅菌冷卻后接入斜面試管菌種，恒溫靜止培養5 d，從第2 d起每天搖晃1次。

分生孢子的計數方法：測定固體發酵產品的含水量，精確稱取鏈霉菌的固體發酵產品，稀釋定容100 mL，加入到放有玻璃珠的三角瓶中，放入到搖床上震蕩30 min后得到孢子懸液，利用血球計數器進行孢子量計數。

諾爾斯鏈霉菌固體發酵培養：將配好的固體發酵培養料50 g裝入到500 mL三角瓶中，瓶口直徑4.5 cm，8層紗布封口，121℃滅菌30 min，滅菌冷卻后接入菌種，恒溫靜止培養6～9 d，發酵溫度為30℃。從第2 d起，為使發酵均勻，每天搖瓶1次。

1.2.2 固態發酵培養基的初篩

固態發酵所用原料廣泛，常為農業副產物，以麩皮、玉米粉、稻殼粉、米糠等作為發酵載體，物料含水量35%，添加一些豆餅粉、無機鹽等進行固體發酵。采用minitab軟件中Plackat Burman應用，對初始發酵培養基中的幾個因素進行考察。

表1 培養基初篩因素水平表Tab.1 Factor level table of primary screening of medium

1.2.3 培養基優化

對諾爾斯鏈霉菌固體發酵的重要影響因子，即豆餅粉、麩皮、無機鹽進行優化。采用minitab響應面分析功能，對諾爾斯鏈霉菌的固體發酵培養基進行優化。試驗安排如表2。

表2 培養基優化因素水平表Tab.2 Factor level table of medium optimization

1.2.4 發酵條件的優化

分別檢測不同發酵時間(6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d)、不同發酵溫度(24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、不同的物料含水量(20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%)、不同通氣量(500 mL三角瓶物料裝量分別為25 g、50 g、75 g、100 g)、不同接種量(2%、4%、6%、8%、10%)對固體發酵產生分生孢子的影響。

2 結果與分析

2.1 諾爾斯鏈霉菌發酵培養基初篩

分別選取麩皮、米糠、玉米粉、稻殼粉作為發酵載體，采用正交設計方法進行篩選優化。

可以看出，各個因子的效應排序為載體>豆餅粉>麩皮>磷酸二氫鉀>玉米粉>硫酸銨>硫酸鎂。玉米芯粉為負效應。

確定載體為玉米粉，填料為豆餅粉、麩皮、磷酸氫二鉀、硫酸銨。

表3 正交試驗結果L16(14×27)Tab.3 Results of orthogonal experiment L16(14×27)

圖1 各個因子均值主效應圖Fig.1 Main effect diagram of each factor mean value

2.2 培養基優化

對諾爾斯鏈霉菌的重要影響因子，即豆餅粉、麩皮、無機鹽，采用minitab軟件中的響應面分析功能進一步確定其最佳的響應濃度。

表4 試驗結果表Tab.4 Test results

從實驗結果的數據分析和效應圖中可以看出，主要影響因子排序為：豆餅粉>麩皮>無機鹽。通過軟件分析計算得出，培養基的優化組合為豆餅粉6.28%、麩皮10 %、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%，載體為玉米粉。

2.3 不同類型種子對諾爾斯鏈霉菌固體發酵的影響

從發酵結果看出(圖2)，液體種子和固體種子對諾爾斯鏈霉菌固體發酵產生分生孢子數的影響不大。

注：不同字母(a、b)表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖2 種子類型對固體發酵結果的影響Fig.2 Effect of the results of solid fermentation of seed type

2.4 發酵時間對諾爾斯鏈霉菌固體發酵的影響

在發酵時間的工藝優化試驗中，發酵試驗結果如圖3所示。

圖3 不同發酵時間的發酵產量情況(109cfu/g)Fig.3 Different fermentation time of fermentation production situation(109cfu/g)

從圖3可以看出，發酵前期(6 d以前)，諾爾斯鏈霉菌主要生長菌絲，第6 d開始產生孢子，第7 d、8 d孢子數快速成熟，第9 d達到高峰，第10 d、11 d孢子數增加不顯著。

2.5 發酵溫度條件對諾爾斯鏈霉菌發酵的影響

從圖4的諾爾斯鏈霉菌固體發酵結果可以看出，發酵溫度對諾爾斯鏈霉菌的生長呈顯著影響， 最適發酵溫度為30℃。

圖4 不同發酵溫度對固體發酵生產結果的影響Fig.4 Effect on the results of solid fermentation production of fermentation temperature

2.6 原料含水量對諾爾斯鏈霉菌發酵的影響

試驗結果如圖5 所示，在諾爾斯鏈霉菌固體發酵過程中，適宜含水量為25%～35%，35%的含水量實驗效果最好，含水量超過40%，發酵效果不好。

圖5 原料含水量對固體發酵結果的影響Fig.5 Influence on the results of solid fermentation of the water content of raw materials

2.7 通氣量對諾爾斯鏈霉菌固體發酵的影響

在諾爾斯鏈霉菌固體發酵試驗中，研究不同通氣量對諾爾斯鏈霉菌固體發酵產生孢子的影響，發酵試驗結果如圖6。

圖6 不同通氣量的固體發酵生產情況Fig.6 Solid fermentation production situation of different ventilation rates

從圖6可以看出，通氣量對發酵結果有較大的影響，通氣量越大，固體發酵產生孢子的能力越強。

2.8 接種量對諾爾斯鏈霉菌固體發酵的影響

從圖7可以看出，接種量對發酵結果有很大的影響，但在發酵后期，即第8 d數據單因子分析中發現，接種量4%～10%對發酵結果影響不大。

圖7 不同接種量的固體發酵生產情況Fig.7 Solid fermentation production situation of different inoculation amounts

3 結果與討論

近年來，諾爾斯鏈霉菌作為生防產品受到越來越廣泛的關注，采用固體發酵生產微生物制劑，使用原料為農副產品，原料成本較低。固體發酵過程產生的孢子及微生物生長過程中產生的有益的代謝產物都存在于產品中，因而產品田間使用效果更好。研究表明，諾爾斯鏈霉菌固體發酵的最優培養基原料配比為：豆餅粉6.28%、麩皮10.15%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%，載體為玉米粉，水分35%，自然pH值，液體菌種和固體菌種均可，發酵時間為9 d左右，培養溫度為30℃，可將其用于生產實踐。