猴頭菇提取物的質量標準研究

◎ 李美珍，陳炎歡，馮華業，黃綺敏，黃照榮

（無限極（中國）有限公司，廣東 江門 529100）

猴頭菇（Hericium erinaceus）提取物是以猴頭菇為原料，經提取、過濾、濃縮、干燥等工序制成的提取物。主要作為膳食補充劑，也廣泛用于食品、保健食品行業。猴頭菇提取物具有抗氧化、保護胃黏膜的作用[1-5]。

目前在國內外均未有猴頭菇提取物相關的質量標準。多數植物提取物企業執行的都是自身的企業標準。由于沒有統一的質量標準，猴頭菇提取物質量要求差異大，產品質量無法保證，不利于行業的發展。因此，建立猴頭菇提取物質量標準，對進一步規范猴頭菇提取物的生產、銷售具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇提取物（適量猴頭菇藥材加8倍量水煎煮3次，合并濾液，70 ℃減壓濃縮，經噴霧干燥而得）。10批猴頭菇提取物來源于3個廠家，編號1～10。腺苷標準品（CAS號58-61-7，批號110879-201703），中國食品藥品檢定研究院，含量以99.9%計；甲醇為色譜純（德國 Merck公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.2 儀器與設備

HP1200 型高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器，美國Agilent公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官測定

取本品嗅其氣味、嘗其滋味；另取試樣適量置于白色瓷盤中觀察其色澤、外觀，并檢查有無異物。

1.3.2 薄層色譜鑒別

（1）對照品溶液配制。取2.0 mg腺苷溶解于2.0 mL甲醇中，制成1 mg·mL-1的腺苷對照品溶液。

（2）供試品溶液配制。取本品粉末約5.0 g，置于錐形瓶中，加入90%甲醇30 mL，加熱回流提取30 min，取出放冷，過濾并蒸干濾液，殘渣加熱水10 mL溶解，放冷，用石油醚（60～90 ℃）提取2次，每次20 mL，棄去石油醚液、水液，用水飽和正丁醇提取3次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，搖勻，即得。

（3）薄層色譜測定。分別吸取對照品溶液1 μL，供試品溶液5 μL，點于同一硅膠板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-異丙醇-水-濃氨溶液（8∶2∶6∶0.3∶0.2，體積比）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，應顯相同的熒光淬滅斑點。

1.3.3 理化指標測定

水分按照《食品安全國家標準 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）的第一法進行測定。灰分按照《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）規定的方法進行測定。粒度按照《中華人民共和國藥典（2020版）》第四部通則中“粒度和粒度分布測定法”第二法（篩分法）進行測定，過100目篩。

1.3.4 腺苷的含量測定

（1）對照品溶液制備。精密稱取腺苷對照品約2 mg于100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，即得。

（2）供試品溶液制備。精密稱取本品約2.0 g于50 mL小燒杯中，加水40 mL，加熱溶解，取出放至室溫，轉移至50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，用0.45 μm的針式過濾器過濾，取續濾液，即得。

（3）色譜條件。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：以甲醇為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫；波長260 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；進樣量5 μL；理論塔板數按腺苷峰計算應不低于5 000。

表1 梯度洗脫條件表

（4）線性關系考察。精密稱取腺苷對照品2.220 mg置于50 mL容量瓶中，按1.3.4中（1）項下制備方法加50%甲醇溶解制成儲備液，再精密吸取該儲備液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL分別至10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，按1.3.4中（3）項下色譜條件分析，測定峰面積。以腺苷對照品的濃度（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標，求得回歸方程。

（5）精密度試驗。精密稱取1.3.4中（1）項下制備的腺苷對照品溶液（濃度22.133 4 μg·mL-1），重復進樣6次，分別計算峰面積及保留時間的RSD值。

（6）穩定性試驗。取猴頭菇提取物（批號200401）按1.3.4中（2）項下制備的供試品溶液，按1.3.4中（3）項下色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h測定，計算供試品中腺苷峰面積。

（7）重復性試驗。取猴頭菇提取物（批號200401）同一天內按1.3.4（2）項下制備的6份供試品溶液，按1.3.4中（3）項下色譜條件測定，計算腺苷平均含量、RSD及分離度。

（8）回收率試驗。取猴頭菇提取物（批號200401，腺苷含量為0.025%）精密稱定約1.0 g于9個50 mL小燒杯中。另取腺苷對照品（純度99.7%）4.882 mg置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容（此對照品溶液含腺苷48.673 5 μg·mL-1），分別吸取該對照品溶液2.5mL（以腺苷計121.683 8 μg）、5.0 mL（以腺苷計243.367 7 μg）、7.5 mL（以腺苷計365.051 6 μg），分3組加入含樣品的9個50 mL小燒杯中，按1.3.4中（2）項下制成供回收率測定用供試品溶液，按1.3.4中（3）項下色譜條件測定，計算腺苷的回收率及RSD值。

（9）樣品含量測定。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶各5 μL，注入液相色譜儀，測定。根據所得對照品溶液和供試品溶液色譜圖中腺苷峰面積計算供試品中待測組分腺苷含量。

1.3.5 重金屬指標測定

重金屬指標按照《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》（GB 5009.268—2016）第一法電感耦合等離子質譜法（ICP-MS）規定的方法測定鉛、砷、汞、鎘含量。

1.3.6 微生物檢查

菌落總數的測定按《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）規定的方法進行；霉菌和酵母的測定按《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）規定的方法進行；大腸埃希氏菌的測定按《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌計數》（GB 4789.38—2012）規定的方法進行。沙門氏菌的測定按《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）規定的方法進行。金黃色葡萄球菌的測定按《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10-2016）第一法金黃色葡萄球菌定性檢驗規定的方法進行。

2 結果與分析

2.1 感官測定

觀察發現10批猴頭菇提取物為棕色、棕紅色至棕褐色干燥均勻的粉末，色澤均勻，具有猴頭菇特有的氣味，無異味，無正常視力可見外來異物。

2.2 薄層色譜鑒別

S為腺苷。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的熒光淬滅斑點。見圖1。

圖1 猴頭菇提取物薄層色譜圖

2.3 理化指標測定

理化檢測發現，10批原料的水分從3.16%到5.72%，灰分從3.11%到9.55%不等，粒度通過率均在96%以上。具體結果見表2。

表2 猴頭菇提取物水分、灰分、粒度測定結果表

2.4 腺苷的含量測定

（1）線性關系考察。以腺苷對照品的濃度（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標，求得回歸方程：Y=0.2779X-0.037 7，R2=1。結果表明腺苷在2.213 3～22.133 4 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

（2）精密度試驗。重復進樣6次，分別計算峰面積及保留時間的RSD值，保留時間和峰面積的RSD值為0.44%和0.05%。不對稱度以腺苷計不高于1.1。理論塔板數以腺苷計約71 000，表明儀器精密度良好。

（3）穩定性試驗。結果供試品中腺苷峰面積的RSD為0.68%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

（4）重復性試驗。腺苷平均含量為0.025%，RSD為1.76%。分離度大于1.5，表明該方法重復性良好。

（5）回收率試驗。計算腺苷的回收率，平均回收率為97.80%（92%～105%），RSD值為1.15%，表明該方法準確度良好。

（6）樣品含量測定。根據所得對照品溶液和供試品溶液色譜圖中腺苷峰面積計算供試品中待測組分腺苷含量。結果見表3，10批猴頭菇提取物中腺苷含量按干燥品計算分別不低于0.02%。

表3 猴頭菇提取物腺苷含量測定結果表

2.5 重金屬指標測定

猴頭菇提取物鉛、砷、汞、鎘測定結果見表4。

表4 猴頭菇提取物鉛、砷、汞、鎘測定結果表（單位：mg·kg-1）

2.6 微生物檢查

猴頭菇提取物微生物檢查結果見表5。

表5 猴頭菇提取物微生物檢查結果表

3 結論

根據對猴頭菇提取物進行感官測定、薄層色譜鑒別、理化指標測定、腺苷含量測定、重金屬指標測定和微生物檢查的結果，結合食品和藥品質量標準的制定原則，和相關國家標準以及產品特性、市場要求初步制定了猴頭菇提取物質量標準，結果見表6。本研究初步建立的猴頭菇提取物質量標準提高了其質量評價的客觀性與專屬性，為進一步規范猴頭菇提取物生產、銷售行業提供科學依據。

表6 猴頭菇提取物質量標準表

（續表6）