泡核桃葉水浸提液對草珊瑚種子萌發和幼苗生長的化感效應

蒲旭斌，郭 松，2，李在留，謝偉東

（1.廣西大學 林學院，廣西南寧 530004；2.廣西藝術學院 建筑藝術學院，廣西南寧 530007）

化感作用是植物在生長過程中向周圍釋放化學物質，促進或抑制環境中其他植物生長的一種自然現象[1]。這種現象廣泛存在自然界中，大多數時候表現為抑制周圍植物生長[2-3]。研究發現，化感作用通過干擾受體植物的光合作用[4-5]、呼吸作用[6-7]、生物膜滲透性、抗氧化保護酶活性、礦物質吸收、植物內源激素含量[8]和細胞分裂[9-11]等途徑發揮作用，阻礙受體植物的正常發育。20世紀90年代開始，在農業上陸續出現水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）等糧食作物的化感作用研究報道[12]，林業方面主要集中于杉木（Cunninghamia lanceolata）、桉樹（Eucalyptus）和楊樹（Populus stremu-loides）等用材樹種的研究[13-15]。隨著生態農業的發展，化感作用被越來越多的學者重視，已成為化學生態學研究的熱點之一。

泡核桃（Juglans sigillata）是胡桃科（Juglandace?ae）胡桃屬喬木，在我國主要分布于云南、貴州、四川、湖南、廣西和西藏等地[16-17]。泡核桃是我國山區重要的經濟林樹種，其果實營養價值高，是世界上著名的干果之一，木材堅實可作為硬木材料使用，具有保持水土、防風固沙等生態功能。廣西地處華南核桃（J.regia）分布區，有很多適宜土地可規劃種植，核桃產業具有很大的發展潛力。單一泡核桃林的生態功能不完整，易受病蟲危害、空產期長等不安定因素導致農民種植積極性不高，未能在廣西大面積發展[18]。林藥套種有利于改善林分的生態條件，提高效益產出，最大化利用土地資源，是降低泡核桃種植風險的有效手段。胡桃屬植物具有較強的化感作用[19]，不同植物在面對化感作用時會產生不同的反應。張琴等[20]通過棉花（Fdarium oxypo?rum）種子發芽試驗發現，低濃度的核桃葉水浸提液可以增加幼苗根系的活力指數，促進胚根生長、增加胚根干重，高濃度會對根部生長產生抑制；彭曉邦等[21]發現用20 mg∕mL 核桃葉水浸提液處理黃芩（Scutellaria baicalensis）種子，種子質膜不會受到破壞，還可以促進種子萌發、增加可溶性蛋白含量；薛金輝等[22]的研究結果表明，黑豆（Glycine max）幼苗的最大根長隨核桃葉水浸液的濃度增加而變長。選擇合適的套種植物十分重要，是泡核桃林能穩定發展的關鍵。

草珊瑚（Sarcandra glaba）又名腫節風、接骨蓮等，為金粟蘭科（Chloranthaceae）草珊瑚屬多年生常綠草本或亞灌木，具有很高的藥用價值[23]。草珊瑚屬于廣西山區常見灌木，已在桉樹林和杉木林下套種[24-25]。目前尚無關于泡核桃林下套種草珊瑚的案例及兩者間化感作用的研究報道。本研究測定泡核桃葉水浸提液對草珊瑚種子萌發及幼苗生長的影響，探索不同濃度泡核桃葉水浸提液對草珊瑚的化感作用，分析泡核桃和草珊瑚搭配的可行性，為廣西山區泡核桃林的發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

泡核桃葉采集于廣西壯族自治區樂業縣（106°56'E，24°78'N）。將泡核桃葉先用自來水洗凈，再用蒸餾水潤洗一遍，自然晾干后放入超低溫冰箱中備用。

草珊瑚種子于2020年11月購于廣西壯族自治區融安縣，帶果皮一起放入4 ℃冰箱中冷藏。試驗前選取籽粒飽滿、質地均勻的果實，自來水浸泡5～6 h后搓洗，去除外面的果肉，分離出種子，于通風陰涼處晾干。

1.2 試驗方法

1.2.1 泡核桃葉水浸提液制備

將泡核桃葉剪成1 cm2的小片，置于燒杯中，按10 g 泡核桃葉配100 mL 蒸餾水的比例，在室溫下浸泡48 h，期間每12 h手動攪拌1次。浸泡后用3層紗布過濾兩次，再用濾紙過濾，得到濃度為100 mg∕mL泡核桃葉水浸提液母液。使用時，將母液用蒸餾水稀釋至5、25、50、75 和100 mg∕mL，用蒸餾水作對照（CK）。

1.2.2 發芽試驗

2021年3月，晾干種子用高錳酸鉀溶液浸泡30 min消毒，用蒸餾水沖洗5次后備用。在培養皿中放入兩層濾紙，用牛皮紙封住，高壓濕熱滅菌（121 ℃、30 min），然后放入烘箱干燥。隨機選取50 粒種子整齊放入培養皿中，每個濃度重復3次，每天加入等量泡核桃葉水浸提液或蒸餾水保持濾紙濕潤。培養皿置于人工培養箱中培養，培養箱溫度設置為25 ℃、光照時間12 h、光照強度2 000 lx。

2021年3月13日— 4月10日，統計每日發芽數，計算種子發芽率、發芽勢和發芽指數[26]。

種子發芽后，繼續在培養皿中培育30天，獲取幼苗。每天加入等量泡核桃葉水或蒸餾水。試驗結束后選取長勢較一致的幼苗測定苗高及根長，采用氮藍四唑法測定植株超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用鉬酸銨法測定過氧化氫酶（CAT）活性，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量[27-28]。

1.3 數據處理

采用Excel 2019 軟件整理數據，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）、LSD多重比較法分析和主成分分析，表中數據均為平均值±標準誤。采用Excel 2019軟件繪圖。

主成分綜合得分計算公式[29]如下：

式中，Ui為主成分載荷矩陣值；Ai為因子載荷矩陣對應值；λi為對應主成分的特征根值；ZXi為變量經標準化處理后的值；Y為主成分綜合得分值；Yi為主成分分析模型。

2 結果與分析

2.1 泡核桃葉水浸提液對草珊瑚種子萌發及幼苗生長的影響

泡核桃葉水浸提液對種子發芽率、發芽勢、發芽指數及幼苗苗高和根長影響顯著（P＜0.05）（表1）。濃度為5～75 mg∕mL 時，各處理間的發芽率、發芽勢和發芽指數均與CK 差異不顯著；當濃度為100 mg∕mL 時，發芽率、發芽勢和發芽指數均顯著低于CK（P＜0.05），分別為CK 的85.60%、69.44%和79.94%。濃度為25 ～ 100 mg∕mL 時，各處理的苗高均與CK 相比差異不顯著；濃度為5 mg∕mL 時，苗高顯著高于CK（P＜0.05），比CK 高出17.58%。除濃度25 mg∕mL 外，其他處理的根長均與CK 差異顯著（P＜0.05）；濃度為5 mg∕mL 時，根長最長（4.77 cm）；其次為濃度25 mg∕mL（4.33 cm）；濃度為100 mg∕mL時，根長最短（2.57 cm），比CK短60.76%。

表1 泡核桃葉水浸提液對草珊瑚種子萌發的影響Tab.1 Effects of aqueous extract from J.sigillata leaves on germination of S.glabra seeds

2.2 泡核桃葉水浸提液對草珊瑚幼苗抗氧化保護酶活性的影響

泡核桃葉水浸提液對抗氧化保護酶活性均有顯著影響（P＜0.05）（圖1）。SOD活性隨濃度升高表現為先升高后下降；濃度為5 mg∕mL 時，SOD 活性顯著高于CK（P＜0.05）；濃度為25～50 mg∕mL時，SOD活性與CK差異不顯著；濃度為75～100 mg∕mL時，SOD活性顯著低于CK（P＜0.05）。POD 活性隨濃度升高表現為先升高后下降；濃度為25～50 mg∕mL時，POD活性顯著高于CK（P＜0.05）；濃度為100 mg∕mL 時，POD 活性顯著低于CK（P＜0.05）。CAT 活性隨濃度升高而下降；與CK 相比，濃度為5、25、50、75 和100 mg∕mL 時，CAT 活性分別下降12.97%、27.46%、29.56%、43.48%和46.45%；濃度為50 ～ 100 mg∕mL時，CAT活性顯著低于CK（P＜0.05）。

圖1 泡核桃葉水浸提液對草珊瑚幼苗抗氧化保護酶活性的影響Fig.1 Effects of aqueous extract from J.sigillata leaves on antioxidant enzyme activities of S.glabra seedling

2.3 泡核桃葉水浸提液對草珊瑚幼苗脯氨酸、MDA、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

泡核桃葉水浸提液對脯氨酸、MDA、可溶性蛋白和可溶性糖含量均有顯著影響（P＜0.05）（圖2）。脯氨酸和MDA 含量隨濃度升高而增加；濃度為5～100 mg∕mL 時，脯氨酸和MDA 含量均顯著高于CK（P＜0.05）；濃度為100 mg∕mL 時，脯氨酸與MDA 含量分別比CK 高出334.62%和127.68%。可溶性蛋白含量較穩定，各濃度與CK 均差異不顯著；濃度為25 mg∕mL時，可溶性蛋白含量最大。可溶性糖含量隨濃度升高表現為先增加后減少；濃度為5～75 mg∕mL時，可溶性糖含量顯著高于CK（P＜0.05）；濃度為100 mg∕mL 時，可溶性糖含量急劇下降，比CK 低30.92%，差異顯著（P＜0.05）。

圖2 泡核桃葉水浸提液對草珊瑚幼苗脯氨酸、丙二醛、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of aqueous extract from J.sigillata leaves on proline,contents of MDA,soluble protein and soluble sugar of S.glabra seedling

2.4 草珊瑚種子萌發、幼苗生長和生理指標主成分分析

主成分PC1、PC2 的特征值分別為6.56 和2.13，方差貢獻率分別為54.66%和17.73%，兩個主成分累積方差貢獻率為72.39%（表2）。主成分PC1對應的特征向量中，根長、SOD 活性和發芽率的系數最大，分別為0.92、0.90 和0.86，代表萌發指標和抗氧化酶活性指標。主成分PC2 對應的特征向量中，POD 活性、可溶性糖和可溶性蛋白含量的系數最大，分別為0.73、0.71 和0.60，代表生理指標中的滲透調節物質。

表2 草珊瑚種子萌發、幼苗生長和生理指標主成分分析Tab.2 Principal component analysis on seed germination,seedling growth and physiological indexes of S.glabra

續表2 Continued

2.5 泡核桃葉水浸提液對草珊瑚種子萌發與幼苗生長的綜合評價

綜合得分越高表明該組的泡核桃葉水浸提液對草珊瑚種子萌發和幼苗生長的促進作用越強。泡核桃葉片水浸提液對草珊瑚種子萌發與幼苗生長影響的綜合表現為5 mg∕mL ＞25 mg∕mL ＞CK ＞50 mg∕mL ＞75 mg∕mL ＞100 mg∕mL。當濃度為5 mg∕mL時，綜合得分最高（1.69）；濃度高于25 mg∕mL 時，綜合得分低于CK；濃度為100 mg∕mL 時，綜合得分最低（-3.74）。

表3 不同濃度泡核桃葉片水浸提液作用的綜合得分和排名Tab.3 Comprehensive score and ranking of different concentrations of aqueous extracts from of J.sigillata leaves

3 討論與結論

植物種子萌發與植物種群更新和繁衍存活能力息息相關，其中發芽率表示發芽種子與參試種子的比例，是判斷種子質量的重要指標之一。本試驗中，泡核桃葉水浸提液濃度為5～75 mg∕mL 時，草珊瑚種子發芽率與CK 差異不顯著，濃度為100 mg∕mL時抑制作用顯著。發芽勢衡量種子的發芽速度和整齊度，發芽指數衡量種子的活力，均為重要的種子質量測試指標。不同濃度泡核桃葉水浸提液均抑制種子的發芽勢和發芽指數，表現為隨濃度升高，種子的平均發芽天數越長，發芽整齊度越低，發芽活力越低。與其他植物相比，泡核桃葉水浸提液對草珊瑚種子的發芽率影響較小，水浸提液濃度為100 mg∕mL 時，發芽率只降低了15%；李茜等[30]和劉序等[31]的研究中，50 mg∕mL 濃度核桃葉水浸提液處理的丹參（Salvia miltiorrhiza）、蘿卜（Raphanus sati?vus）種子的發芽率均降低50%左右。

當植物處于逆境脅迫或衰老時會產生膜脂過氧化，MDA 是膜脂過氧化的最終產物，通過對MDA含量的測定可以了解細胞膜的損傷程度。隨著泡核桃葉水浸提液濃度升高，草珊瑚幼苗的MDA 含量逐漸升高，細胞膜的受損程度逐漸加深，濃度為100 mg∕mL 時，MDA含量比對照高出127.68%。CAT、POD和SOD為植物的抗氧化保護酶，當受到脅迫時，可以共同作用阻止活性氧（ROS）對植物細胞膜的傷害。泡核桃葉水浸提液對草珊瑚幼苗3種保護酶活性的影響程度各不相同，CAT 活性隨浸提液濃度升高而下降，POD、SOD活性隨浸提液濃度升高表現為先升高后下降。這種現象表明，草珊瑚幼苗受到低濃度水浸提液影響時，首先會激活細胞內的SOD、POD 清除多余的ROS，來抵御外界化感物質的影響；當泡核桃葉水浸提液濃度升高，細胞的抗氧化酶系統不能清除多余的ROS，最后導致細胞受到損傷，酶活性也逐漸降低，與張如義等[32]結論相似，說明高濃度的泡核桃葉水浸提液對草珊瑚代謝和生理功能有顯著的抑制作用。

植物在逆境條件下時，會通過積累滲透調節物質應對外界造成的內外滲透壓失衡，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白均為主要的滲透調節物質。隨泡核桃葉水浸提液濃度升高，脯氨酸含量不斷增加，與馬世榮等[33]研究結果類似，表明草珊瑚所受的化感作用越來越強，需要生產更多脯氨酸來調節細胞間滲透壓。可溶性糖與可溶性蛋白含量表現為中、低濃度增加，高濃度下降的趨勢。這可能是低濃度的泡核桃葉水浸提液刺激后，使幼苗主動防御，調控可溶性糖和可溶性蛋白濃度，增加幼苗保水能力，以抵抗化感物質對幼苗生長發育的影響；當濃度升高，幼苗的自我調節能力不足以抵御化感物質的影響，100 mg∕mL 濃度下的幼苗滲透壓失衡，可溶性蛋白和可溶性糖濃度降低，使草珊瑚幼苗的正常發育受阻。

核桃葉水浸提液對棉花、黃岑和蘿卜等作物生長發育的影響雖各不相同，但濃度依舊是決定化感作用強度的關鍵因素[19-20，26]。主成分分析綜合得分顯示，隨水浸提液濃度上升，草珊瑚種子和幼苗的綜合得分不斷下降。當泡核桃葉水浸提液濃度為5 mg∕mL時，綜合得分最高，此濃度最有利于促進草珊瑚種子的萌發和幼苗生長；濃度為100 mg∕mL時，水浸提液對草珊瑚種子萌發和幼苗生長有顯著的抑制作用。

泡核桃葉水浸提液對草珊瑚種子萌發和幼苗生長的影響為雙重效應，當濃度低于75 mg∕mL 時，水浸提液對種子的發芽率、發芽勢和發芽指數影響較小；當濃度為100 mg∕mL 時，發芽率、發芽勢和發芽指數均顯著低于對照組。當濃度低于25 mg∕mL時，水浸提液可提高可溶性物質含量，促進幼苗生長；當濃度為100 mg∕mL 時，水浸提液會破壞幼苗細胞的滲透壓及抗氧化保護酶活性，引起細胞膜損傷，使幼苗生長受到抑制。因此，在實際生產過程中，可通過清理林下落葉、以較低密度種植泡核桃來減輕對草珊瑚種子萌發和幼苗生長的抑制作用。植物處于不同生長階段對化感作用的敏感程度也不同，還需對不同生長期的草珊瑚進行研究才能更詳細地了解泡核桃對草珊瑚化感作用的機制，更好地促進泡核桃林下經濟發展。