棗樹根際解磷菌P7的溶磷特性

魏喜喜，楊智鵬，馬路婷，張 梅b，c，3，祿彩麗b，c，3，宋 健，劉偉鋒，李建貴b，c

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學 a.草業(yè)與環(huán)境科學學院；b.林業(yè)研究所；c.新疆紅棗工程控制中心，新疆 烏魯木齊 830052； 2.新疆佳木果樹學國家長期科研基地，新疆 阿克蘇 843000；3.新疆大學，新疆 烏魯木齊 830046）

磷是植物生長發(fā)育過程中不可或缺的重要礦質(zhì)元素，在植物呼吸、細胞分裂、能量轉(zhuǎn)化和生物合成等生理生化過程中起著重要作用[1]。植物吸收的磷素主要來源于土壤，然而大多數(shù)土壤有效磷含量較低，土壤中95%以上的磷為難溶形態(tài)[2]。 在30%～40%的耕地上，磷缺乏是土壤生產(chǎn)力低下的主要原因[3]。在土壤中，可用的磷酸鹽陰離子要么被黏土表面吸附[4]，要么與陽離子形成不溶性絡合物，如堿性土壤中的磷酸鈣和磷酸鎂，酸性土壤中的磷酸鐵和磷酸鋁[5]，不可被植物直接吸收利用。為了滿足高產(chǎn)作物的磷需求，通常需要定期向農(nóng)田中施用不同外源肥料來進行補充磷元素[6]。長此以往，越來越多的難溶性磷酸鹽被固定在土壤中，農(nóng)田會受到不同程度的污染，出現(xiàn)肥力下降和土壤板結等問題。根據(jù)Khan 等[7]的估計，如果耕地中的儲備磷具有生物可利用性，那么在將近100年的時間里不需要額外補充磷。

土壤中存在某些解磷微生物能夠活化土壤理化性質(zhì)[8]，能將水不溶性磷轉(zhuǎn)化成水可溶性磷[9]。鄧小軍等[10]從廣西不同紅壤區(qū)林木根際土壤中篩選分離得到6 株高效解磷菌株，這些菌株均有較強的溶磷能力。郭藝鵬等[11-13]通過對新疆棗樹根際土壤微生物進行分離篩選及其解磷能力測定，發(fā)現(xiàn)P7 和P13 解磷能力最強，其中P7 適用于堿性環(huán)境，P13 適用于酸性環(huán)境。解磷微生物的主要溶磷機制是有機酸酸解作用、酶解作用和釋放H+等，且由于碳源、氮源和磷源的種類不同，不同菌株表現(xiàn)出不同的溶磷特點[14-17]。微生物菌劑的施用對土壤中微生物數(shù)量有著不同程度的影 響[18-19]。植物根際微生物具有一定的生境選擇性和種屬專一性，根據(jù)地域氣候和生境的不同，研制適宜當?shù)刂参锷L的微生物菌肥是很有必要的，也符合我國“減肥減藥”的國家戰(zhàn)略。因此，研究解磷微生物在不同碳氮磷源環(huán)境下的解磷效果對利用解磷微生物有重要意義，也可為施用解磷微生物菌肥提供理論依據(jù)。

南疆紅棗園土壤中普遍缺磷，土壤中全磷含量在1 g/kg 左右，但是速效磷含量僅為10 ～ 30 mg/kg[20-21]。本研究中以高效解磷菌株P7 為研究對象，在不同營養(yǎng)因子（碳源、氮源、磷源、碳氮質(zhì)量比）條件下，觀察水溶性磷含量和pH 的動態(tài)變化來確定其最適宜的營養(yǎng)條件，在此基礎上測定發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性，并對發(fā)酵液中有機酸進行定性定量分析，探究高效解磷菌株P7在不同營養(yǎng)因子條件下的解磷特性，旨在為研制適用于南疆紅棗園的專用微生物菌肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

以新疆農(nóng)業(yè)大學林業(yè)研究所從新疆棗園棗樹根際土壤中分離出的高效解磷菌株P7（Bacillus，KF719307.1）為研究對象。

1.2 供試培養(yǎng)基

解無機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO40.3 g，F(xiàn)eSO40.03 g，MnSO41.0 g，Ca3(PO4)25.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0 ～7.2，用于微生物發(fā)酵。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0 ～7.2，（加瓊脂18.0 g 即為固體培養(yǎng)基），用作微生物擴繁營養(yǎng)液和種子液。上述培養(yǎng)基均在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min 后取出備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 解磷菌株P7 種子液的制備

將實驗室保存的解磷菌株P7 以劃線方式接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)48 h。挑取單菌株接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放置于恒溫搖床上，設定溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min，培養(yǎng)48 h。 在4 ℃、10 000 r/min 條件下，將發(fā)酵液離心10 min， 菌體沉淀經(jīng)無菌水洗滌2 次，再用無菌水重懸，在600 nm 波長下調(diào)節(jié)吸光度為1，即種子液。

1.3.2 解磷菌株P7 溶磷能力的測定

在解無機磷培養(yǎng)基基礎上，采用單因素試驗設計，將培養(yǎng)基的碳源、氮源和磷源進行等量替換和按比例替換。碳源包括葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-半乳糖、纖維素、甘露醇，氮源包括硫酸銨、硝酸鉀、尿素、碳酸銨，磷源包括磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鐵、磷酸鋁，碳氮（可溶性淀粉和硫酸銨）質(zhì)量比設置為5∶1、10∶1、15∶1、 20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1。在種子液接種量1 mL、初始pH 7.10、溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min 條件下，每隔24 h，使用酸度計測定發(fā)酵液pH，采用鉬藍比色法測定發(fā)酵液中水溶性磷含量。

1.3.3 解磷菌株P7 發(fā)酵液有機酸種類及含量的 測定

使用高效液相色譜儀（島津CTO-15C）測定發(fā)酵 液中有機酸含量。檢測器為紫外檢測器；色譜柱為Shim-pack GIST C18-AQ 柱，4.6 mm×250 mm， 5 μm；流 動 相 為0.1%磷酸溶液- 甲醇（體積比為97.5∶2.5），pH 2.6，波長210 nm，流速 0.8 mL/min，進樣量20 μL。

將發(fā)酵液培養(yǎng)96 h 后，從各處理發(fā)酵液中抽取10 mL 至離心管中，超聲提取10 min 后放入離心機中，在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心 10 min，取其上清液2 mL，過0.22 μm 微孔濾膜至進樣小瓶中，待測。

首先用單標確定各種有機酸的出峰時間，然后分別稱取有機酸標品檸檬酸0.5 g、酒石酸0.25 g、蘋果酸0.5 g、丁二酸1.25 g、富馬酸2.5 mg、草酸 2.5 mg、馬來酸2.5 mg 至50 mL 小燒杯中，溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混勻，即得到5 000 mg/L 檸檬酸、2 500 mg/L 酒石酸、5 000 mg/L 蘋果酸、12 500 mg/L 丁二酸、25 mg/L 富馬酸、25 mg/L 草酸、25 mg/L 馬來酸的混合標準儲備液，于4 ℃條件下保存。分別吸取混合標準儲備液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL 于25 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，于4 ℃條件下 保存[22]。

1.3.4 解磷菌株P7 發(fā)酵液堿性磷酸酶含量的測定

將發(fā)酵液培養(yǎng)96 h 后，在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 ～15 min，取0.2 ～1.0 mL 上清液于10 mL 離心管中。加4.00 mL MUB 緩沖液（pH 11）和1.00 mL 用相同緩沖液配制的對-硝基酚磷酸鈉溶液，蓋上蓋子混勻，在37 ℃條件下培養(yǎng)1 h。然后加1.00 mL 氯化鈣溶液和4.00 mL 氫氧化鈉溶液，充分混勻后過濾，在400 nm 波長處測定吸光值。同時做空白對照，加對-硝基酚磷酸鈉溶液之前加入氯化鈣溶液和氫氧化鈉溶液，并迅速過濾。每樣品重復3 次。

取1 mL 對-硝基酚標準溶液（1 g/L）于100 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度，再分別取該稀釋液0、1、2、3、4、5 mL 于10 mL 離心管中，加去離子水稀釋至5 mL，然后加1 mL 氯化鈣溶液和4 mL 氫氧化鈉溶液，充分混勻后過濾，在400 nm 波長處測定吸光值，制作標準曲線。

堿性磷酸酶活性以24 h 后釋出的酚量表示。酚量為從標準曲線上查得的酚量乘以換算成1 mL發(fā)酵液的系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理，使用R Studio 軟件對數(shù)據(jù)進行LSD 多重分析，使用SPSS 17.0 軟件對有機酸數(shù)據(jù)進行主成分分析，使用Sigmaplot 12.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同磷源對解磷菌株P7 解磷效果的影響

2.1.1 不同磷源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動態(tài)變化

不同磷源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動態(tài)變化如圖1 所示。由圖1 可見，在發(fā)酵液的整個培養(yǎng)過程中，各種難溶性磷酸鹽的溶解量均呈增長趨勢，但是不同難溶性磷酸鹽的溶解量存在差異。當磷源為磷酸鎂時，發(fā)酵液中水溶性磷含量整體較低且無顯著變化；當磷源為磷酸鐵時，整體變化呈先上升、后下降的趨勢，在培養(yǎng)48 ～72 h 階段，變化較顯著，且在培養(yǎng)96 h 時發(fā)酵液中水溶性磷含量降至最低；當磷源為磷酸鋁時，發(fā)酵液中水溶性磷含量先降低、后升高，在培養(yǎng)72 h 時降至最低，總體含量較低；當磷源為磷酸鈣時，發(fā)酵液中水溶性磷含量整體處于增長趨勢，且在各培養(yǎng)時段含量均為最高，在培養(yǎng)96 h 前增加速度較為緩慢，在培養(yǎng)96 ～120 h 時急劇增加，并在培養(yǎng)120 h 時達到362.4 mg/L。因此，可知解磷菌株P7 對磷酸鈣的溶解效果最好，后續(xù)試驗均采用磷酸鈣為唯一磷源。

圖1 不同磷源條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中水溶性磷含量 的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of water-soluble phosphorus content of phosphorus-solubilizing bacteria P7 in fermentation liquid under different phosphorus sources

2.1.2 不同磷源條件下發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化

不同磷源條件下發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化如圖2所示。

圖2 不同磷源條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of pH of fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different phosphorus sources

由圖2 可見，在發(fā)酵液的培養(yǎng)過程中，各處理發(fā)酵液的pH 波動較大。當以磷酸鈣為唯一磷源時，隨著培養(yǎng)時長的加長，發(fā)酵液的pH 持續(xù)降低，由初始的7.20 降至5.11，在培養(yǎng)96 h 時降至最低值4.82；當以磷酸鎂為唯一磷源時，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先降低、后升高、再降低的趨勢，變化波動較大，在培養(yǎng)24 h 內(nèi)波動幅度最大，從初始值7.20 降低至4.26，降低幅度高達40.83%；當以磷酸鐵為唯一磷源時，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先降低、后上升的趨勢，從初始值7.20 持續(xù)降低至培養(yǎng) 48 h 時的4.21，之后發(fā)酵液的pH 緩慢回升；當以磷酸鋁為唯一磷源時，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先降低、后上升的趨勢，從初始值7.20 持續(xù)降低至培養(yǎng) 72 h 時的4.96。

2.2 不同碳源對解磷菌株P7 溶解磷酸鈣的影響

2.2.1 不同碳源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動態(tài)變化

不同碳源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動態(tài)變化如圖3 所示。

圖3 不同碳源條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中水溶性磷含量 的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of water-soluble phosphorus content of phosphorus-solubilizing bacteria P7 in fermentation liquid under different carbon sources

由圖3 可見，在發(fā)酵液的整個培養(yǎng)過程中，水溶性磷含量呈現(xiàn)先升高、后下降的趨勢，整體變化顯著。在分別以乳糖、麥芽糖和蔗糖為唯一碳源的情況下，均為培養(yǎng)72 h 時出現(xiàn)峰值，之后呈現(xiàn)降低趨勢。在以麥芽糖和蔗糖為唯一碳源的情況下，發(fā)酵液中水溶性磷含量相對較低；在以乳糖為唯一碳源的情況下，在培養(yǎng)72 h 時，發(fā)酵液中水溶性磷含量達到342.1 mg/L，相對較高。在分別以葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、D-半乳糖和甘露醇為唯一碳源的情況下，發(fā)酵液中水溶性磷含量均呈持續(xù)上升趨勢，且在培養(yǎng)96 h 時，增至最高，之后出現(xiàn)降低趨勢，特別是在以可溶性淀粉為唯一碳源的情況下，水溶性磷含量增長幅度最大，在培養(yǎng)24 ～48 h 時，增長幅度達到239.73%，在培養(yǎng)96 h 時，水溶性磷含量最高，達到388.5 mg/L。因此，可知在以可溶性淀粉作為唯一碳源時，解磷菌株P7 的溶磷效果最好。

2.2.2 不同碳源條件下發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化

不同碳源條件下發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化如圖4所示。由圖4 可見，在整個培養(yǎng)過程中，各處理發(fā)酵液的pH 波動較大，差異顯著。當以葡萄糖為唯一碳源時，發(fā)酵液的pH 整體呈現(xiàn)先下降、后上升、再下降的趨勢，在培養(yǎng)0 ～24 h 時，從初始值7.20 降至6.03，在培養(yǎng)120 h 時降至最低值5.07；當以果糖為唯一碳源時，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢；當以可溶性淀粉為唯一碳源時，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先持續(xù)下降、后較為穩(wěn)定的狀態(tài)，穩(wěn)定在5.33 ～5.34；當以乳糖為唯一碳源時，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)波動下降的趨勢，在培養(yǎng)120 h 時降至5.26；當以麥芽糖為唯一碳源時，發(fā)酵液的pH整體呈現(xiàn)下降趨勢，但變化不顯著；當以蔗糖為唯一碳源時，發(fā)酵液的pH 整體較穩(wěn)定，差異不顯著；當以D-半乳糖為唯一碳源時，發(fā)酵液的pH整體呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，從初始值7.20 降至培養(yǎng)120 h 時的4.62，降低幅度達35.83%；當以甘露醇為唯一碳源時，發(fā)酵液的pH 在培養(yǎng)24 h 內(nèi)降低至5.81，然后基本保持穩(wěn)定，有輕微上升。

圖4 不同碳源條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of pH of fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different carbon sources

2.3 不同氮源對解磷菌株P7 溶解磷酸鈣的影響

2.3.1 不同氮源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動態(tài)變化

不同氮源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動態(tài)變化如圖5 所示。由圖5 可見，在不同氮源環(huán)境下，發(fā)酵液中可溶性磷含量整體呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢。在分別以碳酸銨、硫酸銨和硝酸鉀為唯一氮源時，發(fā)酵液中水溶性磷含量均呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢，在培養(yǎng)96 h 時，水溶性磷含量均達到最高，其中以硫酸銨為唯一氮源時，溶磷效果最佳，水溶性磷含量達到442.5 mg/L。以尿素為唯一氮源時，發(fā)酵液中水溶性磷含量無顯著變化。在以硫酸銨為唯一氮源條件下，在培養(yǎng)48 ～72 h 時間段，發(fā)酵液中水溶性磷含量增加幅度最為顯著，增加了42.68 倍。因此，以硫酸銨為唯一氮源時，解磷菌株P7 的溶磷效果最好。

圖5 不同氮源條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中水溶性磷含量 的動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of water-soluble phosphorus content of phosphorus-solubilizing bacteria P7 in fermentation liquid under different nitrogen sources

2.3.2 不同氮源條件下發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化

不同氮源條件下發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化如圖6所示。

圖6 不同氮源條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of pH of fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different nitrogen sources

由圖6 可見，在整個培養(yǎng)過程中，各處理發(fā)酵液的pH 有較大波動，差異顯著。當分別以尿素、碳酸銨、硫酸銨、硝酸鉀為唯一氮源時，發(fā)酵液的pH 均呈現(xiàn)先下降、后升高的趨勢。其中，以尿素為唯一氮源時整體差異不顯著；分別以碳酸銨、硫酸銨、硝酸鉀為唯一氮源的情況下，均為培養(yǎng)96 h 時發(fā)酵液的pH 降至最低，其中以硫酸銨為唯一碳源時，在培養(yǎng)96 h 時降至最低值4.60。

2.4 不同碳氮比對解磷菌株P7 溶解磷酸鈣的影響

2.4.1 不同碳氮比條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動態(tài)變化

不同碳氮比條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動態(tài)變化如圖7所示。由圖7可見，在碳氮比為5∶1、 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、 40∶1 條件下，發(fā)酵液中水溶性磷含量均呈現(xiàn)先增加、后減少的趨勢，且變化較顯著，整體上，在培養(yǎng)24 ～48 h 時間段，各處理水溶性磷含量增加幅度最為顯著。各處理均為培養(yǎng)96 h 時發(fā)酵液中水溶性磷含量達到最大值，且在碳氮比為35∶1 時，發(fā)酵液中水溶性磷含量達到最高值446.9 mg/L。因此，當發(fā)酵液中碳氮比為35∶1 時，解磷菌株P7的解磷效果最好。

圖7 不同碳氮比條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中水溶性磷 含量的動態(tài)變化Fig.7 Dynamic changes of water-soluble phosphorus content in fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different ratios of C mass to N mass

2.4.2 不同碳氮比條件下發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化

不同碳氮比條件下發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化如圖8 所示。由圖8 可見，在碳氮比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 條件下，發(fā)酵液的pH 變化趨勢較為一致，均隨著培養(yǎng)時長的延長，先降低、后升高，在培養(yǎng)96 h 時發(fā)酵液的pH 降至最低。從不同碳氮比條件來看，隨著碳氮比的增大，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先降低、后升高的趨勢，在碳氮比為35∶1、培養(yǎng)時長為96 h 時，發(fā)酵液的pH 最低，為4.60。

圖8 不同碳氮比條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液pH 的動態(tài)變化Fig.8 Dynamic changes of pH of fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different ratios of C mass to N mass

2.5 不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液有機酸的含量及因子分析

2.5.1 有機酸標準液的液相分析結果

對7種有機酸進行分離，得到較好的分離效果，7 種有機酸的標準譜圖如圖9 所示。

圖9 7 種有機酸標準溶液的色譜圖Fig.9 Chromatograms of seven organic acid standard solutions

7 種有機酸的保留時間、相關系數(shù)、線性范圍、相對標準偏差的測定和計算結果見表1。由表1 可知，采用高效液相色譜法，在15 min 內(nèi)即可完成發(fā)酵液中草酸、酒石酸、蘋果酸、馬來酸、檸檬酸、丁二酸和富馬酸的測定。

表1 7 種有機酸的保留時間、回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍和相對標準差Table 1 Retention time, regression equation, correlation coefficient, linear range and relative standard deviation of seven organic acids

2.5.2 解磷菌株P7 發(fā)酵液中7 種有機酸的含量

不同營養(yǎng)因子條件下發(fā)酵液中7 種有機酸的含量見表2。由表2 可知，在不同的營養(yǎng)因子條件下，發(fā)酵液中各種有機酸含量不同，且差異顯著。當以葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖或D-半乳糖為唯一碳源時，發(fā)酵液中蘋果酸的含量最高；當以乳糖、蔗糖或甘露醇為唯一碳源時，發(fā)酵液中丁二酸含量最高。當以硫酸銨或碳酸銨為唯一氮源時，發(fā)酵液中蘋果酸含量最高，其中，當唯一氮源為碳酸銨時，蘋果酸、丁二酸和富馬酸含量均最高，分別達到3 434.88、783.43、4.03 mg/L； 當以硝酸鉀為唯一氮源時，發(fā)酵液中草酸含量最高，達到1 379.93 mg/L；當以尿素為唯一氮源時，發(fā)酵液中酒石酸和檸檬酸含量均最高，分別達到60.79、64.62 mg/L。當以磷酸鈣、磷酸鎂或磷酸鋁為唯一磷源時，發(fā)酵液中蘋果酸含量最高；當以磷酸鐵為唯一磷源時，發(fā)酵液中丁二酸含量最高。當碳氮比為35∶1 時，發(fā)酵液中丁二酸和馬來酸含量均最高。

表2 不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中7 種有機酸的含量?Table 2 Contents of seven organic acids in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutritional factors mg/L

續(xù)表2Continuation of table 2

2.5.3 解磷菌株P7 發(fā)酵液中7 種有機酸含量的因子分析

不同營養(yǎng)因子條件下發(fā)酵液中7 種有機酸含量經(jīng)過標準化后得到3 個主成分因子，特征值均大于1。前3 個主成分因子的特征值、貢獻率及累計貢獻率見表3。由表3 可知，第1 主成分的方差貢獻率為60.701%，第2 主成分的方差貢獻率為27.438%，第3 主成分的方差貢獻率為7.129%，第1 主成分、第2 主成分和第3 主成分的累積貢獻率為95.268%。

表3 不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中7 種有機酸含量的主成分分析結果Table 3 The results of principal component analysis of contents of seven organic acids in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutritional factors

主成分載荷矩陣見表4。由表4 可知，第1 主成分主要由可溶性淀粉、麥芽糖和磷酸鎂3 個因子組成，載荷分別為0.993、0.980 和0.960；第2主成分主要由碳氮比35∶1、乳糖和磷酸鐵3 個因子組成，載荷分別為0.885、0.830 和0.765；第3主成分主要由硝酸鉀、乳糖和甘露醇3個因子組成，載荷分別為0.804、0.341 和0.319。

表4 不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中7 種有機酸含量的主成分載荷矩陣Table 4 Rotated matrix of principal components of contents of seven organic acids in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutritional factors

不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中7種有機酸含量的綜合評價結果見表5，根據(jù)不同處理下各有機酸含量的綜合貢獻度進行排序。由表5可知：根據(jù)第1 主成分得分排序，蘋果酸的貢獻度排第1 位，主要表現(xiàn)在可溶性淀粉、麥芽糖和磷酸鎂3 個處理中發(fā)酵液蘋果酸的含量較高，其他有機酸排名由前到后依次為丁二酸、富馬酸、馬來酸、草酸、酒石酸、檸檬酸；根據(jù)第2 主成分得分排序，丁二酸的貢獻度排第1 位，主要表現(xiàn)在碳氮比35∶1、乳糖和磷酸鐵3 個處理中發(fā)酵液丁二酸的含量較高，其他有機酸排名由前到后依次為檸檬酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸；根據(jù)第3 主成分得分排序，酒石酸的貢獻度排第1 位，主要表現(xiàn)在硝酸鉀、乳糖和甘露醇3 個處理中發(fā)酵液酒石酸的含量較高，其他有機酸排名由前到后依次為檸檬酸、蘋果酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、草酸；綜合得分顯示，蘋果酸的貢獻度最高，丁二酸次之，其余有機酸排名由前到后依次為檸檬酸、酒石酸、草酸、馬來酸、富馬酸。

表5 不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中7 種有機酸含量的綜合評價結果Table 5 Comprehensive evaluation results of different organic acids in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutritional factors

2.6 不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中堿性磷酸酶的活性

不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中堿性磷酸酶的活性如圖10 所示。由圖10 可見，當發(fā)酵液中D-半乳糖為唯一碳源時，堿性磷酸酶活性最高，為26.8 mg/kg；當硝酸鉀為唯一氮源時，發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性最高，為27.8 mg/kg；當磷酸鎂為唯一磷源時，發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性最高，為28.7 mg/kg；當碳氮比為35∶1 時，發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性最高，為28.7 mg/kg。

圖10 不同營養(yǎng)因子條件下解磷菌株P7 發(fā)酵液中堿性磷酸酶的活性Fig.10 Difference of phosphatase activity in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutrient factors

3 結論與討論

棗樹根際解磷菌株P7 的溶磷特性研究結果表明，不同營養(yǎng)因子對解磷菌株P7 的溶磷效果存在不同程度的影響。在碳源為可溶性淀粉、氮源為硫酸銨、磷源為磷酸鈣、碳氮比35∶1 的營養(yǎng)條件下，解磷菌株P7 的溶磷效果均較好；發(fā)酵液中水溶性磷含量與pH 呈顯著負相關，pH 的變化與有機酸分泌密切相關；解磷菌株P7 在不同營養(yǎng)因子環(huán)境下主要分泌蘋果酸和丁二酸；堿性磷酸酶活性與解磷菌株P7 溶解磷酸鈣無顯著相關關系。

研究結果表明，不同的營養(yǎng)條件下解磷菌株P7 的溶磷效果存在顯著差異。磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鋁和磷酸鐵4 種磷源中，以磷酸鈣為唯一磷源時，發(fā)酵液中水溶性磷含量顯著增高，解磷菌株P7 的溶磷活性最強，其次分別為以磷酸鐵、磷酸鋁和磷酸鎂為唯一磷源。鈣磷酸鹽在有機酸和質(zhì)子的雙重作用下有較強的溶解作用[23]。鐵磷酸鹽和鋁磷酸鹽僅受有機酸絡合作用的影響，加上鋁離子和鐵離子在酸性溶液中黏度較大，對水分流動和養(yǎng)分交換產(chǎn)生一定的影響，磷酸鎂易溶于無機酸。此外，解磷微生物的溶磷能力與磷源自身的供磷特點也有關。在生長過程中，微生物通過自身產(chǎn)生的次生代謝物對難溶性磷進行溶解，自身也會固持一部分微生物量磷，供自身使用。通常在外界缺磷的情況下，解磷微生物才會增加自身次生代謝物的分泌，從而產(chǎn)生解磷作用。

以可溶性淀粉為碳源時，發(fā)酵液中水溶性磷含量較高；以D-半乳糖和果糖為碳源時，兩者的菌體生長量相當，但是溶磷量相差較多。已有研究結果表明，節(jié)桿菌1TCRi7 菌株在以葡萄糖為唯一碳源時，溶磷能力較強，分別以蔗糖、淀粉和糖蜜為唯一碳源時，解磷菌株的生長狀況均比以葡萄糖為唯一碳源時的生長情況好，但是未發(fā)現(xiàn)其有溶磷能力[14]。表明解磷菌株的生長狀況與解磷菌株的溶磷能力并非始終呈正相關關系。劉曉芳等[15]在研究不同碳源對曲霉溶磷效果的影響時發(fā)現(xiàn)，在碳源是糖蜜時，溶磷效果最好。

以硫酸銨為唯一氮源時，發(fā)酵液中水溶性磷含量較高；以尿素為唯一氮源時，發(fā)酵液幾乎無解磷活性，說明酰胺態(tài)的氮源對解磷菌株P7 的解磷能力無顯著影響。已有研究結果表明，解磷微生物所需氮源主要為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。Asea 等[16]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，當以NH4+-N 為唯一氮源時，培養(yǎng)介質(zhì)pH 顯著降低，溶磷菌的溶磷量顯著增加，這與虞偉斌等[17]、Wenzel 等[24]的研究結果一致。但Reyes 等[25]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，青霉菌IR94-MF 1 以硝態(tài)氮為氮源的解磷效果顯著好于以銨態(tài)氮為氮源。Relwani 等[26]和趙小蓉等[14]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，曲霉在氮源為硝酸根的條件下表現(xiàn)出較好的解磷能力。

在較高的碳氮比條件下，解磷菌株P7 的溶磷能力較好，但趙小蓉等[14]在對2 株青霉的研究中發(fā)現(xiàn)，碳氮比越小，溶磷能力越強，說明不同菌株有不同的適宜碳氮比，所以判斷解磷菌解磷能力時應考慮培養(yǎng)基中碳氮比是否合適。

不同營養(yǎng)條件對解磷菌株P7 分泌有機酸的影響是較為顯著的。解磷菌株P7 主要分泌蘋果酸和丁二酸，其次是檸檬酸、酒石酸、草酸、馬來酸和富馬酸，且分別以葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、D-半乳糖為唯一碳源時，主要分泌蘋果酸，分別以乳糖、蔗糖、麥芽糖為唯一碳源時，主要分泌丁二酸。研究結果表明，在發(fā)酵液中營養(yǎng)條件不同的情況下，解磷菌株分泌有機酸的種類和含量均會發(fā)生不同程度的變化。已有研究結果表明，以蔗糖和果糖為唯一碳源時，檸檬酸桿菌以分泌乙酸為主，當唯一碳源轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟呛望溠刻菚r，檸檬酸桿菌以分泌葡萄糖酸為主[27]。以葡萄糖為碳源、以NH4+-N 為氮源、碳氮比為8∶1 時，假單胞菌株主要分泌蘋果酸[17]，這與Marra 等[28]的研究結果相同，而劉輝等[29]的研究結果顯示熒光假單胞菌株主要分泌草酸。

以D-半乳糖為唯一碳源、以硝酸鉀為唯一氮源、以磷酸鎂為唯一磷源時，發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性均較高，而以可溶性淀粉為唯一碳源、以硫酸銨為唯一氮源、以磷酸鈣為唯一磷源時，發(fā)酵液中水溶性磷含量均較高，與堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)的結果相反。這說明在磷酸鈣的溶解過程中堿性磷酸酶無顯著作用。已有研究結果表明，堿性磷酸酶主要在有機磷的降解過程中起到較大的作用[30]。

本研究中對不同碳氮磷源條件下解磷菌株P7的溶磷效果及發(fā)酵液中有機酸含量和堿性磷酸酶活性進行了研究，但是解磷菌株的生長不僅受到營養(yǎng)因子的影響，還受到溫度、初始pH、環(huán)境脅迫等因素的影響。為研制適用于南疆紅棗園的專用微生物菌肥，下一步將通過大田試驗來研究解磷菌株P7 對南疆棗園棗樹根際土壤養(yǎng)分以及棗果實品質(zhì)的影響。