水提法提取荸薺多糖及其體外抗氧化活性研究

張方艷,張雯雯,朱桂蘭,郭娜,代歡歡,楊俊杰

(合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,安徽 合肥,230061)

荸薺(Heleocharisdulcis)屬于單子葉莎草科,又稱馬蹄、芍、鳧茈、地栗、通天草等[1-4]。荸薺原產(chǎn)于中國和印度,在我國已有3 000多年的栽培歷史,廣泛分布在長江流域及以南各省的低洼地區(qū),我國種植面積超5萬hm2,年產(chǎn)鮮果百萬噸以上,其中廣西是我國最大的荸薺主產(chǎn)區(qū),以桂林市和賀州市種植居多,產(chǎn)量居全國首位[5-7]。荸薺以其地下球莖為食用器官,可鮮食、熟食或供藥用,是一種優(yōu)良的藥食同源果蔬類食品[8-11]。荸薺肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富、汁多味甜、清脆爽口,有南方“地下雪梨”,北方“江南人參”之美譽(yù)[12]。荸薺削皮生食脆甜多汁、生津止渴,烹飪可做成美味佳肴,葷素皆宜[13]。荸薺不但口感好,營養(yǎng)也高,含有蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維、黃酮類、甾醇等諸多功能活性成分[14],研究表明荸薺皮渣中含有酚類物質(zhì)[15]、膳食纖維[16]、天然色素[17-18]、多糖[6,19]等物質(zhì),因此荸薺具有清熱解毒、涼血生津、利尿通便、化濕祛痰、消食除脹的功效。據(jù)研究報(bào)道,在荸薺中所含生物類多糖具有促進(jìn)人體生長發(fā)育、加快體內(nèi)3大物質(zhì)(糖、脂肪、蛋白質(zhì))代謝、維持生理功能的需要、調(diào)節(jié)酸堿平衡等功能[20]。

多糖又稱多聚糖,多糖是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外的又一類重要信息分子,具有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn),多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗衰老、抗凝血、降血糖和環(huán)境治理等作用[21-22]。因其來源廣泛,沒有毒副作用,而且藥物質(zhì)量通過化學(xué)手段容易控制等優(yōu)點(diǎn),成為當(dāng)今新藥及功能保健品和綠色食品添加劑發(fā)展的新方向[9]。

目前關(guān)于荸薺的研究大多是以荸薺皮為原料,提取荸薺多糖,以全荸薺為原料研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以全荸薺為原料優(yōu)化水提法提取多糖,考察提取劑濃度、料液比、解析時(shí)間及提取時(shí)間等因素的影響,并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上正交優(yōu)化提取工藝,提高多糖的提取率并對(duì)其進(jìn)行抗氧化性能測定,可以為該植物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

荸薺購買于安徽省合肥市廬江縣。

葡萄糖、抗壞血酸、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉,天津博迪化工有限公司；苯酚,西隴化工股份有限公司；濃硫酸,上海振企化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶,河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；無水乙醇、過氧化氫,江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；DPPH,上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；水楊酸,上海科豐實(shí)業(yè)有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備

GZX-9023MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；FA2004B型電子分析天平,上海市安亭電子儀器廠；LD-T350高速萬能粉碎機(jī),上海頂帥電器有限公司；Allegra64R型電動(dòng)離心機(jī),美國貝克曼庫爾特；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇市杰瑞爾電器有限公司；V-5100B可見分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司；SHZ-D型循環(huán)水真空泵,河南佰澤儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

選取新鮮的荸薺,去除病蟲害果實(shí),洗凈切片,60 ℃烘干,用粉碎機(jī)粉碎后,過60目篩獲得荸薺干粉,備用。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,置于100 mL容量瓶中,加水適量使其溶解,定容。用移液管精密移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別置于20 mL試管中,依次加水至2.0 mL,另加1.0 mL體積分?jǐn)?shù)5%的苯酚溶液,搖勻,分別迅速滴加濃硫酸5.0 mL,在室溫下顯色20 min,以空白校正零點(diǎn),于490 nm處檢測其吸光值,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]。

1.2.3 荸薺多糖的提取

精確稱取荸薺干粉1.0 g,置于100 mL燒杯中,按設(shè)定的料液比(荸薺干粉∶乙醇)加入設(shè)定濃度的乙醇溶液解析設(shè)定的時(shí)間,乙醇解析完成后,加入80 ℃,按液料比20∶1(mL∶g)加入蒸餾水,按設(shè)定的時(shí)間在80 ℃下恒溫?zé)崴醄24],將經(jīng)過熱水浸提后的上清液減壓抽濾至10 mL的容量瓶中,用蒸餾水洗滌殘?jiān)?～3次,將洗滌液轉(zhuǎn)至容量瓶中,定容,得到荸薺多糖提取液。

1.2.4 多糖含量的測定

將10 mL荸薺多糖提取液稀釋25倍,取0.5 mL稀釋液于25 mL具塞試管中,加水稀釋至2 mL,加入1.0 mL 5%的苯酚溶液,搖勻,分別迅速滴加濃硫酸5.0 mL,在室溫下顯色20 min,以空白校正零點(diǎn),于490 nm處檢測其吸光值,代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計(jì)算樣品中多糖的濃度,荸薺多糖的得率計(jì)算如公式(1)所示[25-26]：

(1)

式中：ρ,荸薺多糖的濃度,mg/mL；V,樣品溶液總體積,mL；m,荸薺干粉的質(zhì)量,g；25,稀釋倍數(shù)。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)荸薺多糖得率的影響

分別稱取1.0 g的荸薺干粉于5個(gè)100 mL燒杯中,加入50%、60%、70%、80%、90%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液5 mL,設(shè)定解析時(shí)間為30 min,浸提時(shí)間20 min,按照1.2.3中的方法處理提取液,再按照1.2.4中的方法測定荸薺多糖的得率,分析乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)荸薺多糖得率影響。

1.2.5.2 料液比對(duì)荸薺多糖得率的影響

分別稱取1.0 g荸薺干粉于5個(gè)100 mL燒杯中,加入80%乙醇溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL即料液比1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9(g∶mL),設(shè)定解析時(shí)間為30 min,浸提時(shí)間20 min,提取液處理及多糖得率測定同1.2.5.1。

1.2.5.3 解析時(shí)間對(duì)荸薺多糖得率的影響

分別稱取1.0 g的荸薺干粉于5個(gè)100 mL燒杯中,再分別加入80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液5 mL,解析20、25、30、35、40 min,設(shè)定浸提時(shí)間20 min,提取液處理及多糖得率測定同1.2.5.1。

1.2.5.4 提取時(shí)間對(duì)荸薺多糖得率的影響

分別稱取1.0 g的荸薺干粉于5個(gè)100 mL燒杯中,再分別加入80%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液5 mL,設(shè)定解析時(shí)間為30 min,浸提10、20、30、40、50 min,提取液處理及多糖得率測定同1.2.5.1。

1.2.6 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),由于乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)荸薺多糖得率影響較小,故排除此因素的影響,選取料液比、解析時(shí)間、提取時(shí)間為考察條件,進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 L9(33)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 L9(33) orthogonal experimental factors and level design

1.2.7 荸薺多糖抗氧化活性的測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除活性按照YOSHIDA等[27]方法進(jìn)行測定?？箟难?VC)作為天然水溶性抗氧化劑,具有較強(qiáng)的還原性,因此本實(shí)驗(yàn)將VC設(shè)為陽性對(duì)照,精確移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL樣品溶液或VC對(duì)照溶液3.0 mL于25 mL具塞試管中,分別加入80 mg/L DPPH的乙醇溶液4.0 mL,蒸餾水1.0 mL,避光,搖勻,放置30 min。以無水乙醇作為對(duì)照,在517 nm處測定樣品吸光值[28],DPPH自由基清除能力計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.2.7.2 ·OH清除能力的測定

以VC作為陽性對(duì)照,在25 mL具塞試管中依次加入濃度為6 mmol/L FeSO3溶液2.0 mL,濃度為6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2.0 mL,精確移取質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的荸薺多糖粗提液或VC溶液3.0 mL,濃度為6 mmol/L H2O2溶液2.0 mL,于37 ℃條件下反應(yīng)0.5 h。用蒸餾水代替荸薺多糖粗提液作空白對(duì)照,在510 nm處測定樣品吸光度,平行測定3次,取平均值記錄數(shù)據(jù),·OH清除能力計(jì)算如公式(3)所示[29]：

(3)

式中：Ax,樣品液吸光度；A0,空白對(duì)照的吸光度；Ax0,不加水楊酸時(shí)提取液自身的吸光度。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS21、Origin Pro 9.0及Graph Pad Prism軟件分別對(duì)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)及抗氧化試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別以葡萄糖質(zhì)量濃度和樣品在490 nm處吸光度值作為橫、縱坐標(biāo),得到線性回歸方程：y=9.667 9x-0.004,R2=0.999 5。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響

由圖1可知,隨著提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,荸薺多糖的得率增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),荸薺多糖得率最大為19.92%,這可能是因?yàn)檩┧j中的多糖在該濃度的溶劑中溶出擴(kuò)散程度幾乎達(dá)到最大所致；超過80%,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,荸薺多糖得率降低,高濃度的乙醇可能會(huì)促使其他醇溶性物質(zhì)溶出,導(dǎo)致多糖的相對(duì)含量降低,且乙醇容易揮發(fā),導(dǎo)致多糖提取量隨之下降[30]。因此80%乙醇為荸薺多糖的最佳提取體積分?jǐn)?shù)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of the ethanol concentration on the extraction yield of polysaccharide

2.2.2 料液比對(duì)多糖得率的影響

如圖2所示,多糖得率在料液比為1∶5(g∶mL)時(shí)最大,為16.59%,之后隨著料液比增加多糖得率下降。得率的增大是由于提取劑體積增大,提取出的多糖含量增加,而當(dāng)料液比過大時(shí),醇溶性雜質(zhì)會(huì)隨著多糖分子的溶出而溶出[31],使多糖的相對(duì)含量降低,導(dǎo)致得率下降。因此料液比1∶5(g∶mL)為荸薺多糖的最佳提取比例。由圖2可知,料液比對(duì)荸薺多糖的得率影響顯著,但由于操作過程中平行組間測定時(shí)間過長或過短導(dǎo)致誤差偏大。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides

2.2.3 解析時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖3可知,隨著解析時(shí)間的延長,多糖得率增大；當(dāng)解析30 min時(shí)多糖得率最大為15.23%;隨后隨著解析時(shí)間的再延長多糖得率降低。分析可得,隨著乙醇解析時(shí)間的增加,被溶出的多糖相對(duì)含量增加,得率增大；如果解析時(shí)間過長,會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)溶出增多,多糖相對(duì)含量下降,致使得率降低。因此解析30 min為荸薺多糖的最佳解析時(shí)間。由圖3可知,解析時(shí)間對(duì)荸薺多糖的得率影響顯著,但由于解析結(jié)束后未同時(shí)進(jìn)入提取階段導(dǎo)致誤差偏大。

圖3 解析時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of parsing time on the extraction yield of polysaccharides

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖4可知,隨著恒溫?zé)崴崛r(shí)間延長,多糖得率增大,當(dāng)提取20 min時(shí),多糖得率最大,為16.97%；之后隨著提取時(shí)間再延長多糖得率降低。據(jù)圖4分析,提取時(shí)間延長,解析出的多糖被分解的越多,造成損失[32],從而導(dǎo)致得率降低。因此提取20 min為荸薺多糖的最佳提取時(shí)間。由圖4可知,提取時(shí)間對(duì)荸薺多糖的得率影響顯著,但由于提取結(jié)束后未同時(shí)測定導(dǎo)致誤差偏大。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of extration time period on the extraction yield of polysaccharides

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,可以看出4個(gè)因素中料液比、解析時(shí)間及提取時(shí)間對(duì)荸薺多糖的得率影響較為明顯,而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)荸薺多糖得率的影響不大,因此選取提取時(shí)間、料液比及解析時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)[33-34]。

由表2中R值可知,3種因素對(duì)荸薺多糖得率影響的主次順序?yàn)榱弦罕?解析時(shí)間>提取時(shí)間,料液比成為影響荸薺多糖得率的首要因素,其次是解析時(shí)間、提取時(shí)間。荸薺多糖的最佳提取參數(shù)組合為A2B3C2,即料液比1∶5(g∶mL)、解析時(shí)間32 min、提取時(shí)間20 min。

用SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,由表3可知,因素A、B、C在P<0.01水平上有極顯著性差異。

表2 L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 L9(33) orthogonal array design and experimental results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)工藝組合料液比1∶5(g∶mL)、解析時(shí)間32 min、提取時(shí)間20 min,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明,在該組合工藝條件下,荸薺多糖平均提取率為17.86%,證明該正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 荸薺多糖抗氧化活性的研究

2.4.1 多糖提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖5可知,在本研究的濃度范圍內(nèi),清除率隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增大。VC對(duì)DPPH自由基具有很強(qiáng)的清除能力,當(dāng)VC質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí),清除效果已經(jīng)達(dá)到85%。與VC相比,荸薺多糖對(duì)DPPH自由基清除作用稍差,當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL,其清除率最高可達(dá)73.68%。經(jīng)數(shù)據(jù)分析,荸薺多糖對(duì)DPPH自由基的IC50為0.142 mg/mL,其IC50小于10 mg/mL,說明荸薺多糖具有較好的抗氧化效果。VC對(duì)DPPH自由基的IC50明顯小于荸薺多糖,所以VC對(duì)DPPH自由基清除效果優(yōu)于荸薺多糖。

圖5 多糖粗提液對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging effect of crude polysaccharide on DPPH free radicals

2.4.2 多糖粗提液對(duì)·OH的清除能力

由圖6可知,在本研究的濃度范圍內(nèi),清除率隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增大。VC對(duì)·OH具有很強(qiáng)的清除能力,當(dāng)VC質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí),清除效果已經(jīng)達(dá)到85%。與VC相比,荸薺多糖對(duì)·OH清除作用稍差,當(dāng)荸薺多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),多糖對(duì)·OH的清除率最大為72.67%。多糖對(duì)·OH的IC50值為0.177 mg/mL。VC對(duì)·OH的IC50明顯小于荸薺多糖,所以VC對(duì)·OH清除效果優(yōu)于荸薺多糖。

圖6 多糖粗提液對(duì)·OH的清除能力Fig.6 The scavenging effect of crude polysaccharide on hydroxyl radical

3 結(jié)論與討論

通過水提法對(duì)全荸薺的多糖進(jìn)行提取,考察了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、解析時(shí)間、提取時(shí)間等對(duì)提取率的影響,通過L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)化確定的最優(yōu)工藝參數(shù)組合為A2B3C2,即料液比為1∶5(g∶mL)、解析時(shí)間32 min、浸提時(shí)間20 min,在此最佳條件下荸薺多糖得率為17.86%。體外抗氧化活性結(jié)果顯示,荸薺多糖具有良好的抗氧化性,而且荸薺多糖對(duì)DPPH自由基和·OH的清除率與其濃度呈正相關(guān)性,但效果均小于同一濃度下VC的清除力。荸薺多糖對(duì)DPPH自由基和·OH的IC50值分別為0.142和0.177 mg/mL,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL對(duì)DPPH自由基和·OH的清除率分別為73.98%和72.67%。荸薺多糖可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、化妝品、保健品等行業(yè),有關(guān)荸薺多糖的抗氧化機(jī)理及構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步探討。