體外仿生消化對(duì)金銀花醇提物成分及抗氧化活性的影響

孫純勇,王玲娜,顏培正,張永清,李佳,趙東升

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南,250355)

金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花,是我國(guó)傳統(tǒng)藥食兩用大宗中藥材之一,具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[1]。金銀花主要含有有機(jī)酸、黃酮、環(huán)烯醚萜、三萜等功效成分[2-3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,金銀花具有抗氧化、降血脂、抗炎、保肝利膽、抗病毒、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[3]。

體外仿生消化法是根據(jù)人體或動(dòng)物的生理學(xué)功能,模擬胃腸道環(huán)境的生物學(xué)特性,能夠在一定程度上反映某些藥物或食物在人體胃腸道中的動(dòng)態(tài)變化情況的一種方法[4-5],因而在藥食兩用植物的體外模擬胃腸道消化研究中已得到廣泛用[6-8]。目前有關(guān)金銀花抗氧化方面的研究主要集中在其提取物本身所含化學(xué)成分及體外活性的測(cè)定[9-11],這僅能單純地分析其原有化學(xué)成分含量及抗氧化活性,但不能真實(shí)反映在胃腸消化過程中金銀花有效成分和抗氧化活性的變化。基于此,本研究采用體外仿生消化法探究金銀花中12種主要功能成分及抗氧化活性的變化規(guī)律,以期為金銀花體外模擬胃腸消化提供一定的理論指導(dǎo),同時(shí)也為正確認(rèn)知和評(píng)價(jià)金銀花對(duì)人體的生理學(xué)活性提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

金銀花,山東平邑,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾；磷酸鈉、鉬酸銨、硫酸亞鐵(AR),天津市永大化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶(≥ 250 U/mg)、胰蛋白酶(8×USP)、豬膽鹽,美國(guó)Macklin公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉(均為分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；乙腈、甲醇,賽默飛世爾科技有限公司；木犀草苷(Y13 J10H93050)、新綠原酸(P20A11L121936)、蘆丁(Y24F11Y17051)、綠原酸(Y20A11K111541)、異綠原酸B(P17 N11L131404)、異綠原酸A(Y24 N8Y49009)、隱綠原酸(P16A10U95423)、馬錢苷酸(K17S11B724207)、馬錢苷(P24O11F128801)、異綠原酸C(P03 N11L1-29757)、斷氧化馬錢苷(P27 N8L49194)、金絲桃苷(P14A11F121347)(純度大于98%),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

T6紫外-可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司；D-37520冷凍離心機(jī),德國(guó)Thermo Electron公司；Alpha 1-4 LD Plus凍干機(jī),CHRIST；-80 ℃冰箱,青島海爾特種電器有限公司；全溫振蕩器,太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；IKA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；2690高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司；ZORBAX SB-C18色譜柱,美國(guó)Agilent公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 金銀花體外模擬消化

2.1.1 金銀花醇提物及樣品溶液的制備[12]

金銀花藥材粉碎,過60目篩,取粉末500 g,加10倍體積65%乙醇,于75 ℃下回流提取1 h,抽濾；濾渣加5倍體積65%乙醇,提取0.5 h,抽濾。合并濾液,減壓濃縮,凍干,即得金銀花醇提物。精密稱取3.0 g金銀花醇提物溶于200 mL生理鹽水,制成15 mg/mL樣品溶液備用。

2.1.2 金銀花醇提物模擬胃腸消化[13-14]

消化過程分為2個(gè)階段：胃液消化和腸液消化。模擬胃消化液：精密稱量2.0 g胃蛋白酶,加50 mL 0.01 mol/L HCl溶液溶解,制成模擬胃消化液;模擬腸消化液：分別精密稱量0.4 g胰蛋白酶、2.5 g豬膽鹽,加100 mL 0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液溶解,制成模擬腸消化液。

胃液消化：分別量取20.0 mL金銀花醇提物樣品溶液,置50 mL離心管,恒溫水浴加熱至37 ℃,1 mol/L HCl溶液調(diào)pH 2.0,加4.0 mL模擬胃消化液作為模擬胃液組；胃酸對(duì)照組和空白對(duì)照組分別加入與樣品溶液等體積的0.01 mol/L HCl溶液和生理鹽水,并且不調(diào)整pH。37 ℃恒溫水浴搖床中消化2.0 h(避光),消化過程中,自0 h開始,每隔0.5 h取樣1次,90 ℃水浴1 min滅酶,13 000 r/min離心15 min(4 ℃),上清液置-80 ℃儲(chǔ)存。

腸液消化：模擬胃液組樣品溶液仍具有胃蛋白酶活性,須經(jīng)90 ℃水浴滅活1 min。以1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液調(diào)pH 7.0,加4.0 mL模擬腸消化液作為模擬腸液組；胃液消化產(chǎn)物中加等體積0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液代替腸液作為腸液空白組。37 ℃恒溫水浴搖床中消化2.0 h(避光)。取樣方式同胃液消化,90 ℃水浴滅酶1 min,低溫離心后上清液于-80 ℃保存。

未加消化酶的樣品溶液作為空白對(duì)照組,與胃酸對(duì)照組、腸液空白組一并用于分析模擬體外消化過程中pH值等化學(xué)環(huán)境因素對(duì)金銀花醇提物化學(xué)成分和抗氧化活性的影響。

2.2 金銀花醇提物消化前后化學(xué)成分含量的測(cè)定[15]

2.2.1 色譜條件

HPLC：Waters 2690型,色譜柱：C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相：A為0.1%磷酸、B為乙腈,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,流速1 mL/min,柱溫：室溫,進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、金絲桃苷、蘆丁、木犀草苷、馬錢苷酸、馬錢苷、斷氧化馬錢苷12種標(biāo)準(zhǔn)品適量制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 含量測(cè)定

將“2.1.2”中金銀花醇提物的胃、腸消化液用0.22 μm濾膜過濾,進(jìn)樣。分析消化前后金銀花醇提物中主要活性成分含量。

2.3 體外模擬消化對(duì)金銀花醇提物抗氧化性的影響

2.3.1 總體抗氧化活性測(cè)定

在王謝祎等[16]研究方法基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)。分別取3 mol/L H2SO3、0.02 mol/L 鉬酸銨和0.14 mol/L Na3PO3溶液各1.0 mL,加蒸餾水至5.0 mL作為空白對(duì)照組,在695 nm處測(cè)定吸光度記為A0。取1.0 mL樣品溶液為反應(yīng)組,在695 nm處測(cè)定吸光度記為Ai。總體抗氧化能力計(jì)算如公式(1)所示：

ΔA=Ai-A0

(1)

式中：ΔA,吸光度差值；A0,空白組吸光度；Ai,樣品溶液吸光度。

2.3.2 ·OH清除能力測(cè)定

參照趙玉靜等[17]報(bào)道的方法并稍作改動(dòng)。分別取9 mmol/L 水楊酸-乙醇、9 mmol/L FeSO3、消化液各1.0 mL,加1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2,在510 nm處測(cè)定吸光度記為Ai。另以蒸餾水代替樣品為樣品空白組,在510 nm處測(cè)定吸光度記為A0,以蒸餾水替代H2O2為反應(yīng)空白組,在510 nm處測(cè)定吸光度記為Ai0。·OH清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

2.3.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照熊文等[18]報(bào)道的方法,以樣品溶液300 μL和DPPH自由基溶液3.0 mL作為樣品反應(yīng)組,在517 nm處測(cè)定吸光度記為Ai；以80% 甲醇 1.0 mL代替樣品溶液作為樣品空白組,在517 nm處測(cè)定吸光度記為A0；80%甲醇吸光度,在517 nm處測(cè)定吸光度記為At。

DPPH清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0和GraphPad prism 8.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。單因素方差分析中P<0.05表示差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson correlation test進(jìn)行相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)操作均重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 體外仿生消化過程中金銀花醇提物化學(xué)成分含量變化

從圖1可以看出,仿生消化前后金銀花醇提物中主要活性成分含量發(fā)生了較大變化。在模擬胃液消化過程中,綠原酸含量變化如圖2-a所示,消化后綠原酸含量為(0.642 6±0.000 2)mg/mL,較空白對(duì)照組上升了14.96%。如圖2-b顯示,隱綠原酸在模擬胃液中消化1.0 h后含量明顯上升并達(dá)最大,此時(shí)含量為(0.017±0.002)mg/mL,較空白對(duì)照組升高了20.17%；隨著消化進(jìn)程,隱綠原酸含量明顯降低并在2.0 h達(dá)到最小,此時(shí)含量為(0.012±0.003)mg/mL,降低了46.82%。新綠原酸(圖2-c)、異綠原酸A(圖2-d)在模擬胃液中0.5 h內(nèi)含量較空白對(duì)照組分別上升了46.00%、25.23%。在模擬胃液消化前后,金銀花6種酚酸類成分含量總體相對(duì)減少,這與萬坤等[19]研究結(jié)果相一致,說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境可促進(jìn)酚酸類成分的釋放酶解。在模擬腸液消化過程中,新綠原酸含量在0.5 h出現(xiàn)下降,1.0 h上升至最大值并逐漸下降至穩(wěn)定；綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、B、C等成分消化前后無明顯變化(P>0.05),0 h酚酸成分含量低是因?yàn)閜H環(huán)境的改變促使酚酸類成分中的酚羥基被酶解或被結(jié)合,從而使其含量下降,但對(duì)比消化前后,可知腸液消化環(huán)境對(duì)酚酸類成分無顯著影響。

圖1 混標(biāo)、未消化樣品、胃消化樣品和腸消化樣品典型色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of mixed standard,undigested sample,gastric digestion sample and intestinal digestion sample 注：S-混標(biāo)、A-未消化樣品、B-胃消化樣品和C-腸消化樣品；1-新綠原酸；2-馬錢苷酸；3-綠原酸；4-隱綠原酸；5-馬錢苷；6-斷氧化馬錢苷；7-蘆丁；8-金絲桃苷；9-異綠原酸B；10-異綠原酸A；11-異綠原酸C；12-木犀草苷

a-綠原酸；b-隱綠原酸；c-新綠原酸；d-異綠原酸A；e-異綠原酸B；f-異綠原酸C圖2 仿生消化過程中酚酸類成分含量變化Fig.2 Changes of phenolic acid content during bionic digestion

模擬胃消化過程中,黃酮類成分含量變化趨勢(shì)與酚酸類成分較為相似,如圖3-a和圖3-b所示,0.5 h的模擬胃液組中蘆丁、金絲桃苷含量分別升高了11.91%和114.44%。1.0 h模擬胃液組中木犀草苷含量上升至最大值為(0.005 2±0.000 3)mg/mL(圖3-c),較0 h時(shí)升高了40.33%。然而,2.0 h模擬胃液組中金絲桃苷含量相較于空白對(duì)照組降低了19.58%。模擬腸消化0 h時(shí)(圖3-a),蘆丁含量明顯低于空白對(duì)照組,僅為空白對(duì)照組的12.78%,且呈下降趨勢(shì)。模擬腸液中金絲桃苷消化前后無明顯變化(P>0.05),但含量?jī)H為空白對(duì)照組的10.54%。因此,在模擬胃液消化過程中,黃酮類成分含量總體減少,這與李如蕊等[20]、張露等[21]報(bào)道結(jié)果一致,說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境可促進(jìn)黃酮類成分的酶解。

a-蘆丁；b-金絲桃苷；c-木犀草苷?qǐng)D3 仿生消化過程中黃酮類成分含量變化Fig.3 Changes of flavonoid content during bionic digestion

如圖4-a所示,模擬胃液組在消化0 h時(shí),馬錢苷酸含量為(0.007 5±0.000 2)mg/mL,明顯低于空白對(duì)照組。此時(shí)模擬胃液組中馬錢苷含量為(0.060 1±0.001 7)mg/mL(圖4-b),明顯高于空白對(duì)照組。而斷氧化馬錢苷消化前后含量無明顯變化(P>0.05)。在胃液消化前后,金銀花環(huán)烯醚萜類成分含量總體無明顯變化,說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境對(duì)環(huán)烯醚萜類成分影響較小。在體外模擬腸液消化過程中,相較于空白對(duì)照組,2.0 h內(nèi)金銀花環(huán)烯醚萜類成分含量無顯著性變化(P>0.05)。

a-馬錢苷酸；b-馬錢苷；c-斷氧化馬錢苷?qǐng)D4 仿生消化過程中環(huán)烯醚萜類成分含量變化Fig.4 Changes of iridoids content during bionic digestion

3.2 仿生消化后金銀花醇提物抗氧化活性變化

3.2.1 總體抗氧化活性能力

金銀花醇提物及仿生消化后總體抗氧化能力結(jié)果(圖5-a)顯示,空白對(duì)照組(B)、模擬胃液組(GJ)和模擬腸液組(IJ)總體抗氧化能力分別為(0.526±0.023)、(0.305±0.003)和(0.202±0.006)。

a-總體抗氧化能力；b-·OH清除率；c-DPPH自由基清除率圖5 仿生消化后金銀花醇提物抗氧化能力變化Fig.5 Changes of antioxidant capacity of ethanol extract of honeysuckle after biomimetic digestion

相較于B,金銀花醇提物經(jīng)過模擬胃液和模擬腸液消化后總體抗氧化能力顯著降低,GJ總體抗氧化能力降低了44.36%,而IJ降低了64.98%。

3.2.2 ·OH清除能力

金銀花醇提物及模擬消化后·OH清除能力如圖5-b所示,金銀花醇提物經(jīng)過仿生消化后,空白對(duì)照組(B)、模擬胃液組(GJ)和模擬腸液組(IJ)·OH清除能力分別為(97.51±0.3)%、(79.07±2.85)%、(11.99±1.34)%,與B相比,GJ的·OH清除能力降低了18.91%,而IJ降低了87.70%。

3.2.3 DPPH自由基清除能力

金銀花醇提物及仿生消化后DPPH自由基的清除能力結(jié)果如圖5-c所示,空白對(duì)照組(B)、模擬胃液組(GJ)和模擬腸液組(IJ)的DPPH自由基清除率分別為(88.37±0.15)%、(14.55±3.17)%和(6.56±0.48)%,與B相比,GJ的DPPH自由基清除能力降低了85.53%,而IJ降低了92.58%。

3.3 消化前后成分含量變化與其抗氧化活性之間的相關(guān)性分析

由圖6可知,在模擬胃腸道消化過程中,金銀花醇提物消化前后的總體抗氧化能力、·OH清除能力以及DPPH自由基清除能力與隱綠原酸、異綠原酸A、B、C以及蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷含量之間呈良好的正相關(guān)性(P<0.05)。

圖6 仿生消化前后成分含量變化與抗氧化活性之間 的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between the content changes of components and their antioxidant activities before and after bionic digestion

此外,金銀花醇提物DPPH自由基清除能力和總體抗氧化能力之間也存在顯著的相關(guān)性(P<0.05),說明酚酸以及黃酮類成分含量能夠較好地反映金銀花醇提物的DPPH自由基清除能力和總體抗氧化能力。

4 討論與結(jié)論

4.1 討論

本研究利用體外仿生消化法研究了金銀花醇提物中酚酸類、黃酮類及環(huán)烯醚萜類成分含量的變化規(guī)律,并以總體抗氧化能力、·OH清除能力和DPPH自由基清除能力為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)金銀花醇提物消化前后抗氧化活性的變化情況。

金銀花醇提物在模擬胃液消化中環(huán)烯醚萜類成分含量無顯著性差異,酚酸類和黃酮類成分含量出現(xiàn)下降趨勢(shì),尤其新綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和金絲桃苷等成分。空白對(duì)照組中異綠原酸A、異綠原酸C和隱綠原酸含量呈逐漸上升并趨于穩(wěn)定,推測(cè)37 ℃環(huán)境會(huì)促進(jìn)金銀花醇提物中酚酸類物質(zhì)的釋放。而在胃酸對(duì)照組和模擬胃液組中,隱綠原酸、新綠原酸和異綠原酸B均出現(xiàn)含量先升高后下降的規(guī)律,在1.0 h達(dá)最大值,可推測(cè)胃蛋白酶和胃酸環(huán)境對(duì)它們有一定的酶解作用,并在1.0 h后酚酸類物質(zhì)的酶解速度大于釋放速度。模擬腸液消化過程中,由于溶液酸堿環(huán)境的改變,使得酚酸類、黃酮類和環(huán)烯醚萜類物質(zhì)在0 h均出現(xiàn)降低情況,且降幅較大,尤其蘆丁含量降幅最大。腸液對(duì)照組和模擬腸液組中因腸液堿性增加,酚酸類化合物分子結(jié)構(gòu)中多具有酚羥基,容易發(fā)生反應(yīng)。環(huán)烯醚萜類成分雖受到酸堿環(huán)境影響,而模擬胃、腸消化過程中無顯著性變化,從而胃、腸溶液對(duì)環(huán)烯醚萜類成分不具有消化作用。由此可見,胃腸環(huán)境對(duì)酚酸及黃酮類成分的酶解作用較明顯,而對(duì)酚酸類、黃酮類成分的具體酶解機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探究。

通過對(duì)比仿生消化前后的抗氧化能力可知,金銀花醇提物在模擬胃腸消化過程中抗氧化能力隨著酚酸類、黃酮類成分含量的下降而降低,說明經(jīng)過胃液消化后金銀花中的抗氧化活性成分部分被酶解,導(dǎo)致其抗氧化能力降低。金銀花在模擬腸液消化過程中腸液消化組的總體抗氧化能力和·OH清除能力與成分含量的變化趨勢(shì)一致,即在模擬腸液消化過程中,腸液酸堿環(huán)境、胰蛋白酶、膽鹽環(huán)境在促進(jìn)酚酸類、黃酮類成分的降解或轉(zhuǎn)化的同時(shí),抗氧化能力也隨之明顯降低。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,金銀花醇提物仿生消化前后的抗氧化能力與其中主要成分隱綠原酸、異綠原酸A、B、C以及蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷的含量變化成正相關(guān),且酚酸以及黃酮類成分含量能夠較好地反映金銀花醇提物的DPPH自由基清除能力和總體抗氧化能力。因此,酚酸類、黃酮類成分是金銀花主要的抗氧化活性成分,這與徐文流等[22]、付晶晶等[23]、朱小峰等[24]報(bào)道的結(jié)果相一致。

4.2 結(jié)論

本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究金銀花體內(nèi)胃腸道消化以及正確認(rèn)識(shí)金銀花對(duì)人體的生物學(xué)活性提供了一定的理論指導(dǎo),同時(shí)也為金銀花提取物在保健食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)及應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。但金銀花醇提物中化學(xué)成分因其自身性質(zhì)差異在模擬胃腸道環(huán)境中表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性,其結(jié)構(gòu)變化、降解途徑、代謝產(chǎn)物及各成分之間是否存在相互作用仍值得進(jìn)一步探究。