富含共軛脂肪酸的發酵核桃乳的穩定性研究

黃周群,毛丙永,崔樹茂,唐鑫,趙建新,張灝

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

核桃作為藥食同源食品,富含亞油酸和亞麻酸,一些雙歧桿菌(如短雙歧桿菌CCFM683)[1]和乳桿菌(如植物乳桿菌ZS2058)[2]能將游離的亞油酸和亞麻酸轉化為共軛脂肪酸,主要通過脂肪酸水合酶、氧化還原酶、乙酰乙酸脫羧酶催化,經過羥基化、脫水、雙鍵異構、水合和脫水等步驟實現[3],從而提高其功能特性。核桃中亞油酸和亞麻酸主要是以甘油三酯的形式存在,用脂肪酶將結合態水解成游離態,再接種乳酸菌發酵,可制備富含共軛脂肪酸的發酵核桃乳。但游離態脂肪酸易氧化,且存在蛋白質及固體顆粒聚沉、油脂上浮的問題[4]。目前市場上存在養元六個核桃、伊利核桃乳、甄養腦立方原漿核桃乳等調配型的核桃乳飲料,除了短暫上市過的養元發酵核桃乳,還未見有成熟的發酵型核桃乳產品。

影響植物蛋白飲料穩定性的因素有很多,主要包括粒度、黏度、熱處理、pH值、糖類、穩定劑等[5]。通過均質減小介質粒徑、調節pH遠離植物蛋白等電點、選擇合適的殺菌條件避免微生物生長繁殖、添加穩定劑增強其乳化性能、提高分散介質的黏度等措施,可提高植物蛋白飲料的穩定性。

共軛脂肪酸與人類健康密切相關,具有抗癌[6]、抗動脈粥樣硬化[7]、抗炎癥[8]等功能,但極易被氧化。核桃本身含有維生素E和酚類等抗氧化物質,但因其自身含量偏低并不足以對油脂的氧化穩定產生顯著性作用,可額外添加一些抗氧化劑來延緩氧化。核桃中的不飽和脂肪酸會由于脂氧合酶的催化造成油脂酸敗,而55或者60 ℃處理2～10 min可以使得核桃中的脂氧合酶失活[9]。

本研究以核桃仁為原料制成核桃乳,利用具有較高共軛脂肪酸轉化能力的短雙歧桿菌CCFM683的發酵優勢,將其中豐富的脂肪酸底物轉化為共軛脂肪酸。首先篩選出合適的穩定劑,并進行復配,其次通過脂肪酸和揮發性風味物質分析篩選出合適的抗氧化劑,確定在此條件下的最優產品配方,并進行產品喜好度評價,為發酵型植物蛋白飲料的穩定性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

核桃、白砂糖等,江蘇省無錫市歐尚超市；食品級維生素C、維生素E、D-異抗壞血酸鈉、茶多酚,河南天得商貿有限公司；食品級無水葡萄糖,南京泰成生物技術有限公司；果膠、結冷膠、羧甲基纖維素鈉、黃原膠,廣州健科生物技術有限公司；來自米曲霉的脂肪酶,Aladdin公司；短雙歧桿菌CCFM683,實驗室保藏菌種。

1.1.2 試劑

葡萄糖、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、吐溫 80、十二烷基硫酸鈉,國藥集團化學試劑有限公司；十五烷酸甲酯內標物、14%(體積分數)三氟化硼-甲醇溶液和重氮甲烷,Sigma-Aldrich公司,用于脂肪酸分析的其他化學藥品均為分析純。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1115B型超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司；FE20型pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋,日本SANYO公司；UV-2450紫外分光光度計,日本島津公司；5424R臺式高速離心機,德國Eppendorf；GCMS-TSQ 8000 Evo氣相色譜三重四級桿質譜聯用儀,美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基的配制

mMRS液體培養基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏10、葡萄糖20、乙酸鈉2、酵母粉5、檸檬酸氫二銨2、K2HPO4·3H2O 2.6、MgSO4·7H2O 0.1、MnSO4·H2O 0.05、吐溫80 1 mL、半胱氨酸氨酸鹽0.5,pH 6.2～6.4,115 ℃滅菌20 min。

mMRS固體培養基：額外加2%(質量分數)的瓊脂粉。

1.3.2 發酵菌株的活化培養

從實驗室菌種庫中挑選出1株已經證實具有較高共軛脂肪酸轉化能力的菌株——短雙歧桿菌CCFM683,它在添加了0.5 mg/mL亞油酸底物的mMRS液體培養基上,37 ℃厭氧培養18 h,共軛亞油酸的轉化率為97.91%[10]。從-80 ℃冰箱中取出短雙歧桿菌CCFM683的保菌管,置于冰中,融化后從保菌管中蘸取少量菌液在mMRS固體板上劃線,置于厭氧工作站,37 ℃培養48 h。挑取單菌落,接入5 mL mMRS液體培養管,置于厭氧工作站,37 ℃培養18 h,傳代活化3次,以達到108～109CFU/mL的活菌數,3 000×g,離心3 min,并用無菌生理鹽水重復洗滌3次以備接種用。

1.3.3 發酵核桃乳的制備

核桃破殼取仁,加入4%(質量分數)Na2CO3、10%(質量分數)Ca(OH)2混合溶液[11],60 ℃處理15 min左右,用冷水反復沖洗多次去皮。加入純凈水,料水比為1∶5(g∶mL),用膠體磨磨漿,磨漿后在65 ℃、25 MPa的條件下均質[12],得到的料液用200目篩子過濾,得發酵基料。在其中加入60 U/mL的脂肪酶,37 ℃水解3 h,85 ℃滅菌20 min。每80 mL為1份,倒入無菌的100 mL瓶中。將短雙歧桿菌CCFM683接種到制備的核桃乳中,除了對照組之外,將菌株的初始接種量控制在107CFU/mL左右,37 ℃發酵20 h,得發酵核桃乳。

1.3.4 pH的測定

將發酵核桃乳樣品混合均勻,取約5 mL樣品至試管中,將pH計的電極插入試管,樣品液面沒過電極,點擊讀數測定其pH,平行測定3次。

1.3.5 乳酸菌活菌數的測定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中的方法,從每份樣品中吸取0.5 mL樣品,并與4.5 mL無菌生理鹽水溶液混合,選擇3個適宜稀釋梯度的樣品均液,各取1 mL放入無菌培養皿中,每皿中倒入15～20 mL mMRS瓊脂培養基,37 ℃培養48 h,計算各平板菌落數。

1.3.6 乳化穩定系數的測定

從不同乳化穩定劑配制好的發酵核桃乳中取樣,用1.0 g/L的十二烷基硫酸鈉溶液稀釋100倍,在500 nm處測定吸光度值A1；4 500×g離心5 min,取其上清液,同樣稀釋100倍后于500 nm處測定吸光度值A2,設穩定系數R=A2/A1,進行3次平行測定。R越大,代表樣品的乳化穩定性越高[13]。

1.3.7 離心沉淀率的測定

稱量15 mL離心管的質量m0,倒入10 mL發酵核桃乳,再稱取離心管和飲料的質量記為m1,3 800×g,離心30 min,緩緩倒掉離心管中的上清液,并擦去蓋子、管壁口附著的殘余液體,最后準確稱量離心管和沉淀的質量記為m2[14]。按公式(1)計算樣品的離心沉淀率：

(1)

離心沉淀率越大,說明發酵核桃乳的穩定性越差。

1.3.8 揮發性風味物質的分析

利用固相微萃取氣質聯用技術分析發酵核桃乳中揮發性風味物質[15]。稱取5 g樣品和1 g NaCl裝入20 mL的氣相萃取瓶中,自動進樣器將聚二甲基硅氧烷固相微萃取頭插入氣相瓶,50 ℃萃取30 min后解吸5 min,來提取樣品中的揮發性風味成分,從而進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：RTX-WAX毛細管(30 m×0.25 mm,0.25 mm)；分流比為10∶1,流速為1 mL/min,載氣為He,進樣口溫度225 ℃,初始柱溫30 ℃,保持3 min；以15 ℃/min的速率上升至225 ℃保持5 min。

質譜條件：電離方式EI離子源,電子能量70 eV,發射電流200 μA,檢測電壓1.4 kV,離子源溫度240 ℃,接口溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,質量掃描范圍：m/z30～500。

譜圖通過NIST 2001標準譜庫的檢索及標準品比對進行定性,并采用峰面積歸一化法定量。

1.3.9 脂肪酸組成分析

油脂的提取：按照FOLCH等[16]的方法提取樣品,取200 μL樣品加入4 mL氯仿-甲醇混合液(2∶1,體積比),以及適量的十五烷酸甲酯內標物,充分混勻,3 500×g,離心5 min,下層氯仿層與0.86%(質量分數)的NaCl溶液混合,并靜置分層。收集有機層過濾,氮吹除去有機溶劑,將提脂瓶保存于-20 ℃冰箱中。

游離脂肪酸甲酯化：對VOLKOV等[17]的方法稍加改進。用甲醇重懸樣品,并加入重氮甲烷,待黃色維持15 min后再次氮吹,重懸于正己烷,轉移至上樣小瓶,過0.22 μm有機濾膜后進行氣相色譜分析。

總脂肪酸甲酯化：參照文獻[18]的方法,將樣品加入0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液1 mL,65 ℃恒溫保持30 min。再加入14%(體積分數)的三氟化硼-甲醇溶液1 mL,70 ℃恒溫保持5 min,取出冷卻。繼續加入正己烷和飽和NaCl溶液,2 000×g離心5 min,取上層有機相,過有機濾膜進行氣相色譜分析。

采用GC-MS技術分析發酵核桃乳中的脂肪酸組成及含量。氣相色譜條件：色譜柱RTX-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣量1 μL,分流比10∶1,He作為載氣,進樣器溫度和檢測器溫度均為240 ℃,離子源溫度220 ℃,強度為70 eV3。程序升溫條件：初始溫度為150 ℃,以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃,同時保留10 min,再以4 ℃/min的速度升至240 ℃,并保留10 min。

由GC-MS測得的譜圖在NIST11標準譜庫的檢索及標準品比對進行定性,用面積歸一化法相對定量。

1.3.10 喜好度評價

喜好度評價的參與者為食品專業在校學生,根據GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓與管理評價員一般導則 第1部分：優選評價員》對感官候選人進行培訓,選擇30位評價員,男女人數相等。利用9點喜好度法對不同核桃香精和白砂糖添加量的發酵核桃乳進行感官評定[19],采用3位隨機數進行樣品的編號,對樣品的表觀、氣味、滋味和質地等各項指標進行喜好度評價。用整數1～9表示對樣品每項指標的喜好度,其中1為極不喜歡,2為相當不喜歡,3為一般不喜歡,4為有點不喜歡,5為既不喜歡也不討厭,6為有點喜歡,7為一般喜歡,8為相當喜歡,9為極喜歡。

1.3.11 數據處理

每組實驗進行3次平行測試,結果表示為平均值±標準偏差。使用GraphPad Prism8和Adobe Photoshop CC 2018進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 發酵核桃乳的基本指標

發酵核桃乳在1∶5(g∶mL)料水比下,添加60 U/mL的脂肪酶,37 ℃水解3 h,巴氏殺菌后接種CCFM683,發酵20 h左右,此時pH達到(4.45±0.02)左右,活菌數約為(8.96±0.03) lg CFU/mL,共軛脂肪酸含量最高達到(1.33±0.05) mg/mL,其中共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)約(0.79±0.06) mg/mL,而共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid，CLNA)約(0.54±0.04) mg/mL。

2.2 乳化劑和增稠劑的復配和篩選

2.2.1 單體乳化劑和增稠劑的篩選

發酵核桃乳是熱力學不穩定的乳狀液體系,易在貯藏過程中變得不穩定,添加乳化劑和增稠劑是解決其穩定性的有效方法。以乳化穩定系數和離心沉淀率為指標,研究了果膠、黃原膠、結冷膠、羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose,CMC)、蔗糖酯在不同添加量時,發酵核桃乳的穩定性。結果如圖1所示。

與果膠、結冷膠及CMC相比,添加黃原膠和蔗糖酯作為穩定劑時,發酵核桃乳的乳化穩定系數較低,而且離心沉淀率明顯偏高,說明黃原膠和蔗糖酯對發酵核桃乳的穩定作用一般。

在添加果膠時,乳化穩定系數隨著添加量的增加,呈現先上升后下降的趨勢。當添加量(質量分數,下同)為0.02%～0.06%時,乳化穩定系數不斷增加,超過0.06%穩定性開始下降。CMC添加量對于體系穩定性影響不大,添加量為0.6%時乳化穩定系數最高達到0.91,離心沉淀率相對較低。結冷膠添加量為0.02%時,離心沉淀率為9.05%,乳化穩定系數達到0.93。穩定性隨著添加量的增加而下降,添加量為0.1%時趨于平穩。

a-果膠；b-黃原膠；c-結冷膠；d-CMC；e-蔗糖酯圖1 不同添加量的添加劑對產品乳化穩定系數和離心沉淀率的影響Fig.1 Effects of additives concentration on emulsification stability coefficient and centrifugal precipitation rate of products

離心沉淀率越高,說明分散體系中易于團聚的顆粒越多,體系越不穩定。果膠添加量為0.06%時,離心沉淀率最小,而添加0.02%的結冷膠時,離心沉淀率最小,CMC添加量為0.45%和0.6%時離心沉淀率均較低。

綜合乳化穩定系數和離心沉淀率的實驗結果,單體乳化劑果膠、結冷膠和CMC分別在添加量為0.06%、0.02%和0.6%時,對于發酵核桃乳體系的穩定效果較好。

2.2.2 正交試驗確定最佳復配比

根據上述添加劑的單因素試驗結果,選擇對發酵核桃乳體系穩定效果較好的果膠、結冷膠和CMC,設計3因素3水平的正交試驗,試驗因素及水平見表1,正交試驗設計及結果見表2。

表1 試驗因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

正交試驗結果分析見表3。乳化穩定系數和離心沉淀率的極差值均為RC>RB>RA,表明3個因素主次順序為CMC添加量>結冷膠添加量>果膠添加量。由KA1>KA3>KA2,KB2>KB1>KB3,KC2>KC1>KC3可知,穩定性條件最佳組合是A1B2C2,即CMC、果膠、結冷膠添加量為0.6%、0.04%、0.02%。經驗證試驗,A2B2C2組合下R和離心沉淀率分別是以前的1.13倍和0.91倍,說明此優化條件下發酵核桃乳的穩定性較好。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 正交試驗結果分析Table 3 Analysis of the orthogonal test results

2.3 抗氧化劑的篩選

抗氧化劑能抑制自由基氧化反應,傳統的合成抗氧化劑如叔丁基對苯二酚、二丁基羥基甲苯和叔丁基對羥基茴香醚等本身可能具有潛在毒性,因此,為保證食用安全,選擇低毒無害的天然抗氧化劑。

以發酵核桃乳為原料,分別添加不同質量分數的維生素C、維生素E、茶多酚和D-異抗壞血酸鈉,通過比較揮發性風味物質及其脂肪酸組成,分析發酵核桃乳在貯藏過程中的風味品質變化。實驗采用固相微萃取法測定產品的揮發性風味,脂肪酸甲酯化后通過GC-MS定性檢測分析,結果見表4和表5。

表4 添加抗氧化劑的發酵核桃乳存儲半個月后的揮發性風味物質的含量Table 4 Content of volatile flavor substance in fermented walnut milk with the antioxidants after storage for half a month

表5 添加抗氧化劑的發酵核桃乳存儲1個月后的揮發性風味物質的含量Table 5 Content of volatile flavor substance in fermented walnut milk with the antioxidants after storage for one month

續表5

實驗發現,發酵核桃乳的主要揮發性物質有醛酮類、醇類、酯類、有機酸類、呋喃和烷烴類,其中醛酮類21種,有機酸類8種,烷烴類7種,醇類6種,酯類3種,呋喃類2種,其他類風味物質10種。由于核桃中的脂肪酸主要是亞油酸、油酸和亞麻酸,且有研究表明亞油酸氧化產生的揮發性產物主要包括己醛、庚醛、2-庚烯醛、2-戊基呋喃、己酸等,油酸氧化產生的主要物質有2-十一烯醛、辛酸、壬酸等,而亞麻酸氧化后的揮發性產物主要有2,4-庚二烯醛[20]。結合GC-MS結果,選取2-十一烯醛和辛酸等13種物質來評價不同抗氧化劑對發酵核桃乳風味物質的影響。

分析發酵核桃乳的關鍵揮發性成分,發現在儲存初期主要包括乙酸、1-己醇、乙醇、己醛和己酸等。添加維生素C、維生素E、茶多酚和D-異抗壞血酸鈉,發酵核桃乳儲存半個月后氧化產生的關鍵揮發性成分,主要包括2-十一烯醛、辛酸、壬酸、己醛、庚醛、2-戊基呋喃、2,4-癸二烯醛、己酸、1-辛烯-3-醇、和2,4-庚二烯醛等,對產品的風味影響較大。儲存1個月后,油酸、亞油酸和亞麻酸氧化產生的關鍵揮發性成分含量基本都有不同程度的提高,己醛含量增加最為顯著,辛酸、2-戊基呋喃、2-庚烯醛、己酸和2-壬烯醛含量增加也較明顯,而2,4-癸二烯醛和2,4-庚二烯醛則部分呈現下降趨勢。

與維生素C和D-異抗壞血酸鈉相比,添加維生素E和茶多酚可抑制2-十一烯醛和辛酸的產生,即抑制油酸的氧化。其中,維生素E添加量為0.016%(質量分數)時,己醛含量增幅最小約為9.8%,2-戊基呋喃含量增幅為1.1%左右,己酸和2-壬烯醛含量增幅也均為最小。因此,維生素E在添加量為0.016%時對發酵核桃乳的抗氧化效果最好。添加茶多酚時,不同添加量時己醛含量增幅均超過12%,己酸和戊醇在添加量為0.004%時增幅最小(分別為1.15%和0.01%),2-戊基呋喃在0.002%的添加量時增幅最小(為1.34%),2-庚烯醛和2-壬烯醛的含量在0.004%的添加量時增幅也較小(分別為0.14%和1.35%)。因此,茶多酚在添加量為0.004%時,對發酵核桃乳的抗氧化效果最好。分析發酵核桃乳中脂肪酸含量變化,發現亞油酸明顯增加,亞麻酸含量變化不明顯,甚至有下降趨勢,而維生素E和茶多酚作用后的油酸含量變化不明顯,與揮發性風味物質的實驗結果基本一致。綜合來看,最終選擇維生素E作為發酵核桃乳的抗氧化劑。

綜上,維生素E可以有效抑制發酵核桃乳飲料的脂肪氧化和風味劣變,其最佳抗氧化添加量為0.016%(質量分數),該方法處理的發酵核桃乳飲料的脂肪氧化問題有明顯改善。

2.4 發酵核桃乳的產品配方及喜好度評價

根據前文研究結果制備發酵核桃乳,并添加果膠(0.04%)、結冷膠(0.02%)和CMC(0.6%)作為穩定劑,以及維生素E(0.016%)作為抗氧化劑。在此基礎上,通過產品喜好度評價,確定核桃香精以及白砂糖添加量,以獲得發酵風味以及感官評價良好的發酵核桃乳產品。評定員分別從表觀喜好度、氣味喜好度、滋味喜好度和質地喜好度進行綜合評分(圖2)。

圖2 不同核桃香精及白砂糖添加量的發酵 核桃乳的喜好度評價Fig.2 Preference evaluation of fermented walnut milk with different walnut flavorant and sugar content

如圖2所示,在80 mL發酵核桃乳中添加不同比例核桃香精及白砂糖,編號為583的發酵核桃乳樣品,較其他組樣品而言,整體喜好度得分更高。在表觀喜好度和滋味喜好度方面,編號583即添加75 μL的核桃香精和10%(質量分數)白砂糖的產品評分最高,其次是添加100 μL的核桃香精和10%白砂糖的編號967、添加75 μL的核桃香精和8%白砂糖的編號713和添加100 μL的核桃香精和8%白砂糖的編號349；在氣味喜好度方面,編號為583的產品整體較高,其次是編號967,而349和713的評分基本相同；在質地喜好度方面,編號為583和713的產品評分更高,其次是編號967和349。結合4個感官屬性,添加75 μL的核桃香精和10%白砂糖的發酵核桃乳的總體喜好度最高,達到5.8分,此時的產品呈灰白色,質地均勻,酸甜可口,兼具核桃香味和發酵風味,其余3組產品的整體喜好評分也達到5左右,說明評定員對發酵產品的滿意度較好。

3 結論

發酵核桃乳的穩定性和脂肪氧化是本研究要解決的關鍵問題,主要從添加乳化穩定劑、增稠劑以及抗氧化劑方面著手,最終結果如下：

(1)添加食品乳化劑和增稠劑是改善發酵核桃乳穩定性的有效方法。添加0.04%的果膠、0.02%的結冷膠和0.6%的CMC,發酵核桃乳的穩定性最好,此時乳化穩定系數為0.44,離心沉淀率7.80%。

(2)食品級抗氧化劑可以有效抑制發酵核桃乳飲料的脂肪氧化和風味劣變。添加0.016%的維生素E時抗氧化效果最好。

(3)料水比1∶5(g∶mL)的發酵基料中加入60 U/mL的脂肪酶,37 ℃水解3 h后巴氏滅菌,將菌株的初始接種量控制在107CFU/mL左右,37 ℃發酵20 h后,加入0.04%的果膠、0.02%的結冷膠、0.6%的CMC以及0.016%的維生素E進行調配,添加75 μL的核桃香精和10%白砂糖后,將pH值調整至4.1～4.2,再經過滅菌后的發酵核桃乳色澤均勻一致,質地均勻,無分層沉淀現象,酸甜可口,兼具核桃香味和發酵風味,整體喜好度評價得分5.8。