副溶血性弧菌毒力因子及耐藥機制研究進展

張健,朱秋華,張明,王麗衛,董浩,曾仙童,白梧桐,郭曉華, 申照華,宋鋼,張德福*,勵建榮

1(渤海大學 食品科學與工程學院,渤海大學海洋研究院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工 及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧 錦州,121013) 2(中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室,北京,100190) 3(山東美佳集團有限公司,山東 日照,276806) 4(錦州市龍海馨港科技有限公司,遼寧 錦州,121211)5(凌海市達蓮海珍品養殖有限責任公司,遼寧 錦州,121211)

副溶血性弧菌是一種常見的革蘭氏陰性菌,俗稱“嗜鹽菌”,一般存在于近海或河海交界處的海水、海產品中[1]。在我國,副溶血性弧菌引起的食源性疾病的病例數占微生物性食源性疾病的首位[2]。副溶血性弧菌從環境中傳染給人類的主要途徑是食用了被該菌污染的生的或沒有完全熟透的魚類或貝類等海產品。受副溶血性弧菌感染最常見的病癥是急性腸胃炎,有腹痛、腹瀉、低燒、頭痛和嘔吐等癥狀,但對于患有肝病、免疫缺陷性疾病和糖尿病等慢性疾病的人群來說,感染副溶血性弧菌則可能導致敗血癥,重則危及生命[3]。TENA等[4]還認為副溶血性弧菌是引起患者壞死性筋膜炎的病原體。副溶血性弧菌感染一般多發生在夏季和初秋,該時間段海水溫度適合副溶血性弧菌的生長,適宜的生存條件使其在環境中可以迅速、大量繁殖。

隨著社會的發展和人們經濟條件的改善,消費者對膳食營養的追求越來越高,對水產品尤其是海產品的需求日益增加,因此人們開發出了集約化養殖的方式以滿足消費需求。養殖密度的提高往往導致養殖動物體質較弱,容易感染多種疾病。一些養殖企業為了降低養殖海產品的發病率可能會不規范使用甚至濫用抗菌藥物,造成耐藥性細菌的產生[5]。當人們食用了受到副溶血性弧菌耐藥株污染的食物時,這些菌內部的質粒、轉座子、整合子等移動元件會將耐藥基因水平轉移到人體腸道等器官或組織中的其他細菌細胞內,從而造成人體內正常菌群產生耐藥性,給人類健康造成極大的潛在風險。食源性耐藥菌的出現,給細菌感染性疾病的臨床治療帶來了極大的挑戰,國外已報道多起因感染食源性耐藥菌導致臨床治療失敗的事件。

1 副溶血性弧菌的毒力因子

副溶血性弧菌的致病性主要是由毒力因子造成,包括溶血素類、侵襲因子和尿素酶等。研究表明副溶血性弧菌主要的毒力因子分別是耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)和耐熱相關溶血素(tdh-related hemolysin,TRH),這2種毒力因子也被認為是該菌株致病性的分子標記,它們通過作用于宿主細胞表面,破壞細胞的完整性。而環境中的副溶血性弧菌大多數不產生致病的耐熱直接溶血素和耐熱直接相關溶血素,但有研究學者調查發現,副溶血性弧菌環境菌株的48%和8.3%分別具有tdh和trh基因[6],因此,副溶血性弧菌環境菌株是否具有tdh和trh基因還有待進一步研究。除TDH與TRH會對人類健康存在潛在威脅外,大多數副溶血性弧菌所包含的III型分泌系統(type Ⅲ secretion system,T3SS)和VI型分泌系統(type VI secretion system,T6SS)以及部分特定編碼基因對人類健康也存在極大威脅[7],比如副溶血性弧菌中的UreC編碼基因就通過基因編輯形成脲酶,脲酶的產生則可以使副溶血性弧菌產生自我保護機制,而脲酶的形成又通常與trh基因的存在有關[8]。

TDH是一種對熱穩定且具有可逆特性的淀粉樣蛋白毒素,它可根據溫度變化重新折疊其結構：TDH在60～70 ℃條件下可以將其天然結構改變為富含β鏈的無毒原纖維；在80～100 ℃條件下加熱后,可以進一步解離成沒有折疊的展開狀態,但是展開的TDH在快速冷卻后又可以折疊成原來的天然形式。天然TDH在水性環境中是對稱且帶有中心孔的四聚體,中心孔在溶血過程中充當通道,可在紅細胞膜的磷脂雙層中形成跨膜孔,使水和離子自由流動,導致細胞內部和外部離子不平衡,出現膜透化和紅細胞膨脹,使細胞產生溶解現象[9],這些由細胞表面形成孔洞產生溶血現象是產生細胞毒性和腸毒性的原因,這種溶血現象又稱為Kanagawa現象,即“神奈川現象”[10]。因此,對于TDH致病性而言,保持具有中心孔的四聚體結構是必不可少的[11]。TDH的產生又受到培養菌株生存的培養基成分的影響,主要是培養基中含NaCl、糖、氨基酸和磷酸鹽的濃度決定產生TDH的量。當2株副溶血性弧菌在含有共軛膽汁酸(如糖膽酸和牛磺膽酸)的培養基中共同生長時,菌株產TDH的能力顯著增強。

1985年,學者在馬爾代夫發現了副溶血性弧菌另一重要致病因子——TRH。TRH由2條相同氨基酸鏈組成。編碼基因trh,與tdh具有大約68%的同源性,生物學活性與TDH也較為相似,有類似水平的溶血活性、腸毒性、細胞毒性和心臟毒性,與TDH相比,TRH對溫度較為敏感,在60 ℃下即被破壞。由于trh基因在副溶血性弧菌菌株中的存在與脲酶的產生有關,并且脲酶具有催化尿素水解成氨的作用,能提高宿主體內環境pH,從而促使細菌產生自我保護的物質,免受胃酸侵害菌株,增大其產生腸毒性作用的概率[12]。

除了TDH和TRH毒力因子,副溶血性弧菌中的III型分泌系統T3SS1和T3SS2也是主要致病因素。這些T3SS分泌的效應蛋白可以傳遞到宿主細胞中而導致宿主細胞死亡或患者腹瀉。T3SS1既可以存在于致病性菌株中,也可以存在于非致病性菌株中,而T3SS2只存在于致病性菌株中。T3SS1主要影響生物膜的形成、細胞運動性和細胞毒性,提高副溶血性弧菌在不適生存環境中的存活率,在宿主體內的表達主要表現為產生腸毒性。T3SS2參與細胞炎癥反應的負調控,幫助菌株逃避宿主免疫系統對其進行的清除作用。

T3SS1特異性效應因子包括VepA、VepB(也被稱為VopS)、VPA0450和VopR(VP1683)[13]。VepA已被證明是誘導細胞自噬的必要條件,它的存在可以促使細胞產生毒性[14]；VopS通過作用于細胞內部通道并使其停止工作,從而使細胞變圓；VPA0450是一種肌醇磷酸酶,可水解質膜上磷脂酰肌醇磷酸,造成肌動蛋白細胞骨架與質膜之間的連接遭到破壞,從而使細胞質膜中形成氣泡,導致細胞變圓或裂解[15]。VopR由基因vp1683編碼而成,包含與磷酸肌醇結構域相似的結構域,可以與宿主細胞膜上的磷酸肌醇結合,從而破壞細胞活性。VopR還具有促進T3SS效應子在宿主細胞中表達的功能[16]。T3SS1效應系統是由環境中的副溶血性弧菌分離株產生的,盡管自然宿主未知,但該效應系統與副溶血性弧菌在環境中的存活有關；該效應系統既可以讓細菌避免宿主產生免疫反應,又可以誘導宿主細胞發生自溶效應,從而讓宿主細胞釋放出有價值的營養素供菌株利用,增大菌株在不適環境中的生存率[17]。在體外組織培養細胞感染過程中,觀察到T3SS1侵入并破壞細胞的過程,包括誘導細胞自噬,隨后的細胞圓化,最后導致細胞裂解,這些過程在宿主受到感染的3個小時內完成。有一點值得注意,盡管T3SS1引起了細胞質劇烈的變化,但被感染細胞的細胞核幾乎是完整的,表明該感染是通過破壞細胞內信號傳遞通路從而導致細胞死亡。

T3SS2效應系統是由臨床上的副溶血性弧菌分離株產生的,與其他細菌的T3SS不同的是,它的存在可以使副溶血性弧菌具有入侵細胞的能力,而且使副溶血性弧菌具有在宿主細胞中存活并復制的能力；它們經常與溶血素一起產生腸毒性作用,因此,T3SS2可以看做是致病性副溶血性弧菌的特異性分泌系統[18]。T3SS2的特異性效應因子包括VopZ、VopV、VopC、VopT、VopL、VopP、VopM[19]。VopZ會抑制激酶(TAK1)的激活,而TAK1的缺失會引起腸上皮細胞損傷、死亡和發生炎癥,因此VopZ是菌株進行腸道定植、誘導腹瀉和產生腸道病理的主要因素[20]。VopV是產生腸毒性的主要效應因子,它可以將肌動蛋白和絲素蛋白分別與其重復結構域結合,這種現象會產生腹瀉的癥狀,ZHOU等[21]認為VopV還跟腸道定植有關。VopC被認為是參與T3SS2入侵宿主細胞的效應因子,VopC通過脫酰胺作用導致肌動蛋白細胞骨架發生變化,從而提高副溶血性弧菌入侵宿主細胞的能力[22]。但是,也有報道證明,在幼兔副溶血性弧菌感染模型中,VopC的失活并未減少菌株的定植或腸道感染的總體指標[23]。因此,VopC在副溶血性弧菌感染過程中的作用還有待進一步研究。VopT是一種ADP核糖基轉移酶,也是T3SS2產生細胞毒性的效應因子之一[24]。VopL可以中和宿主細胞中煙酰胺二核苷酸磷酸氧化酶復合物產生活性氧,以增加菌株在宿主細胞中的存活概率[25]。

T6SS是一個多功能的蛋白注射系統,結構為倒置的T4噬菌體形狀,主要由4部分組成：跨膜的管狀結構、基板結構、胞外管狀結構及頂端的針狀結構,該系統主要功能是將菌株粘附到宿主體內。T6SS也包含2部分：T6SSl和T6SS2,分別位于大染色體和小染色體上。T6SSl主要存在于臨床的致病菌株中,與菌株致病能力相關；T6SS2存在于所有的副溶血性弧菌中,但具體功能還有待進一步研究。T6SS最初被認為是一種毒力機制,但近一步研究發現,該系統可以將毒素直接輸送到相鄰細菌體內,在細菌競爭中發揮保護自身作用,并且大多數已經被鑒定的T6SS效應器都能介導抗菌活性,保護細菌免受自身或同屬的破壞[26-29]。因此,T6SS主要作用機制是對宿主產生毒性還是起到保護作用仍需進一步研究。

2 副溶血性弧菌耐藥機制研究進展

副溶血性弧菌是水產養殖過程中常見的致病菌,被副溶血性弧菌污染的海產品會大量減產,造成經濟損失,給人類的健康也帶來了潛在風險。近年來,在水產養殖過程中發現副溶血性弧菌對抗菌藥物具有耐受性的現象非常普遍,這種現象引起了研究人員的極大關注[30]。報道顯示,副溶血性弧菌對氨芐西林、環丙沙星、頭孢唑林、鏈霉素、頭孢噻肟等多種抗菌藥物均顯示出較高的抗藥性,而產生這種情況的原因多為不規范使用抗菌藥物治療水產養殖過程中的細菌疾病[31]。因此,規范水產養殖中抗菌藥物的使用勢在必行。與此同時,監測海產品中副溶血性弧菌產生耐藥性的模式同樣重要,這是預防和治療耐藥菌的關鍵。目前已知的副溶血性弧菌耐藥模式主要有：質粒介導耐藥、產生滅活酶或鈍化酶類、外排泵主動排出抗菌藥物、藥物靶點發生改變等。近年來,細菌生物被膜的出現,也引起了研究者的極大關注。

2.1 產生生物被膜

細菌生物被膜是指細菌通過分泌產生基質和蛋白等物質,將其自身包繞這些物質中,形成大量的膜樣物,這些由大量細菌聚集而形成的生物被膜可以大大提高細菌附著在生物或非生物表面上的能力[32-33]。副溶血性弧菌則能直接產生黏附因子,使其粘附到宿主表面,從而形成生物被膜。研究表明,具有生物被膜的副溶血性弧菌比自由游動狀態下的相同菌株對消毒劑和抗菌藥物的抵抗力更強,對不適環境的適應能力也更強,存在于生物被膜中的細菌對環境壓力的抵抗能力甚至是浮游細菌的1 000倍。副溶血性弧菌具有很強的生物被膜形成能力,不僅可以提高其在環境中的存活率,還可以大大增加副溶血性弧菌的傳染性和傳播能力[34]。

生物被膜的形成是一個復雜的過程,涉及許多特定的結構和調控過程；最重要的結構和調控過程包括極鞭毛和側鞭毛、對甘露糖敏感血凝素(mannose-sensitive hemagglutinin,MSHA)菌毛、幾丁質調節菌毛、莢膜多糖(capsule polysaccharides,CPS)、胞外多糖(exopoly saccharides,EPS)、環二鳥苷酸(c-di-GMP)和群體感應[35]；還有一些轉錄調節因子,例如OxyR,也參與了副溶血性弧菌生物被膜的調節[36]。有學者認為,在自然環境中,副溶血性弧菌首先通過MSHA菌毛附著在表面上,如果表面物質包含甲殼質,那么副溶血性弧菌會用幾丁質酶將其水解為乙酰葡萄糖胺,然后產生的乙酰葡萄糖胺可以增強RNA純化分離染色質(chromatin isolation by RNA purification,ChiRP)的表達,由于ChiRP的表達可以在細菌與細菌的相互作用中起到一定促進作用,因此,副溶血性弧菌會在含甲殼質的表面上有效地形成生物被膜,穩定地獲得營養；相反,如果副溶血性弧菌附著于不含甲殼質的底物表面,則ChiRP的表達不會上調,因此,細菌在非甲殼質基質上不易或不能附著,從而菌株比較分散,但這也方便了副溶血性弧菌移動到下一個宿主以便獲得足夠的營養。由此可見,GlcNAc在副溶血性弧菌的生態學中起著重要作用。GlcNAc是幾丁質單體,并且是腸道上皮中糖蛋白和脂質的常見修飾物,因此,無論在腸道環境還是海洋環境中,只要有GlcNAc的存在,ChiRP都會發生作用[37]。但副溶血性弧菌生物被膜形成調控的全部細節還尚不清楚,有待進一步研究。

2.2 質粒介導耐藥

質粒是一種可在細胞內單獨存在的細胞器,它的大小和功能各不相同：一些質粒只攜帶1～2個基因,但有些質粒則可攜帶多達400個基因,而質粒本身又是獨立于染色體DNA存在的,具有自主繁衍功能,所以會出現在一個細胞體內多個質粒共存的現象[38]。這些質粒不參與細胞基本功能如細胞生長和繁殖的調控,但是如果細胞處于不利于生存的環境時,這些質粒就會發生作用。它們往往攜帶一些抗性基因,比如細胞存在于抗菌藥物條件時,質粒所攜帶的抗性基因就會發揮作用,編碼出對不同抗菌物質(如抗生素、重金屬、消毒劑甚至于紫外線照射)產生耐受性的酶。此外,不同于其他移動元件的是,質粒還具有水平轉移的功能,它可以介導耐藥基因在不同的細菌個體間、不同種屬的細菌間轉移,如果在轉移期間該質粒攜帶了耐藥基因,那么該耐藥基因可以通過質粒攜帶的插入序列、轉座子和整合子等移動元件對多藥耐藥區等類似的模塊區域進行水平轉移,從而使受體細菌也可以表現為對抗菌藥物具有耐受性,這種水平傳播方式使菌株耐藥的情況變得更加嚴重[39]。

2.3 產生滅活酶或鈍化酶類

副溶血性弧菌能夠通過自身產生的滅活酶或鈍化酶來降解抗菌藥物里的修飾酶,使抗菌藥物作用于細菌之前即被破壞而失去抗菌作用,從而減小抗菌藥物對菌株的破壞能力,這些酶作用的耐藥機制一般由染色體或質粒介導。研究表明,菌株體內的滅活酶或鈍化酶能夠自主產生紅霉素酯化酶、β-內酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶和氯霉素乙酰基轉移酶,從而破壞紅霉素類、β-內酰胺類、氨基糖苷類和氯霉素類抗菌藥物[40]。除此之外,弧菌屬細菌均存在VbrK/VbrR基因,該基因可以調控bla編碼的β-內酰胺酶(β-lactamases,bla)產生,一旦菌株產生該酶,就會對β-內酰胺類抗菌藥物產生耐受性[41]；不僅如此,β-內酰胺酶中的blaPER-1基因、blaCMY-2基因和blaTEM基因已被證實與菌株對三代頭孢和四代頭孢的抗性有關；blaV110基因與副溶血性弧菌對氨芐西林、哌拉西林和青霉素產生耐藥性有關[42]。

2.4 外排泵主動排出抗菌藥物

縱然細菌耐藥機制有多種方式,但是由外排泵主動排出抗菌藥物這種耐藥機制仍然是目前細菌產生多藥耐藥的主要原因,大量多藥耐藥細菌中幾乎都發現了外排泵也印證了該觀點。細菌中已發現多種多藥外排轉運蛋白,這些蛋白質根據其主要結構和運輸能力可分為4類：超家族轉運蛋白(major facilitator superfamily,MFS)、多藥抗性小蛋白(small multidrug resistance protein,SMR)、耐藥結節分化細胞分化(resistance-nodulation-division,RND)家族轉運蛋白、ATP結合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporters,ABC)[43]。除了以上4種外排系統,OTSUKA等[44]在副溶血性弧菌中還發現一個新的外排膜泵家族——多藥和有毒化合物排出家族(multidrug and toxic microbial extrusion,MATE),這個家族中具有3個保守區域,分別為Asp32、Glu261和Asp367,這些氨基酸殘基可以在菌株外排抗菌藥物的過程中產生一定的促進作用。一旦細菌獲得多種外排泵,或者由于某種原因激活了體內的多種外排泵,那么該細菌就會立刻對多種藥物產生抗性。

副溶血性弧菌外排泵的主要能量來自于Na+跨膜電位的電位差。副溶血性弧菌中編碼多藥外排轉運蛋白的基因是vmeA和vmeB,屬于RND家族。這對基因不僅可以將菌體外部的抗菌藥物泵出菌株體外,還可以躲避宿主自身免疫系統對菌株的殺害,進一步研究發現,在破壞了vmeA和vmeB基因的菌株中仍然會有外排泵將抗菌藥物泵出菌株體外,造成這種現象的原因目前還正在進一步研究中。

2.5 藥物靶點發生改變

副溶血性弧菌可以產生某種具有修飾作用的酶或改變藥物作用的靶點,使抗菌藥物不能正常與細胞接合或使抗菌藥物與細胞的親和力下降,從而減少抗菌藥物對菌株產生的危害。細菌產生這種耐藥機制主要有3種方式：改變細菌靶蛋白、產生新的靶位和增加靶蛋白的數量。目前,對幾種常用抗菌藥物的研究表明,氨基糖苷類和四環素類的作用靶位是位于核糖體上的50S亞基,β-內酰胺類的作用靶分子為青霉素結合蛋白(penicillin binding proteins,PBP)等,這些藥物對靶點的作用具有很高的特異性,一旦這些抗菌藥物作用的靶位結構發生細微的變化,抗菌藥物就很難對菌株產生破壞作用,細菌就會表現為很強的耐藥性；副溶血性弧菌還可以通過gyrA突變和parC突變使菌株對抗菌藥物產生抵抗能力,使副溶血性弧菌對喹諾酮類藥物產生抗性[45-46]；SAGA 等[47]在副溶血性弧菌中發現了與qnrA基因互為同源染色體的vpa0095基因,也證實副溶血性弧菌可以對喹諾酮類藥物產生抗性。此外,副溶血性弧菌編碼外膜蛋白的vpa0116基因也和菌株耐藥有關,具有vpa0116基因的副溶血性弧菌在Na+濃度增加時會對慶大霉素的耐藥性有所提高[48]。目前,對副溶血性弧菌藥物靶點發生改變的研究相對較少,具體的作用機理還需要進一步研究考證[49]。

3 結語

本文主要綜述了副溶血性弧菌使人和海產品致病的主要原因以及副溶血性弧菌產生耐藥的幾種方式,為副溶血性弧菌的進一步研究奠定了基礎。但是,關于副溶血性弧菌對人體和水產品致病的機理以及副溶血性弧菌產生耐藥的方式仍然存在許多盲區,如生物被膜形成調控的具體細節,外排泵工作有哪些影響因素,藥物靶點發生改變的方式有哪些等,這也將是副溶血性弧菌下一步研究的熱點。