基于UPLC-Q-TOF-MS技術分析不同品牌啤酒中非揮發性化學成分的差異

王越，張俊鵬，張雪，張昊，李慧帆，付冬梅

（大連工業大學生物工程學院，遼寧 大連 116034）

啤酒是一種以麥芽、大米、酒花、釀酒酵母和水為原料，富含糖類、維生素、氨基酸、鉀、鈣、鎂等多種營養成分的世界型飲料[1]。隨著人們生活水平的不斷提高和啤酒行業的快速發展，我國已成為世界上啤酒市場增長最快的地區之一[2]。為滿足消費者多元化的要求，各種啤酒層出不窮，不同品牌、不同發酵工藝以及不同原材料釀造生產的成品啤酒形成了自己獨特的風味和口感，同時隨著近年來小型精釀啤酒的崛起，如何能快速鑒別啤酒的品牌成為了目前啤酒研究的熱點之一。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間-質譜聯用技術（ultra-high performance liquid chromatography quadrupoletime-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）由于其高選擇性、高靈敏度而被廣泛應用于天然產物、藥效物質以及食品等復雜基質的代謝組學研究[3-6]。高分辨飛行時間質譜具有質量范圍廣、分辨率和質量精度高、分析速度快等特點。與低分辨質譜不同，QTOF-MS可通過全掃描獲得化合物的精確質量數和可能的化學分子式，大大提高了復雜背景下的抗干擾能力，使檢測結果更加準確可靠[7-8]。崔園園等[9]采用UPLC-Q-TOF-MS技術分析生、炙甘草的化學成分差異，為闡明甘草炮制前后化學成分的變化規律以及甘草生熟異用的物質基礎提供參考。鐘成等[10]運用代謝組學方法分析工業啤酒發酵過程中酵母胞內代謝物和啤酒風味物質的對應關系，從代謝水平上研究風味物質形成過程中的關鍵影響因素，同時結合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法（partial least-square method，PLS）等數據處理方法，尋找關鍵的代謝物質。有研究人員[11-13]利用靶向代謝組學研究了不同品牌、不同品種啤酒花在生產過程中衍生的苦味化合物（例如α-酸、β-酸、異戊烯酮和異戊烯醇酮）和多酚化合物；André等[14]將非靶向代謝組學應用于鑒定酒精啤酒與非酒精啤酒的成分差異。

目前主要通過氣相色譜、氣質聯用技術檢測啤酒中揮發性物質研究啤酒的風味、口感等[15-17]。而除了揮發性風味物質之外，啤酒中的非揮發性物質對啤酒的口感、質量以及穩定性的影響也很大，但目前對于啤酒中的非揮發性物質，主要集中在利用高效液相色譜法對其中的有機酸、生物胺、多酚以及糖等某一類成分進行含量分析[18-23]，而對不同品牌、不同種類啤酒中非揮發性化學成分差異的研究很少。本研究基于UPLC-Q-TOF-MS技術，利用非靶向代謝組學分析策略，結合MassHunter Profinder和MPP軟件將獲得的質譜數據進行化合物分子特征提取和統計學分析，尋找不同品牌啤酒中的差異化合物，為快速鑒別不同品牌、不同類型的啤酒奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1290型液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）、6545型Q-TOF質譜儀 [配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）]：美國安捷倫公司；H1750R 臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀集團；TP-213電子天平：丹佛儀器有限公司；BCD-200冷凍冰箱：博西華家用電器有限公司。

啤酒樣品：市售；甲酸（色譜級）：上海Sigma-Aldrich公司；乙腈（色譜級）：德國默克公司；Milli-Q超純水儀：力新儀器（上海）有限公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1×50 mm，1.8 μm）：美國安捷倫公司；固相萃取柱 UniElut C18 HC（1 g/6 mL）：華譜科儀（北京）科技有限公司。

1.2 試驗流程

試驗流程見圖1。

圖1 試驗流程Fig.1 Experimental flowchart

1.3 樣品預處理

將4個品牌的19種啤酒樣品（每種樣品取3個平行，共57個樣品）超聲脫氣5 min，然后在10 000 r/min、4℃下離心 5 min。用 3 mL甲醇∶水（體積比 1∶1）活化UniElut C18 HC固相萃取柱，用5 mL水平衡，將1 mL樣品通過平衡好的萃取柱，用5 mL乙腈洗脫，收集上樣液和洗脫液，用水定容至10 mL，過0.22 μm有機濾膜，于4℃冰箱保存待分析。4個不同品牌的啤酒樣品信息見表1。

表1 4個不同品牌的啤酒樣品信息Table 1 Sample information of 4 different brands beer

續表1 4個不同品牌的啤酒樣品信息Continue table 1 Sample information of 4 different brands beer

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：1 μL；流動相 A：水（含 0.1%甲酸）；流動相 B：乙腈（含0.1%甲酸）；梯度洗脫：初始流動相為98%A，0～5 min，98%A；5 min～15 min，98%～0%A；15 min～18 min，98%A。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；電離模式：正離子模式（ESI+）；氣體溫度：320 ℃；干燥器流速：8 L/min；噴霧氣壓：35 psi（145 psi=1×106Pa）；保護氣溫度：350℃；保護氣流速：11 L/min；離子源毛細管電壓：4 000 V；噴嘴壓力：1 000 V；MS-TOF毛細管電壓：175 V；一級質譜質量掃描范圍（m/z）：100～3000；參比離子（m/z）：149.02332。

2 結果與討論

2.1 啤酒樣品的純化

啤酒的化學成分極為豐富，包含多種蛋白質等大分子物質，若直接分析常會造成色譜柱堵塞、檢測器污染等一系列問題。固相萃取（solid-phase extraction，SPE）是利用選擇性吸附與選擇性洗脫的分離原理來降低樣品基質干擾，提高檢測靈敏度[24-25]，因此試驗選擇固相萃取法對啤酒樣品進行預處理，以達到純化樣品的目的。

2.2 單因素方差分析及倍數檢驗

利用MassHunter Profinder軟件對4個不同品牌啤酒樣本的質譜原始數據進行峰匹配、保留時間對齊、濾噪處理和分子特征提取（molecular feature extraction，MFE），根據設置的遞歸條件查找離子進而提取質譜信息，得到包含2 477個化合物的總信息列表。將化合物出現頻率閾值設置為70%，通過單因素方差分析得到P＜0.05（具有顯著性差異）的化合物有1 455個，將倍數檢驗閾值設置為2.0，得到倍數變化≥2.0（組間差異倍數）的化合物有1 056個，表示這些化合物在組間具有顯著性差異變化，可用于進一步的統計學分析以及差異化合物的篩選。圖2為4個不同品牌啤酒中所有非揮發性化合物在不同保留時間的分布頻率圖。

圖2 不同品牌啤酒中非揮發性化合物的總體分布頻率Fig.2 Overall frequency distribution of non-volatile compounds in different brands of beer

由于反相色譜一般用于分離中等極性或極性較弱的化合物，隨著化合物極性的減小，與C18色譜填料疏水相互作用力的增強，保留時間會有所增大，而極性大的化合物保留弱，保留時間短。從圖2頻率圖中可以看出，初始2 min內化合物的分布頻率比較高，說明啤酒樣品中極性化合物比較多，且最高質荷比達到3 000以上，而啤酒中的中等極性及弱極性化合物的分布范圍比較寬，質荷比均在1 500以下。通過頻率分布圖，能夠清晰觀測到啤酒中非揮發性化合物的極性大小及質荷比的分布情況。

2.3 尋找差異特征化合物

由于品牌不同，啤酒中的非揮發性化學成分有所差異，利用 Mass Profiler Professional B14.9.1（MPP）軟件對具有顯著性組間差異變化（P＜0.05，倍數變化≥2.0）的1 056個化合物進行化學計量分析，尋找差異特征化合物，結果見圖3。

圖3 不同品牌啤酒差異特征化合物的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of differential characteristic compounds in different brands of beer

由圖3可知，從4個品牌啤酒中共篩選出11個差異化合物，通過搜索PCDL Metlin-Metabolites數據庫對化合物的質荷比信息進一步識別鑒定，最終得到化合物信息如表2所示。

表2 不同品牌啤酒的差異化合物信息Table 2 The information of differential compounds for different brands of beer

由表2可知，品牌1有4個化合物：加巴噴丁（Gabapentin）、1-丙酸苯乙酯（1-phenyiethyl propanoate）、（S）-3-羥基丁酸丁酯糖苷（butyl（S）-3-hydroxybutyrate glucoside）和一個未知化合物（質荷比2 846.868 2）；品牌3有3個化合物：（Z）-5-[（5-甲基-2-噻吩）亞甲基]-2（5H）-呋喃酮（Z-5-[（5-methyl-2-thienyl）methylene]-2（5H）-furanone）、琥珀酸腺苷（succinoadenosine）和 2-（3-苯基丙基）-吡啶（2-（3-phenylpropyl）-pyridine）；品牌4有4個化合物：精氨酰天冬氨酸（arginyl-aspartate）、水云烯（ectocarpen）及還有兩個未知化合物質荷比215.951 9和230.074 1）。在搜索數據庫鑒定化合物的過程中，發現同一質荷比或同一個分子式可能存在不同的化合物結構，通過得分值從高到低的排列順序篩選出得分值最高的化合物作為推測的差異特征化合物。

2.4 主成分分析（PCA）

利用PCA對UPLC-Q-TOF-MS分析得到的復雜數據進行降維，將57個對齊過濾后的樣本數據導入MPP軟件進行分析，得到PCA二維得分圖如圖4所示。

圖4 4個不同品牌啤酒的主成分分析Fig.4 PCA plot of 4 different brands in beer samples

從圖4中可以清晰地觀察到所有啤酒樣品按照品牌各自聚類且聚類效果顯著，說明這4個品牌啤酒的非揮發性化學成分存在顯著性差異。由于試驗選取品牌1中1號樣本JZ作為QC進行校準，因此QC與品牌1啤酒的化合物明顯聚類。品牌1、品牌2和品牌4的組內聚合度較好，說明這3個品牌的啤酒組內非揮發性化學成分相似度較高；品牌3中14號樣品BP-2與組內的其他兩種啤酒樣品HP-1和HP-2的距離較遠，說明同一品牌中不同種類的啤酒化學成分存在一定差異。另外4個品牌啤酒處于同一置信區間，這也說明盡管品牌不同，所有啤酒中的非揮發性化學成分依然存在著較高的相似性。

2.5 聚類分析

根據不同品牌啤酒中非揮發性化學成分之間相關系數的大小差異，將對齊過濾后的57個啤酒數據進行聚類分析，結果如圖5所示。

圖5 不同品牌啤酒化合物的聚類分析樹狀圖Fig.5 Cluster analysis of different brands of beer compounds

從樹狀譜系圖中可以明顯觀察到這4個品牌啤酒的非揮發性化合物之間聚類效果顯著，且聚類分析結果與主成分分析結果基本一致，進一步驗證了這4個不同品牌啤酒的非揮發性化學成分存在顯著性的差異。在譜系圖中歐氏距離越遠，對化學成分的差異分析貢獻程度越大，在所有化合物中組間差異性也就越大。品牌3和品牌4啤酒的化合物在4個品牌啤酒樣本中最先聚為一類，說明這兩個品牌啤酒的非揮發性化學成分相對其他兩個品牌相似度最高，其次這兩個品牌與品牌2的化合物相似度較高，最終4個品牌啤酒的化合物聚為一大類。另外不同品牌啤酒之間距離越近，化合物的相似度相對較高，反之，則不同品牌啤酒中的化學成分差異性越大，品牌2的10號樣本BP-1和品牌3的14號樣本BP-2距離非常近，這是因為兩者都是白啤，說明不同品牌中同一類型啤酒的化學成分存在較高的相似性。

3 結論

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS技術，對4個不同品牌啤酒的非揮發性化學成分進行快速分析，利用代謝組學策略分析不同品牌啤酒非揮發性化學成分的差異。由MassHunter Profinder軟件篩選出1 056個具有顯著性差異變化的化合物，由韋恩圖結合數據庫搜索進一步識別鑒定，推測出了11個差異特征化合物。通過Mass Profiler Professional B14.9.1軟件對57個啤酒樣本的質譜數據進行了主成分分析和聚類分析，結果進一步驗證了4個不同品牌啤酒的非揮發性化學成分的差異性。該研究改善了當前對不同品牌成品啤酒中非揮發性物質的差異分析不足的現狀，為不同品牌、不同種類啤酒及精釀啤酒的差異分析奠定了基礎，同時也為啤酒的質量監控以及市場的規范提供了科學依據。