Hg2+腎細胞毒性量效關系及其腎臟蓄積機理與針灸減毒的探究

胡英華，賈炳超，于立清，尚 鑫，孫 波

（長春中醫藥大學，長春 130117）

朱砂具有鎮靜、安神功效，但因其同時具有毒性又嚴重地困擾著醫藥界，所以針對朱砂毒性的研究經久不衰[1-4]。由于大多研究結果都將朱砂的毒性聚焦于朱砂中的主要成分重金屬汞，故汞在機體臟器的蓄積與存在形式[5-7]、汞的代謝動力學[8-10]與代謝組學[11-16]等研究都成了熱門話題。然而，對朱砂藥性與毒性作用的量效關系研究較少。朱砂的主要成份是HgS，但HgS 溶解度很小，僅為2.943×10-25g，并且HgS 本身不能被吸收，這就意味著可以通過微孔途徑被吸收的Hg2+量很小。如此少量的Hg2+是如何經有限的服藥期便產生蓄積的呢？蓄積量達到多少才能對細胞的增殖產生影響呢？這無疑是涉及朱砂或含有朱砂成份的中成藥能否安全用于臨床的關鍵問題。為了解決上述問題，同時也考慮到朱砂的毒性主要源于其對腎臟的損害，筆者以HEK293 為模型研究了朱砂體外腎毒性的量效關系，并以家兔血液中的Hg2+C-t 關系與其小腸和腎臟的離體實驗揭示了存在于吸收過程的Hg2+的蓄積機理，探究針灸的減毒作用。有研究表明，針刺天樞、足三里、上巨虛、大腸俞等可以改善結腸動力，使排便困難程度得以改善。針刺還可以通調三焦腑氣，恢復大腸傳導功能，增強腸道平滑肌蠕動，從而達到治愈便秘的目的[17]。現代生物學研究也證明，針刺可通過調節患者腦腸肽、c-kit 蛋白及mRNA 表達來改善便秘癥狀[18-19]。考慮到治愈便秘實際上就是增強腸道對其內容物的推進作用，而這種作用剛好可以減弱朱砂微粒在腸道內壁的吸附力，從而促進朱砂微粒的排泄，縮短Hg2+吸收相，進而減少由此引起的Hg2+在腎臟的蓄積。鑒于天樞、上巨虛、足三里、大腸俞這四個穴位均可以增加胃腸道動力，故以這四個穴位的組合來研究針灸對朱砂的解毒作用。

1 Hg2+腎細胞毒性量效關系模型

1.1 實驗材料 SANYO 二氧化碳培養箱（日本SANYO 公司），SANYO 超低溫冰柜（日本 SANYO公司），Themo 生物安全柜，BIO-RAD 酶標儀（美國伯樂公司），Mettler Toledo AL 204 電子分析天平（萬分之一），TD 40 臺式低速離心機（4 000 r/min）（湖南凱達科學儀器有限公司），YXQ-LS-50 立式壓力蒸汽滅菌器，可調微量移液器（上海亞榮生化儀器廠），水飛朱砂（河北凱達藥業有限公司），硫化汞（北京化工廠），氯化汞（姜堰市環球試劑廠），胎牛血清（浙江天杭生物有限公司），DMEM 干粉培養基（GIBCO），胰蛋白酶（北京鼎國昌盛有限責任公司）。

1.2 實驗方法 由于汞是朱砂的主要成分，也是其腎毒性的主要來源，所以該實驗用HgCl2來研究朱砂腎毒性與時間和劑量的相關性。根據前期實驗結果，取同批次對數生長期HEK 293，用0.01 mol/L 的PBS 潤洗3 次，再用0.25%胰酶消化2 min，然后加入100 μLfalse 血清終止消化，與4 mL DMEM 混勻，以1 000 r/min 離心5 min。棄去上清液，與10%高糖DMEM 混勻于培養皿中，計數，轉入96 孔板（1.5 萬/孔），放入CO2培養箱中，5% CO2，37℃孵育24 h。取出，吸凈培養液，加入1%FBS 高糖培養基，放入二氧化碳培養箱中孵育24 h。取出，顯微鏡下觀察生長情況（細胞應長滿96-孔板的80%～90%），分別加入事先配置好的HgCl2溶液，在5%CO2，37 ℃孵育36 h，取出，于倒置顯微鏡下觀察，并于每孔加入20 μL falseMTT 溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），繼續培養4 h。終止培養，小心吸取孔內培養液，并于每孔加入160 μLfalse 二甲基亞砜，置渦旋振蕩器上，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 490 nm 處測量各孔的吸光值，10 min 內測完。

1.3 實驗結果 可以擬合出吸光度y 與Hg2+的濃度x 之間關系的動力學模型：Lny=ln1.0173 -0.136x。當Hg2+濃度在0～20 μg/mL 范圍內時，該動力學模型吻合度很好。

2 朱砂在家兔腎臟蓄積機理及針灸減毒的研究

2.1 實驗材料 AFS-930 原子熒光分光光度計（北京吉天儀器有限公司），SANYO 超低溫冰柜（日本SANYO公司），Mettler Toledo AL 204電子分析天平（萬分之一），TD 40 臺式低速離心機（4 000 r/min）（湖南凱達科學儀器有限公司），Sigma 臺式高速冷凍離心機（德國Sigma 公司），可調微量移液槍（上海亞榮生化儀器廠），康牌針灸針（0.25 mm×25 mm）（長春愛康醫療器械有限公司），水飛朱砂（批號：20141213）安國市藥材天然粉貿易有限公司。

2.2 實驗方法 將市售的朱砂加工成不同分散度的供試樣品，并且按照分散度分成不同的實驗組。將樣品置于4℃恒溫環境下，在40 KHz 超聲震蕩下溶出，于不同時間點取樣，分析。結果見表1。

表1 分散度與汞離子溶出度的相關性

根據表1 的結果，并考慮汞在體內的表觀分布容積的問題，選擇過6 號篩、溶出60 min、Hg2+含量最高的溶液（8.561 μg/mL）作為朱砂飽和溶液實驗組給藥供試品，取沉淀物0.5 mL 稀釋至2 mL 作為朱砂混懸液實驗組給藥供試品。

2.2.1 血液中Hg2+濃度動態變化 將32 只家兔隨機分為4 組，第1 組為陰性對照組，第2 組為朱砂飽和溶液實驗組，第3 組為朱砂混懸液實驗組，第4 組為朱砂混懸液+針灸實驗組。第1 組的家兔灌胃給2 mL水，第2、3 組的家兔分別灌胃給2 mL 朱砂飽和溶液、2 mL 朱砂混懸液水，第4 組的家兔灌胃給2 mL 朱砂飽和溶液并每天針灸天樞、上巨虛、足三里、大腸俞四穴。

以上各組每日灌胃給藥1 次，并于每日給藥1 h后取全血進行分析，第4 組每日于采血后針灸1 次。結果見表2。

表2 家兔血液中Hg2+濃度（，n =8） μg/mL

注：與陰性對照組比較，# P ＜0.05

2.2.2 小腸洗脫液中Hg2+濃度動態變化 于給藥后的第15 天全部處死實驗動物，取出小腸和腎臟。并截取小腸1 m，洗凈，用模擬腸液以每分鐘1 滴的流速沖洗，于每日中午取樣分析，結果見表3。

表3 小腸洗脫液中Hg2+濃度（，n =8） ng/mL

表3 小腸洗脫液中Hg2+濃度（，n =8） ng/mL

注：與陰性對照組比較，# P ＜0.05；與朱砂飽和溶液實驗組比較，△P ＜0.05

2.2.3 腎臟中Hg2+濃度 用組織勻漿機將腎臟制成勻漿，并轉移到1.5 mL EP 管中，用Sigma 臺式高速冷凍離心機在-4℃下、14 000 r/min 的條件下離心15 min，取上清液1 mL 于原子熒光分析，結果見表4。

表4 腎臟中Hg2+濃度（，n =8） ng/mL

表4 腎臟中Hg2+濃度（，n =8） ng/mL

3 討論

根據Hg2+腎細胞毒性量效關系模型可以得出這樣的推論。當Hg2+濃度不高于20 μg/mL 時，HEK293 的存活量隨著Hg2+濃度的增加而呈對數衰減。當Hg2+濃度為5.2 μg/mL 時，HEK293 的存活率為對照組的50%。

總結2.2.1、2.2.2 和2.2.3 項下第2 實驗組與第3實驗組的研究結果可知。朱砂具有很強的吸附性，過量的朱砂微小顆粒以其強吸附性附著在小腸內壁，這就使得Hg2+可以緩慢地溶解于腸液，并持續地被吸收，其結果相當于給藥劑量不斷地增加，給藥時間相應地延長，進而導致朱砂因過度吸收而在腎臟蓄積，從而導致腎毒性的增加。如果中成藥能夠按照朱砂的溶解度投料，那么就可以參照朱砂腎毒性的量效關系控制含有朱砂制劑的給藥量及安全用藥周期，從而實現臨床上的精準用藥。

分析2.2.1、2.2.2 和2.2.3 項下第3 實驗組與第4實驗組的研究結果可以做出這樣的預測。對于口服含有朱砂藥物者，針灸刺激天樞、上巨虛、足三里、大腸俞這四個穴位可以減少朱砂微粒附著在小腸內壁的時間，縮短朱砂的吸收相，從而起到減毒作用，這一結果可以從經絡理論找到依據。天樞是手陽明大腸經的募穴，也是人體氣機升降的關鍵部位，可使臟腑之氣通調。上巨虛是手陽明大腸經的下合穴，根據《靈樞·四時氣》：“邪在腑，治其合。”的理論，針刺上巨虛來通調腑氣，其二者又為“合募配穴法”的應用，可起到相互協調的作用，從而增強療效。天樞，位于人體上部，上巨虛，位于人體下部，亦屬于配穴方法中的“上下配穴法”，上下部的腧穴聯合使用，可以通調人體內的氣機，從而消除腑病。足三里是足陽明胃經中的重要穴位，《四總穴歌》里有“肚腹三里求”的論述，其高度概括了足三里穴的主治功效，表明通過刺激足三里穴可明顯改善胃腸道疾病和不適癥狀，而足陽明胃經又被稱之為“多氣多血之經”，因此刺激足三里可明顯改善人體內氣血運行。天樞、上巨虛、足三里組合使用更是可以加強腸道的氣血經氣的運行，加快大腸傳導功能恢復。大腸俞作為背俞穴，有瀉熱通便、理氣化滯、通調腸腑的功效，與天樞聯合使用屬于“俞募配穴法”，由于背俞穴和募穴都是臟腑之氣輸注和會聚的部位，在分布上大體與對應的臟腑所在部位的上下排列相接近，因此，主要用于治療相關臟腑的病證發揮其協同作用，從而增加療效。