碳氮氧穩定同位素技術在水生態環境中的應用

楊 蓉，李 壘

1. 北京市南水北調水質監測中心, 北京 100097

2. 北京市水科學技術研究院, 北京 100048

穩定同位素指核結構穩定、不發生或不易發生放射性衰變以及半衰期極長的一系列核素. 1912年，英國物理學家John Thomson發現天然氖由20和22兩種不同質量數的原子組成，首次證明了常態元素穩定同位素的存在. 該技術的發展始于20世紀中期的穩定同位素地球化學領域，自然界常見的氫、碳、氮、氧、硫等元素都有超過一個的穩定同位素，研究者測定各類天然物質中元素的同位素組成，分析變化規律并推測原因所在.

近年來，穩定同位素技術在地球化學、環境科學、生態學、微生物學、食品科學等領域得到了廣泛應用[1-3]. 應用重點并非探究同位素豐度的分布特征，而是將其作為觀測手段研究過程、開展溯源. 物理、化學和生物過程都可造成穩定同位素的豐度差異，反之穩定同位素化學性質相同，其變化不影響過程，因此可作為示蹤劑為回溯環境、生物等多種因素對元素的共同作用提供科學有效的依據.

水是生物不可或缺的基礎物質，水生態環境不僅是環境科學和生態學的研究對象，其污染狀況、物種分布等信息也是水資源管理的重要支撐. 隨著色譜質譜聯用和傅里葉變換核磁共振技術的誕生，同位素的檢測手段愈加豐富，研究成本大幅降低，已有大量研究涉及穩定同位素在水體污染物溯源、水生生物食物網研究等不同方向的應用. 聚焦研究中最常見的碳、氮、氧穩定同位素，介紹了分餾和混合的基礎理論及模型. 水質分析方面，以氮素和硝酸鹽為例探討了氮氧穩定同位素以及以IsoSource和SIAR為代表的混合模型在污染物遷移轉化和溯源中的應用；水生態方面，基于碳氧穩定同位素特征、濃縮系數和基線生物選擇綜述了該技術在營養級、生態位和食性分析中的應用.

1 穩定同位素分餾和混合的基礎理論

1.1 改變同位素豐度變化的驅動力-分餾作用

1.1.1 分餾作用的定義

同位素中子數的差異使其質量和原子間結合力不同，也導致了地球化學及生物化學過程中擴散和反應速率的差異. 最終表現為同位素分餾(isotopic fractionation)效應，即一種元素的同位素以不同比例在不同物相中分配. 通常而言，輕同位素優先參與化學反應，造成動力學非平衡分餾[4]. 而當反應已達到化學平衡，不同化合物對重同位素的競爭導致了熱力學平衡分餾.

分餾效應形成了具有不同同位素豐度的物質庫.2H、13C、15N和18O等重同位素在環境中的絕對豐度低，一般接近或低于1%. 為了放大細微變化，便于比較，一般用樣品和國際公認標準物質同位素比值的千分差描述穩定同位素含量，記作δ.δ值越大(越正)表示重同位素越多，越小(越負)表示輕同位素越多[5].

1.1.2 自然分餾

自然界的物理過程和化學反應均會造成同位素分餾. 以氮素為例，揮發、擴散、水解、固氮、硝化、反硝化等反應體系具有不同的同位素分餾特征. 氨化作用造成的分餾僅為±1‰左右. 但硝化作用會在反應物里富集15N，濃縮系數在-29‰～-12‰之間；氨揮發也會導致NH4+中15N含量上升，氮的輕同位素更易于以NH3的形式揮發[6-7]. 李榮富等[8]總結了15N在氮循環過程各環節中的分餾系數，并指出并不是所有環節的同位素分餾都得到了清晰闡述，如硝酸鹽異化還原、厭氧氨氧化的分餾效應就暫未明確.

1.1.3 營養分餾

生物的新陳代謝會導致同位素分餾. 呼吸和排泄優先排出營養元素的輕同位素，造成食物中的重同位素在捕食者體內富集. 研究[9-10]表明，13C富集系數通常為0～1‰，而15N的濃縮系數通常為3‰～4‰，并隨著食物鏈進一步放大. 因此，與食物組成相近的δ13C常被用于追溯水體中捕食者的食物組成和貢獻，富集程度更高的δ15N則用于開展水生態系統的營養水平研究[11-14].

1.2 計算源貢獻的理論及方法-多源混合模型

分餾和混合是穩定同位素研究中的兩個重要概念. 分餾作用導致物質庫之間的同位素豐度差異，而多個物質庫的相互混合進一步造成環境中穩定同位素的復雜分布. 混合模型用數學方法推斷混合物中各物質庫的貢獻率，被廣泛應用于污染物定量溯源和捕食者食性分析.

作為最基礎的混合模型，質量平衡模型(massbalance model)可用于n種同位素和n+1個來源的溯源計算. 最常用的是2種同位素和3個來源的定量評估，可以避免單一同位素的區分度不夠(如NO3-中的15N). 但也有研究[15]指出質量平衡模型未考慮不確定性的影響，在混合物具有多種來源時不能使用. 為解決多來源的問題，2003年，Phillips等[16]通過對質量平衡方程組的反復迭代提出了IsoSource模型.IsoSource模型適用于n種同位素和＞n+1個源，獲得的不是點估計，而是分布. 2008年，Parnell等開發的SIAR(stable isotope analysis in R)模型引入了不確定性和同位素分餾的考慮，其基于狄利克雷分布和貝葉斯算法，結合似然函數和邏輯先驗分布計算貢獻率.吳文歡等[17]對質量平衡模型、IsoSource模型和SIAR模型的適用情境和使用技巧進行了詳細論述.

除質量平衡模型、IsoSource模型和SIAR模型外，IsoError、IsoEconc、IsotopeR、MixSIR等模型也在污染物溯源中有所應用，Hopkins[18]等和馮建祥等[19]均比較了它們的原理、特征和優缺點. 但在實際使用中為避免誤用，還需仔細評估背景資料是否充分，科學問題、試驗設計和模型選擇是否合理[20].

2 氮氧雙同位素在水體氮素遷移轉化及溯源中的應用

2.1 反硝化脫氮

氮循環是生物地球化學循環中的重要環節，生態系統中氮的輸入、轉化、利用和消除都是被長期探討的科學課題. 氮氧雙同位素用于脫氮過程研究，提供了用穩定同位素探討元素遷移轉化的范例.

厭氧條件下反硝化菌有偏好地利用輕同位素轉化成N2和N2O，造成15N和18O富集在剩余的NO3-中，二者的同位素分餾系數比值約為2，即δ15N升高1‰，δ18O相應上升0.5‰[6]. Xue等[7]認為，實際情況下15N和18O以1.3∶1～2.1∶1的比例富集都可以推論反硝化的發生. 水體脫氮過程中氮氧同位素分餾系數如表1所示. Panno等[26]、Houlton等[28]分別試算了森林和密西西比河中因反硝化損失的氮量，為研究氮素遷移轉化提供了新方法.

表1 水體脫氮過程中氮氧同位素分餾系數對比Table 1 Fractionation factors of nitrogen and oxygen stable isotope in aquatic denitrification

2.2 硝酸鹽溯源

我國許多地方的地表水和地下水正在面臨硝酸鹽污染[29-30]. 六成分圖、派珀圖等是硝酸鹽污染分析的經典方法[31]，但隨著同位素方法的建立和推廣，氮氧雙同位素被廣泛用于氮源定性識別. 1998年Kendall等[6]根據大量試驗結果提出了利用氮氧雙同位素示蹤不同來源硝酸鹽的經驗方法，利用δ15N的差異區分來自肥料和降水中NH4+硝化、土壤氮素、有機肥與污水的硝酸鹽，再通過δ18O的差異區分來自硝酸鹽肥料和大氣降水的硝酸鹽. 該方法得到了后續研究的證實[7,32-33].

氮氧同位素溯源研究通常需要結合水化學和其他同位素數據一起進行[34]. 例如，Min等[35]采用δ15N聯合NO3-濃度解釋了生活污水和化肥對韓國洛東江流域地下水硝酸鹽的貢獻；Nyilitya等[36]利用NO3-、Cl-、硼(boron, B)濃度和δ11B探討了肯尼亞基蘇木城和Kano平原地下水硝酸鹽來源及轉化；Wang等[37]比較了Cl-濃度與NO3-濃度、NO3-/Cl-的相關性，以討論云南程海氮素的來源和反硝化的發生；Wang等[38]在贛江流域分析了δ15N與NO3-濃度、NO3-/Cl-的關系. 此外，研究地點的背景信息(如土地使用情況)[31,38]、排放負荷和入水負荷[39]等也常被用作綜合分析.

在氮源定性識別的基礎上，量化污染源貢獻率的定量評估方法也逐漸受到青睞. 研究者將一系列數學模型用于地表水和地下水的硝酸鹽來源探討，得到氮源的相對貢獻. 近年來，IsoSource和SIAR模型在我國各地得到了越來越多的應用(見表2).

表2 穩定同位素在硝酸鹽定量溯源中的應用Table 2 Application of stable isotopes in nitrate source identification

續表 2

3 碳氮雙同位素在水生生物營養譜構建和食性研究中的應用

3.1 營養級估算

穩定同位素在營養生態學的應用始于20世紀90年代中期. 以營養分餾為基礎，聚焦水生生物體內的15N含量可反映生態系統中不同物種的營養水平.Zanden等[59]發現傳統食物分析和穩定同位素法得到的342種魚類的營養級無顯著性差異，證明了新方法的可靠性. 穩定同位素計算結果用連續數值標示生物在食物網中所處位置，與傳統方法獲得的正整數相比更能反映其在生態系統中的真實狀況[60].

捕食者和食物之間較確定的δ15N差值是穩定同位素用于營養級關系計算的基礎，根據實際需要選用有針對性的濃縮系數和基線生物是開展研究的前提.Minagawa等[10]的試驗表明15N濃縮系數的平均值±標準差為3.4‰±1.1‰，Post[61]和Mccutchan等[62]基于文獻調研的結果分別為3.4‰±0.98‰和2.2‰±0.18‰，相差不大. 多種原因造成了濃縮系數的差異，如Mccutchan等[62]發現，針對不同的食物結構和捕食者部位，15N呈現出不同的富集模式；Zanden等[63]按照生物分類(魚類和無脊椎動物)、棲息地(海水和淡水)、調查方式(實驗室和野外)和食物類型(肉食和植食)比較了15N的濃縮系數，發現后二者有顯著性差異(P＜0.05)，但整體在3‰左右；萬祎等[64]和蔡德陵等[65]分別通過渤海灣水生生物網調查和鳀魚養殖試驗得出了3.8‰和2.5‰的15N濃縮系數并得到應用[64,66]，但很多研究還是采用3.4‰[67-69].

通常情況下浮游植物的數量變動劇烈，不適合反映水域時間和空間的平均信息，因此基線生物多選用研究水域中常年存在、食性單一的浮游動物或底棲動物[70]，如魏虎進[66]等、李紅燕[71]均以水體浮游動物優勢種中華哲水蚤、太平洋紡錘水蚤、針刺擬哲水蚤作為基線生物，以其δ15N值為基線值. 也有研究[61]認為，浮游動物易受外界干擾、季節波動明顯，應選擇個體較大、生活周期長的螺類和雙殼類，如已有實際應用的福壽螺[68]、銅銹環棱螺[72]、珠蚌[73]、櫛孔扇貝[69]、翡翠貽貝[70]等. 在國內，穩定同位素技術曾被用于三峽庫區、太湖等淡水水域以及象山港、膠州灣、流沙灣等海域的連續營養譜構建，所調查的生物、使用的基線生物和濃縮系數等如表3所示.

表3 穩定同位素在國內水域營養譜構建中的應用Table 3 Application of stable isotopes in domestic trophic position calculation

3.2 生態位研究

利用δ13C-δ15N散點圖量化營養結構和生態位的方法為食物網研究提供了新思路. 在用δ13C-δ15N二維坐標關聯同位素含量和營養功能群的基礎上[79]，提出δ15N差值(δ15N range, NR)，δ13C差值(δ13C range,CR)、總面積(total area, TA)、平均離心距離(mean distance to centroid, CD)、平均最鄰近距離(mean nearest neighbor distance, NND)和平均最鄰近距離標準差(standard deviation of nearest neighbor distance,SDNND)6個指標，分別表示營養層次、食源多樣性、占據生態位或食物網中營養多樣性的總量、營養多樣性平均水平、群落的整體密度和營養生態位分布的均勻程度[80]. 該方法量化了食物網的營養結構多樣性程度和冗余度，有利于評價生態系統中每個物種的功能及生態位變化.

張文博等[81]和謝斌等[82]使用δ13C-δ15N散點圖研究了海洋漁場中小型消費者的碳氮穩定同位素比值，分別分析了華南海陵灣、陵水灣兩個水域和連云港海州灣不同季節的水生生物NR、CR、TA、CD、NND、SDNND的時空變化. 蓋珊珊等[83]和俞雅文等[84]將該方法用于不同生物的生態位研究，分別探討了兩種魚類和兩種蟹類生態位的寬度和重疊程度. 其中，蓋珊珊等[83]除NR、CR和TA外，還計算了標準橢圓面積(standard ellipse area, SEA)和營養生態位重疊面積(overlap area, OA). SEA被認為比TA更好，且更不易受樣本數量干擾[85]. OA量化了生態位的重疊程度，能更好地評價不同物種利用食物資源的競爭強弱.

3.3 食物源分析

胃含物分析是開展食性研究的經典方法，通過直接解剖動物胃腸道分析殘留食物的組成，以此了解其食物來源. 實際應用中發現其具有一系列局限性，包括樣本量小時偶然性強、不適于難以解剖的小型動物、只能反映較短時間內的攝食狀況、食物殘渣偏向難消化的食物類型等[86]. 與之相比，生物體內某些組織的穩定同位素具有較長的周轉時間，可用來研究長生命周期內消費者對食物的代謝和吸收[87-88].

與定性判斷氮源類似，可通過對比捕食者和不同來源食物的同位素值分析食物組成. 例如，當幾種潛在食源的δ13C值差異顯著，消費者的δ13C落在顆粒有機物和固著藻類之間，可認為這二者是主要食物[67]. 張波等[89]根據生物的δ13C值由棲息水層加深逐漸增大，提出了嶗山灣鰍虎魚不同生命階段攝食不同深度水生生物的變化規律；崔瑩等[90]結合中華絨螯蟹各發育階段特點和碳氮同位素比值分析其洄游期食物組成，強調了結合穩定同位素與生活習性開展分析的必要性. 定量分析方面，混合模型同樣被用于食物貢獻率計算，穩定同位素在水生生物食性研究中的應用如表4所示. 此時要注意通過胃含物、文獻查閱等傳統方法確定食源范圍，避免取回的樣品缺失重要的食物來源；另外，尤其針對15N等營養分餾較明顯的同位素，需要選取合適的分餾系數[97].

表4 穩定同位素在水生生物食性研究中的應用Table 4 Application of stable isotopes in energy sources analysis

4 其他特定化合物穩定同位素技術

利用氮氧同位素進行硝酸鹽溯源是針對化合物(或離子)中某元素開展的穩定同位素分析(compoundspecific isotope analysis, CSIA)應用之一. 在環境科學領域，CSIA也被用于鹵代烴、多環芳烴等有機污染物的溯源[98]. 而在微生物系統結構和生物化學過程解析方面，Ohkochi等[3]分離純化了日本Kaiike湖中的光合色素并測定其碳氮穩定同位素組成，解釋了與色素相關的自養微生物的生活深度、同化途徑和生物功能. Isaji等[99]測定了意大利某鹽場中營養鹽、葉綠素的δ15N變化，以此探討底棲微生物中氮素的轉化途徑及銨態氮在初級生產中的循環利用.

上文所述碳氮同位素分析食源和營養級的研究都是將個體或組織(如肌肉)作為對象，檢測同位素的整體豐度. 目前已知15N濃縮的主要原因是氨基酸代謝中的脫氨基反應有較明顯的同位素分餾，導致排泄出更輕的氮同位素[10]. 因此有研究者分離作為生物標記物的氨基酸并測定其δ15N，從中獲得與食物鏈相關的信息，其理論基礎是：生物體內以谷氨酸為代表的一類氨基酸可顯著富集15N(約8‰)，而苯丙氨酸等的15N含量隨食物鏈富集程度較弱(約0.4‰)，二者的δ15N值攜帶了濃縮系數和基線的雙重信息[100]. 另有研究[101]認為，利用谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、賴氨酸等多種氨基酸的δ15N計算營養級可能比僅采用谷氨酸和苯丙氨酸更為準確. 基于氨基酸氮元素的CSIA方法已在食物網生態學中有所應用[102]；與此類似，脂肪酸碳元素的CSIA為海洋食物網的食源分析研究、尤其是海底熱液系統中能量來源等方面提供了諸多信息[103].

隨著研究的進一步深入，還出現了針對化合物特定位置元素開展的穩定同位素分析(position-specific isotope analysis, PSIA)，以獲得更詳細的分子內同位素分布信息[104]. 例如，NO2中氮素的PSIA方法可被用于研究硝化和反硝化過程，且在一定程度上推算二者發生的比例[105]. PSIA可以解答CSIA提出的問題，加深人們對元素在環境中歸趨與去向的理解.

5 結論與展望

穩定同位素技術為研究自然和生物過程中的元素遷移轉化提供了新手段，其在水環境和水生態領域得到快速發展，在模型方法逐漸完善的同時積累了大量有價值的數據. 但在實際應用中，還存在以下需要深入解決的問題.

a) 磷是水生態系統中的重要元素，與水域富營養化關系密切. 然而除31P外，磷的其他同位素均具有放射性，無法類比碳、氮、氧的方法研究水體中磷的來源和轉化. 考慮到自然界中磷通常以磷酸鹽形式出現，目前已出現了用PO43-中氧的穩定同位素開展磷循環分析與來源解析的方法. 但由于該領域起步較晚，經驗不足，目前仍存在諸多問題.

b) 自然界的同位素比值極其復雜，其原因部分歸結于同位素分餾系數隨環境條件發生變化，且往往與混合同時發生. 因此需要認識到二者的不可分割，并在研究之前深入理解該水域中影響同位素分餾的可能因素. 以SIAR模型為代表，基于貝葉斯算法的模型納入了分餾效應和不確定性的考量，建議優先選用較新的模型進行計算.

c) 正確的參數傳入是模型獲得可靠結果的基礎.以營養級研究為例，獲取適當的濃縮系數對后續估算十分關鍵. 然而目前在用的許多濃縮系數或為實驗室的分餾試驗結果，通常是特定生物飼喂單一來源食物所得；或為野外營養級富集結果，受野外環境復雜食源影響較大；或為二者平均，可能會掩蓋多種因素對營養分餾的影響. 因此，模型的基礎參數需結合實際情況謹慎選用，必要時開展進一步試驗和討論.

整體同位素-CSIA-PSIA的進展揭示了穩定同位素技術深入化、精細化的發展趨勢. 隨著計算科學的發展，新的算法讓基于大量數據的復雜計算變得方便快捷. 未來的研究可能依托多種計算機模型開展，如更加優化的質量守恒模型、分子/原子間相互作用模型、食物網模型等，水體中污染物的轉化歸趨以及水生態系統各物種相互作用都是尺度巨大、變化眾多的復雜過程，方法學的進步將有助于穩定同位素為水科學研究提供更加合理和明確的證據.

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