含固率和接種比對菜籽餅中溫厭氧消化特性的影響

熊榮波，柳 麗，孟 艷，李 屹，陳來生，鐘啟文，韓 睿

青海大學農林科學院, 青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室, 青海 西寧 810016

通過厭氧消化生產沼氣已成為當今可再生能源生產技術的最佳選擇之一. 該過程不但能有效解決能源短缺問題，且副產物沼液沼渣可作為優質的有機肥料，用以提高農作物的產量和品質[1-2]. 要提高沼氣工程的利用率，使其繼續發揮更大的作用，僅使用傳統的畜禽糞便等原料是明顯不足的，新的有潛力原料的發掘極其重要并且備受關注. 近年來，不斷涌現出能夠用作沼氣生產的原料，如食物垃圾、城市固體廢物的有機部分、污水污泥和能源作物等[3-4]. 厭氧消化受多種因素的影響，其中含固率(TS)與接種比(RI/S)是影響啟動時間和基質產甲烷能力的直接因素，二者交互影響發酵的進程. 其中，含固率會影響厭氧消化過程中的傳質效果，造成體系有機酸的積累，進而影響產氣效果[5]；接種比決定了體系抗有機酸負荷的能力，其合理選擇對厭氧消化的運行效果和穩定性至關重要[6]. 近年來，有不少研究者對這兩種因素的交互影響進行了研究. 例如：甄月月等[7]對尾菜進行中溫批式厭氧消化試驗時發現，在含固率為8%、接種比為0.8時，累積甲烷產量最大；何品晶等[8]在35 ℃條件下對葉菜類垃圾進行厭氧消化試驗，結果表明，含固率為3%、接種比為3.5時日產甲烷速率最快，含固率為7%、接種比為3.5時累積甲烷產量最大. Pellera等[9]對4種不同廢棄物進行了不同接種比和接種物類型的厭氧發酵試驗，結果表明，最優接種比與發酵原料和接種物類型有較大關聯. 因此，不同發酵原料與接種物的含固率及接種比對厭氧發酵進程有較大影響.

我國是世界上油菜種植面積最大的國家之一. 油菜籽榨油后形成的副產物菜籽餅隨之大量產生，若不充分利用，不僅造成資源浪費，還會污染環境. 菜籽餅的主要成分是粗蛋白，是理想的產沼氣原料[10]. 目前對菜籽餅的研究主要集中在對家禽口糧的應用方面[11-12]，也有進行厭氧發酵研究的報道，如Deepanra等[13]對菜籽餅進行了不同含固率(10%～25%)的厭氧發酵研究，發現含固率為20%時的沼氣產量最大；將菜籽餅粕與微生物混合后進行厭氧發酵能夠改善其營養價值[14]. 但現階段探究含固率和接種比對菜籽餅厭氧消化產甲烷特性的相關研究較少. 因此，該研究利用全自動甲烷潛力測試系統，通過中溫厭氧消化試驗，研究含固率和接種比對菜籽餅厭氧消化產甲烷特性的交互影響，并采用修正的Gompertz模型進行動力學分析，以期為菜籽餅厭氧消化工藝的優化和提高菜籽餅資源的綜合利用率提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用菜籽餅取自青海省湟中縣多巴鎮農貿市場，粉碎過80目(0.2 mm)篩備用. 接種物取自青海某公司以牛糞為原料發酵正常的農用沼氣池. 接種污泥取回后，(35±0.5)℃下中溫培養，觀察產氣情況，培養1周左右至不再產氣，以減小背景甲烷產量，將其用作試驗接種物. 菜籽餅和接種污泥的理化性質見表1.

表1 菜籽餅及接種物特性Table 1 Characteristics of rape cake and inoculum

1.2 試驗方案

厭氧發酵試驗采用全自動甲烷潛力測試儀〔MultiTalent 203，碧普華瑞環境技術(北京)有限公司〕. 500 mL標準批式進料反應器通過水浴控制為中溫(35±0.5)℃. 設定每間隔5 min攪拌一次，每次攪拌時長為1 min.

試驗設置4種不同含固率(以TS計)-2%、4%、6%和8%，3種接種比(RI/S，接種污泥揮發性固體量與菜籽餅揮發性固體量的比值)-1.5、2.0和3.0. 如表2所示，根據試驗設定的含固率和接種比，分別在不同發酵瓶中加入對應含量的菜籽餅和接種物，用去離子水補充至400 mL. 用接種污泥與去離子水混合液作空白處理，即CK處理. 每組均設置3個重復. 從發酵24 h開始，每3 d采集一次發酵液樣品，用以測定揮發性脂肪酸(VFAs)濃度、堿度、氨氮濃度和pH. 試驗選擇在第27天停止，此時，不同含固率和接種比對整個體系產氣特性的影響已經顯現.

表2 各處理下菜籽餅和接種物的添加量Table 2 The amount of rapeseed cake and inoculum added in each treatment group

1.3 測定指標及方法

總固體含量(TS)和揮發性固體含量(VS)采用差重法測定[15]；氨氮濃度采用苯酚次氯酸鈉比色法測定[16]；揮發性脂肪酸(VFAs)濃度采用分光光度法測定[17]；pH用pH計〔pHS-2F，上海儀電科學儀器股份(中國)有限公司〕檢測；堿度用電位滴定儀〔ZDJ-4A，上海儀電科學儀器股份(中國)有限公司〕測定；總碳和總氮含量采用元素分析儀(Vario EL Ⅲ，ELEMENTAR，德國)檢測[18]；粗蛋白含量用凱氏定氮法測定[19].

1.4 動力學分析方法

對不同處理下菜籽餅發酵產甲烷過程進行動力學分析，采用目前被認為最適于描述產甲烷潛力的修正的Gompertz方程[20]對累積甲烷產量進行擬合：

式中：P為累積甲烷產量，mL/g(以VS計)；Pm為最終甲烷潛力，mL/g(以VS計)；Rm為最大產甲烷速率，mL/(g·d)(以VS計)；λ為滯留時間，d；e為常數，2.718 282.

1.5 數據處理

采用IBM SPSS statistics 26軟件進行數據處理及方差分析，采用鄧肯多重比較法分析各處理組之間的差異，P＜0.05表示具有顯著性差異；使用Origin 2018軟件制圖.

2 結果與討論

2.1 含固率和接種比對甲烷產量的影響

由圖1可見，不同含固率和接種比下日產甲烷量差異明顯. 接種比越大，發酵啟動越快.RI/S=3.0時，各處理組日產甲烷量的最大值出現在前中期(1～11 d)，即發酵啟動后厭氧微生物就開始降解原料中的有機物，在前中期大部分可利用的有機物就被消耗完畢；RI/S=1.5時，各處理組日產甲烷量的最大值出現在發酵中后期(16～21 d)，前期日產甲烷量較少，啟動較慢.這是因為，過低的接種比下微生物數量不夠，體系有機負荷增加，產甲烷菌成為優勢菌群的時間較長，導致發酵起始時間延長[21]；RI/S=2.0時，各處理組日產甲烷量的最大值出現在發酵中期(9～18 d).

圖1 各處理組的日產甲烷量Fig.1 Daily methane production of each treatment group

圖1 亦顯示，含固率對日產甲烷量也有一定影響. 在TS=8%條件下，RI/S=3.0和RI/S=2.0時，均出現了最大日產甲烷量，分別達到291.92和307.6 mL；在TS=6%條件下，RI/S=1.5時出現最大日產甲烷量，為324.82 mL；然而，TS=2%時，無論在哪種接種比條件下日產甲烷量都較小. 因此，當接種比一定時，較高的含固率下日產甲烷量也相對較高.

中溫條件下菜籽餅在不同含固率和接種比下累積甲烷產量的變化規律如圖2所示. 由圖2可見：RI/S=2.0和RI/S=3.0時，TS=6%下累積甲烷產量最高，分別達到455.58和507.31 mL/g；TS=2%下最低，分別為422.13和397.24 mL/g，均顯著低于同接種比的最大甲烷累積量(P＜0.05).RI/S=1.5時，TS=4%下累積甲烷產量最高，為454 mL/g；TS=8%下累積甲烷產量最低，為246.95 mL/g，顯著低于其余處理組(P＜0.05).這說明在接種比一定的情況下，各處理組的累積甲烷產量隨含固率的增加呈先升后降的趨勢，與關正軍等[22]的研究結果一致，因為較高含固率的發酵物料會限制中間代謝產物(包括液態的VFAs和氣態的H2、CO2等物質)的傳質效率，導致甲烷產量下降.劉丹等[25]發現，在中溫發酵體系中，當接種物與餐廚廢棄物比為90:10時，其產甲烷率最大.

圖2 各處理組的累積甲烷產量Fig.2 Cumulative methane production of each treatment group

根據不同處理下的累積甲烷產量計算其平均值(I)，由I值計算同一影響因素不同處理水平下最大累積凈產甲烷量變化的極值(Q)，用以表征該影響因素的變化給最大累積凈產甲烷量帶來變化的大小. 經計算，TS分別為2%、4%、6%、8%時，I依次為418.88、469.87、475.87、399.53 mL/g；RI/S分別為1.5、2.0、3.0時，I依次為397.78、449.66、475.67 mL/g. 可見，TS=6%、RI/S=3.0時為最優處理. 僅考慮含固率影響時，各處理組的累積甲烷產量表現為I6%＞I4%＞I2%＞I8%，即體系產甲烷能力隨含固率的增加呈先升高后降低的趨勢，該條件下最大累積凈產甲烷量變化的極值記作Q1，為76.34；僅考慮接種比時，各處理組的累積甲烷產量表現為I3.0＞I2.0＞I1.5，即體系產甲烷能力隨接種比的增加而增加，該條件下最大累積凈產甲烷量變化的極值記作Q2，為77.89.Q2＞Q1，表明菜籽餅厭氧發酵時，接種比對累積甲烷產量的影響力大于含固率.

2.2 含固率和接種比對菜籽餅厭氧發酵產甲烷潛力的影響和動力學分析

圖2 亦顯示，在高含固率條件下，累積甲烷產量隨接種比的增加而增加. 當TS=6%和TS=8%時，RI/S=3.0下的累積甲烷產量均顯著高于RI/S=1.5和RI/S=2.0處理組(P＜0.05)，且TS=6%、RI/S=3.0時累積甲烷產量最大，為507.31 mL/g. 這說明厭氧發酵系統需要有充足的接種物，微生物數量較大時，底物能夠充分地被利用并轉化為甲烷，因此在一定范圍內，接種比越大其甲烷產量越高. 該結果與已有研究基本一致，如Rodriguez-Chiang等[23]采用接種比為0.8～2.0開展了微晶纖維素生產廢水的產甲烷潛力研究，發現在接種比為2.0時累積甲烷量最大；席江等[24]研究了接種比為2.0～8.0時榨汁橙渣的厭氧發酵情況，結果表明，當接種比為8.0時，甲烷累積產率最大且發酵周期更短；

利用修正的Gompertz方程對累積甲烷產量進行擬合，確定不同處理下甲烷產出過程的動力學常數，模擬發酵的動態過程，判斷產氣滯留時間以及定量分析發酵底物的產甲烷潛力. 12個處理下菜籽餅厭氧發酵的累積甲烷產量曲線與修正的Gompertz方程擬合曲線見圖3，擬合得到的最終甲烷潛力(Pm)、產氣滯留時間(λ)和決定系數(R2)等關鍵參數如表3所示. 由表3可見，各處理的R2均在0.99以上，能較好地反映菜籽餅厭氧發酵的產甲烷規律. 含固率一定時，接種比越大，λ越小. 例如，在TS=6%條件下，RI/S分別為3.0、2.0、1.5時的λ依次為0.67、4.31、12.14 d.RI/S=3.0時的λ為0.67～2.82 d，RI/S=2.0時的λ為4.31～6.09 d，RI/S=1.5時的λ為6.18～17.73 d，說明較大的接種比發酵時系統的負荷較低，反應更容易進行，且接種比較小的情況不適合高含固率菜籽餅發酵.RI/S=3.0時各處理擬合得到的Pm和累積甲烷產量(P)較為接近，其中，TS=6%時獲得該處理組的最大值，為568.43 mL/g. 其余接種比各處理下Pm與P相差較大，說明這些處理發酵系統負荷較大，影響了累積甲烷產量.

圖3 累積甲烷產量及擬合曲線Fig.3 Cumulative methane production and fitting curve

表3 各處理組采用修正的Gompertz模型擬合得出的產甲烷參數Table 3 Modified Gompertz model parameters for each treatment group

該研究結果表明，當RI/S=3.0、TS=6%時，菜籽餅厭氧發酵獲得了最大累積甲烷產量，為507.31 mL/g，且動力學模型擬合得到了較高的甲烷潛力，為568.43 mL/g. 將該結果與其他原料相比：未經過氣爆處理的廢棄煙草葉的最大累積甲烷產量為252.7 mL/g[26]；不同預處理后蘆葦的最大累積甲烷產量為238 mL/g[27]；經預處理后的麥糠最大累積甲烷產量為199.5 mL/g[28]；餐廚垃圾在CSTR反應器55 ℃高溫時的最大累積甲烷產量為463 mL/g[29]；餐廚垃圾與污泥、秸稈不同配比聯合中溫厭氧發酵的最好配比下的累積甲烷產量為373 mL/g[30]；添加了纖維素酶和α-淀粉酶的豬糞獲得的最大累積甲烷產量為392.1 mL/g[31]. 由此可知，相比于秸稈、餐廚垃圾和糞便等原料，菜籽餅具有更高的產甲烷潛力，將其作為厭氧消化原料具有更加明顯的優勢.

2.3 含固率和接種比對厭氧發酵液特性的影響

該試驗27 d發酵過程中VFAs、堿度、氨氮濃度及pH的變化見圖4～7. VFAs是有機質經過水解和酸化形成的主要產物，是影響厭氧消化的主要因素之一[32-33]. 當厭氧發酵酸化階段產生的VFAs濃度超過4 500 mg/L時，產甲烷過程受到抑制[34]. 堿度是判斷厭氧發酵系統緩沖能力的重要指標[35-36]. VFAs濃度與堿度的比值可以反映厭氧發酵系統的穩定性，比值高于0.8時，厭氧消化過程會受到抑制[37]. 由圖4、5可見，各處理的VFAs濃度呈先升后降的趨勢，同接種比下，含固率越高，VFAs濃度峰值就越大；除了TS=8%處理組的VFAs濃度在第7天出現峰值外，其余處理組均在第4天出現峰值，因為在高含固率的情況下，中間傳質效率會降低，從而導致VFAs累積；堿度呈逐漸上升趨勢，且接種比一定時，含固率越高，堿度越大. 同時，在整個厭氧發酵過程中各處理組的VFAs濃度與堿度的比值均小于0.8，說明各處理組厭氧發酵系統均較為穩定.

圖4 各處理組VFAs濃度的變化Fig.4 Change of the concentration of VFAs in each treatment group

氨氮是厭氧微生物生長必要的營養物質之一，當氨氮濃度高于1 500 mg/L時厭氧發酵系統可能會受到影響，并且隨著氨氮濃度的升高，抑制作用逐漸增強[38]. 由圖6可見，各處理組的氨氮濃度均呈先升高后降低再趨于平緩的趨勢，且均在第10天出現峰值.同時，整個發酵階段所有處理的氨氮濃度均未超過1 200 mg/L，說明各處理組全程均未出現氨抑制.

圖5 各處理組堿度的變化Fig.5 Change of alkalinity concentration in each treatment group

圖6 各處理組氨氮濃度的變化Fig.6 Change of ammonia nitrogen concentration in each treatment group

pH是影響厭氧消化進程的主要因素之一. 產甲烷菌在pH為6.0～8.0時均可生長，其產氣的最佳pH為6.5～7.5[39]；pH過高或過低均可能抑制產甲烷菌的活性[40]. 由圖7可見，整個發酵階段各處理組的pH在6.5～8.0之間變化，屬于產甲烷菌的正常范圍.RI/S=1.5和RI/S=2.0時，各處理組的pH均呈先降低后升高的趨勢，且均在第4天時pH最低，符合多數厭氧消化體系pH的變化規律. 這是因為，厭氧消化初期菜籽餅占比較大，其水解酸化造成VFAs過度積累，導致pH降低；之后隨著產甲烷菌活性的恢復，積累的VFAs被逐漸消耗，pH逐漸上升[39]；pH在后期穩定在7.4～7.8左右(除TS=8%、RI/S=1.5處理外，因在接種比低而含固率過高的條件下會出現整個發酵體系VFAs始終累積的現象). 相比于RI/S=1.5和RI/S=2.0，RI/S=3.0時各處理的pH呈升高-降低-回升-趨于平緩的趨勢，均在第10天時pH最低. 在較高接種比的發酵系統中，微生物相應較多，菜籽餅水解產生的VFAs能迅速被微生物吸收，不會導致酸化；且該時期含氮大分子逐漸分解，產生氨氮物質，也能使pH上升[41].

圖7 各處理組pH的變化Fig.7 Change of pH value in each treatment group

3 結論

a) 不同含固率和接種比均對菜籽餅中溫厭氧消化的發酵啟動時間和累積甲烷產量產生影響，且接種比的影響大于含固率.

b) 在試驗研究參數范圍內，接種比越大，發酵啟動越快；接種比一定時，累積甲烷產量隨含固率的增加呈先升高后降低的趨勢；在高含固率條件下，累積甲烷產量隨接種比的增加而增加. 當RI/S=3.0、TS=6%時累積甲烷產量最大，為507.31 mL/g. 含固率一定時，接種比越大，產氣滯留時間(λ)越短. 結果顯示，菜籽餅作為厭氧消化原料的潛力較為明顯.

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