銀杏葉中蛋白質的提取工藝研究

楊興變,張蜀美,2,李 俊,2,王黔陽,何 珺*

(1.貴州省生化工程中心,貴州 貴陽 550025;2.貴州大學藥學院,貴州 貴陽 550025;3.貴州貝因特生物技術有限公司,貴州 貴陽 550025)

中國是銀杏主產國，約占全球的80 %，銀杏葉為銀杏科植物銀杏(L.)的干燥葉，具有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效，主要含有黃酮類、萜內酯類、有機酸類、酚類、多糖、蛋白質等多種活性成分，其中黃酮類、萜內酯類為銀杏葉提取物的主要活性成分，是銀杏葉開發利用的重點，而對其蛋白質相關研究較少，從銀杏葉中提取蛋白質更是未見報道，只見以雜質形式被祛除的報道。蛋白質是生命體重要的組成部分，是食物中的重要組成部分，同時也是藥物研究的重要靶點，但目前蛋白質資源短缺尤為嚴峻，因此，解決蛋白質資源短缺已經成為全球關注的熱點問題。據查閱文獻， 銀杏干葉中蛋白質含量5.98 %，可以作為一種蛋白質來源加以利用。銀杏葉蛋白質中含有亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和色氨酸等人體必需的6種氨基酸。然而，在生產銀杏葉提取物時，大量的水溶液、水洗液被直接丟棄，而銀杏葉中的蛋白質就在被直接丟棄的水溶液、水洗液中，造成了資源的浪費。因此，本文利用正交法建立銀杏葉中蛋白質的提取方法，使銀杏葉在生產銀杏葉提取物的同時，可對其蛋白質進行提取回收利用。這不僅可以提高銀杏葉資源的綜合利用率，還可以減少生產廢液的排放，為銀杏產業的發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子天平(BSA124S，賽多利斯科學儀器公司)；紫外可見分光光度計(Cary 60 UV-Vis，Agilent Technologies)；電熱鼓風干燥箱(GZX-9140 MBE，上海博訊實業有限公司醫療廠)；電熱恒溫水鍋浴(HH.W21-600C，常州華奧儀器制造有限公司)；粉碎機(FSJ-A05N6，龍港市創達商貿有限公司)等。

氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅，均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

1.2 試驗材料及對照品

材料：銀杏葉(8年生干銀杏葉，2020年7月20號購于道真華山綠色產業公司)；

對照品：酪蛋白(含量>96%，批號：202009 02，山東萍聚生物科技有限公司)；

雙縮脲試劑：精密稱取30.15 g的氫氧化鈉溶于300 mL的水中得到A液，精密稱取酒石酸鉀鈉5.99 g和無水硫酸銅1.50 g溶于500 mL的水中得到B液，將A、B液混合搖勻即得。

酪蛋白標準品溶液的制備：精密稱取0.5002 g酪蛋白于100 mL容量瓶中，加入0.05 mol/mL的氫氧化鈉溶液，定容，搖勻，即得5.00 mg/mL的酪蛋白標準品溶液。

1.3 試驗方法

..蛋白質標準曲線繪制

取7支具塞試管，按表1系列梯度精密移取酪蛋白標準溶液和純水。

快速在每支試管中加入6 mL的雙縮脲試劑，振蕩均勻，加完后置于室溫下反應30 min，然后在560 nm波長下，以純水為空白，迅速測其吸光度并繪制標準曲線。

銀杏葉蛋白質含量測定：分別將對應的對照品溶液與供試品溶液放入紫外分光光度儀，記錄各自吸光度值，根據線性關系計算相應的濃度，其質量及含量按公式(1)、(2)計算：

蛋白質的質量(mg)=測定蛋白質濃度(mg/mL)×樣液體積(mL)

(1)

蛋白質的含量=蛋白質質量(mg)/樣品的質量(mg)×100%

(2)

..銀杏葉中蛋白質提取單因素考察

將銀杏葉放在60 ℃的電熱鼓風干燥箱中烘至完全干燥，粉碎，過 80目篩，得到銀杏葉粉末供試品。

提取溫度考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。按1∶10的料液比加入蒸餾水，分別在設定的溫度20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃條件下，水浴提取1 h，趁熱抽濾即得不同溫度提取的供試品溶液；按照銀杏葉蛋白質含量測定方法測其吸光度值。

料液比考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。分別按不同的1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14等料液比加入蒸餾水，在80 ℃條件下，水浴提取1 h，趁熱抽濾即得不同料液比提取的供試品溶液；按照銀杏葉蛋白質含量測定方法測其吸光度值。

提取時間考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。按1∶10的料液比加入蒸餾水，在80 ℃條件下，分別水浴提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，趁熱抽濾即得不同時間提取的供試品溶液；按照銀杏葉蛋白質含量測定方法測其吸光度值。

..銀杏葉蛋白質提取正交試驗

根據單因素結果，結合文獻[12-15]和實際大生產的經驗，以水為溶劑，料液比、提取時間、溫度為主要因素，各個因素設置三個水平，進行正交試驗分析，因素和水平值見表2。

表1 標準曲線繪制(n=3)Tab.1 Standard curve drawing (n=3)

表2 正交試驗因素水平表(n=3)Tab.2 Factor level of orthogonal experiment (n=3)

精密稱取銀杏葉粉末1.00 g置于試管中，根據正交試驗因素水平表中料液比的要求，加入相對應的純水并將其密封好，平行操作下水浴加熱提取，濾過，獲得提取液，將其稀釋不同倍數并加入雙縮脲溶液6.0 mL，在室溫下反應30 min，在560 nm測其吸光度，根據公式(1)、(2)和線性關系計算含量。

..重復性驗證試驗

平行稱取三批次銀杏葉粉末，按正交試驗最佳方法提取銀杏葉中的蛋白質，濾過，得到提取液，取樣測其含量。

2 結果與分析

2.1 線性關系的結果

以對照品濃度為X軸(橫坐標)，以吸光度值為Y軸(縱坐標)繪制標準曲線，結果見圖1。

圖1 酪蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of casein

由圖1得到酪蛋白在λ=560 nm波長條件，其標準曲線為=0.0645+0.0037(=0.998)，表明酪蛋白在0.50～5.00 mg/mL的范圍內線性關系良好，可用于后續銀杏葉中提取蛋白質的檢測。

2.2 單因素考察結果

以計算得到銀杏葉中蛋白質的百分含量與對應的提取溫度、料液比、提取時間作圖，結果分別見圖2、圖3和圖4。

由圖2可知，隨著溫度的上升，銀杏葉中蛋白質提取百分含量逐漸上升，80 ℃達到最高，溫度繼續上升反而降低，這有可能溫度過高，導致蛋白質不可逆變性沉淀，檢測時保證溶液的清亮而被過濾損失，故選擇 60 ℃、70 ℃、80 ℃ 三個水平進行正交試驗。

圖2 提取溫度對銀杏葉蛋白質提取的影響Fig.2 Effect of extraction temperatures on protein extraction from Ginkgo biloba leaves

圖3 料液比對銀杏葉蛋白質提取的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on protein extraction from Ginkgo biloba leaves

由圖3可知，料液比為1∶8時，銀杏葉中蛋白質基本被完全提取出來，隨著料液比增加，銀杏葉中蛋白質的提取百分含量已經平穩，故選擇料液比1∶6、1∶8、1∶10 三個水平進行正交試驗。

圖4 提取時間對銀杏葉蛋白質提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on protein extraction from Ginkgo biloba leaves

由圖4可知，隨著提取時間的增加，銀杏葉中蛋白質提取百分含量逐漸上升，提取越充分，但到達2 h后，銀杏葉中蛋白質的提取百分含量增加較緩慢，故選擇提取時間1 h、2 h、3 h 三個水平進行正交試驗。

2.3 正交試驗數據與結果

由極差分析結果(表3)可以看出，C因素影響效果比較顯著；考察因素強度為C>B>A，A因素中A2>A3>A1，B因素中B2>B1>B3，C因素中C2>C3>C1，最佳工藝條件為A2B2C2，即是料液比為1∶8，提取時間為2 h，提取溫度為70 ℃ 。

表3 正交試驗數據與結果Tab.3 The orthogonal test data and results

2.3 驗證試驗數據與結果

從驗證試驗結果(表4)可以看出，三批次提取液中含量相差不大，說明工藝穩定，可以有效的提取銀杏葉中的蛋白質。

表4 驗證試驗數據與結果Tab.4 The validation test data and results

3 結論與討論

蛋白質是一切生命活動的基礎，也是構成生物細胞的重要成分，是動物或者人類都不可缺少的物品。然而目前遇到非常嚴峻的問題，在全球約有1/5的人口嚴重缺乏蛋白質的補充，蛋白質資源短缺已經成為全球關注的問題，特別是發展中國家。除此之外，蛋白質也是藥物研究的重要靶點。因此，解決蛋白質資源短缺已經成為全球關注的熱點問題。

中國是世界上銀杏分布最廣的區域，約占全球的85 %，銀杏葉富含多種活性物質，例如黃酮、內酯、多糖和烷基酚酸等。目前，銀杏的研究一直以來都吸引無數國內外科研工作者的眼球，尤其是以黃酮、萜內酯為主要有效成分的銀杏葉提取物的研究最受矚目，是銀杏葉開發利用的重點。據文獻[6,11]報道，銀杏葉中蛋白質含量相對來說不少，可作為蛋白質來源的一種。本文采用正交法，以水為溶劑，料液比、提取時間、溫度為主要因素對銀杏葉中蛋白質提取，紫外分光光度法對其進行含量測定。通過正交試驗得到銀杏葉中蛋白質提取工藝為：料液比為1∶8、提取時間為2 h、提取溫度為70 ℃。驗證試驗得到三批次提取液中蛋白質含量為3.72 %，RSD%為0.12，說明該工藝穩定，可以有效的提取銀杏葉中的蛋白質，該方法經濟、簡便，重復性好，可快速有效地從銀杏葉中提取蛋白質，使銀杏葉在生產銀杏葉提取物的同時，可對其蛋白質進行提取回收利用。這不僅可以提高銀杏葉資源的綜合利用率，還可以減少生產廢液的排放，為充分利用銀杏葉資源提供實踐依據。