高苯丙氨酸血癥檢測技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用及家系基因研究*

李雨雨，許 佳，劉 娜，李洪俞，王燕，牟 凱

淄博市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，山東淄博 255000

高苯丙氨酸血癥(HPA)是一種常染色體隱性單基因遺傳病，主要分為兩類：一類是由于苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺乏導(dǎo)致的苯丙酮尿癥(PKU)和輕度HPA，其中PKU最為常見;另一類是由于PAH的輔酶四氫生物蝶呤缺乏導(dǎo)致的四氫生物蝶呤缺乏癥[1-3]。上述酶的缺陷會導(dǎo)致血液苯丙氨酸(Phe)代謝障礙和旁路毒性代謝產(chǎn)物積累，進而引發(fā)智力障礙、發(fā)育遲緩、運動失調(diào)、黑色素缺乏、癲癇等不同程度且不可逆損傷[4-5]。HPA患兒早期多無明顯的臨床癥狀，不同的疾病類型其診斷和治療方法也不同。因此，不同HPA檢測方法的聯(lián)合應(yīng)用有利于對疾病進行鑒別診斷和對癥治療。我國北方尤其是西北地區(qū)HPA發(fā)病率普遍高于南方，具有人群和地域差異性[5-6]。大多數(shù)HPA患兒是由于PAH基因突變所致，種類多樣，區(qū)域分布不同。本研究通過對本院近3年新生兒足跟血Phe篩查情況進行回顧性分析，了解本地區(qū)HPA主要檢測技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用、發(fā)病率及患兒家系基因變異等最新情況，為新生兒遺傳代謝病篩查質(zhì)量的提高、產(chǎn)前診斷、擴充基因突變譜及遺傳咨詢等提供參考依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年12月在本院進行HPA篩查的128 997例新生兒作為研究對象，新生兒家屬均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集 按照《新生兒遺傳代謝病篩查技術(shù)規(guī)范》要求，新生兒出生2～7 d并充分哺乳，最遲不超過出生后 20 d，采集足跟血滴于專用濾紙片上。血斑要求至少3個且直徑均大于 8 mm，自然滲透無污染。血斑晾干后于 2～8 ℃冷藏，及時遞送至淄博市醫(yī)學(xué)遺傳科新生兒疾病篩查中心。

1.2.2檢測方法 熒光法：采用美國Perkin Elmer(PE)公司的全自動P9打孔儀,打取直徑3.2 mm干血片于96孔U型板中，將PE公司的Phe測定試劑和樣品微孔板裝載入全自動免疫熒光分析儀(GSP)進行檢測。串聯(lián)質(zhì)譜法：采用美國 Waters-TQ Detector 串聯(lián)質(zhì)譜儀、Waters 2777c 自動進樣器、Waters 1525高效液相色譜泵，PE公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒進行檢測。打取3.2 mm干血片于96孔U型板中，每孔加入 100 μL 含氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮內(nèi)標的萃取液，貼上封口膜。然后，45 ℃恒溫振蕩孵育45 min，吸取75 μL至96 孔V型板中，鋁箔紙覆蓋，琥珀酰丙酮衍生2 h后上機檢測。基因檢測：應(yīng)用基因捕獲配合高通量測序分析技術(shù)進行PAH基因檢測，Sanger測序進行結(jié)果驗證。

1.3結(jié)果判斷 初篩陽性標本立即召回復(fù)查，復(fù)查結(jié)果仍為陽性者通過血串聯(lián)質(zhì)譜、尿氣相-色譜質(zhì)譜、尿蝶呤譜、紅細胞二氫蝶啶還原酶測定、下一代測序技術(shù)(NGS)等相關(guān)檢測進行診斷，一旦確診為HPA患兒，由本院專家負責(zé)建檔案統(tǒng)一管理，并進行治療與隨訪。除四氫生物蝶呤缺乏癥，按照血Phe濃度可分為經(jīng)典型PKU(Phe≥1 200 μmol/L)、中度PKU(360～<1 200 μmol/L)、輕度HPA(120～<360 μmol/L)。

1.4質(zhì)量控制 室內(nèi)質(zhì)量控制：每板均做低、高質(zhì)控品進行質(zhì)量監(jiān)測，結(jié)果均在允許誤差范圍內(nèi)發(fā)放報告。室間質(zhì)評，本科室每年都會參加國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心和美國疾病控制與預(yù)防中心的室間質(zhì)量評價，成績均合格。

2 結(jié) 果

2.1熒光法和串聯(lián)質(zhì)譜法在HPA檢測中的應(yīng)用 本科室利用GSP熒光法共檢測128 997例新生兒足跟血Phe濃度，其中79 732例同時利用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測Phe濃度、Phe/酪氨酸(Tyr)比值和其他10種氨基酸及31種肉堿水平。兩種檢測方法均能有效檢出11例確診HPA患兒，均可用于新生兒HPA的篩查。2019年下半年，由于PE 公司GSP-Phe試劑盒生產(chǎn)工藝改變導(dǎo)致初篩陽性率明顯降低，綜合99.00%百分位數(shù)1.75和2018年度初篩陽性率1.10%，將GSP-Phe項目切值由2.00 mg/dL重設(shè)定為 1.70 mg/dL，2020年初篩陽性率為1.22%。見表1、2。

表1 2018-2020年P(guān)he濃度百分位數(shù)(mg/dL)

表2 2018-2020年新生兒HPA篩查情況

2.22018-2020年新生兒HPA篩查結(jié)果分析 魯中地區(qū)近3年接受HPA篩查的128 997例新生兒，初次篩查可疑陽性數(shù)為1 212例，召回1 135例，召回率為93.65%。HPA最終確診11例，其中PKU 9例，輕度HPA 2例，無四氫生物蝶呤。見表2。

2.3HPA患兒基因家系驗證結(jié)果分析 11例HPA確診患兒中有2例進行了高通量測序和Sanger測序變異位點的家系驗證。先證者1 PAH基因檢測出3個雜合變異，根據(jù)家系驗證結(jié)果表明，明確致病變異c.842+2T>A和意義未明變異c.158G>A均遺傳自父親；意義未明變異c.155T>G遺傳自母親。其父親、母親、姐姐表型均正常，表明c.155T>G基因突變可能具有致病性，與c.842+2T>A致病變異組成PAH基因復(fù)合雜合突變，影響PAH基因功能，進而導(dǎo)致先證者1表現(xiàn)PKU。見表3。先證者2 PAH基因檢測出兩個雜合致病變異，致病變異c.728G>A來源于其父親，致病變異c.740G>T來源于其母親。其父親、母親表型均正常，先證者2來源于父母雙方的兩個致病變異組成PAH基因復(fù)合雜合突變，進而表現(xiàn)出PKU。見表4。

表3 先證者1 PAH基因變異驗證結(jié)果

表4 先證者2 PAH基因變異驗證結(jié)果

3 討 論

HPA是一種常見的常染色體隱性遺傳代謝病，可通過檢測新生兒足跟血Phe濃度達到早篩查、早診斷、早治療，避免神經(jīng)系統(tǒng)等不可逆損傷。常采用的HPA檢測方法有熒光法、串聯(lián)質(zhì)譜法、基因測序等，通過不同檢測方法的聯(lián)合應(yīng)用，使得HPA疾病研究更為透徹深入，更有利于疾病的早期診斷。不同國家和地區(qū)HPA發(fā)病率不同，具有明顯的人群和地域差異性，了解HPA發(fā)病率和分子流行病學(xué)特征可為本地區(qū)HPA診斷、治療提供參考依據(jù)[7-9]。在HPA中PKU發(fā)病率較高，輕度HPA較少，PAH基因復(fù)合雜合變異或純合變異是PKU重要的致病因素，其中76%PKU患者具有PAH基因復(fù)合雜合變異，純和變異較少[10]。目前，國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫收錄的PAH 基因變異達1 000多種，但其基因型與表型相關(guān)性也較為復(fù)雜，尚需繼續(xù)進行該臨床數(shù)據(jù)和功能機制的收集與研究[11-12]。

本研究采用熒光法、串聯(lián)質(zhì)譜法檢測新生兒足跟血Phe濃度來進行HPA篩查。不同HPA檢測方法因儀器、實驗原理、試劑工藝和廠家等不同，具有不同的參考范圍。因此，不同地區(qū)、不同實驗室應(yīng)建立并適時調(diào)整符合自身的切值范圍，避免HPA患兒的漏篩和假陽性率過高等[13]。2019年下半年，本研究發(fā)現(xiàn)因GSP-Phe試劑盒生產(chǎn)工藝改變，初篩陽性率明顯降低。綜合分析后將切值由2.00 mg/dL重設(shè)定為 1.70 mg/dL，同時利用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測近期Phe濃度處于臨界范圍的標本，未發(fā)現(xiàn)患兒漏篩。本地區(qū)近3年HPA確診患兒11例，發(fā)病率與文獻[3,14]結(jié)果基本一致，高于文獻[15]的結(jié)果。其中2例PKU患兒通過基因檢測和家系驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PAH基因變異為復(fù)合雜合變異；PAH致病變異c.842+2T>A,c.728G>A,c.740G>T和意義未明變異c.158G>A在中國比較常見[16]；PAH c.155T>G變異為新發(fā)變異，文獻鮮少報道。家系驗證結(jié)果表明PAH c.155T>G很可能具有致病性，這對于生化表型不明顯患者、疾病鑒別診斷、再生育的遺傳咨詢等具有重要意義，有利于豐富PKU基因型和表型相關(guān)性數(shù)據(jù)庫。本研究不足之處在于家系分析標本較少，應(yīng)加大HPA確診患兒家系驗證標本量，明確致病基因變異，提高遺傳咨詢、出生缺陷防控能力。

隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展，NGS在新生兒遺傳代謝病中的應(yīng)用越來越廣泛，對于生化檢測和串聯(lián)質(zhì)譜不能明確分型、不能篩查的疾病更具優(yōu)勢[17]。但是，NGS中的靶基因測序和全外顯子測序可檢出大量基因突變位點，報告解讀需結(jié)合生化和串聯(lián)質(zhì)譜等檢測結(jié)果，綜合分析基因型和表型相關(guān)性。尤其對于致病突變不明確的，通過基因檢測其家系基因變異情況，更有利于疾病的追根溯源，實現(xiàn)早診斷、早治療。

本項目創(chuàng)新之處在于探討了HPA檢測技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用及其存在的相關(guān)問題，以及家系基因的發(fā)現(xiàn)和新發(fā)變異PAH c.155T>G為致病變異。目前，有研究報道中國人群中有100多種PAH基因變異，但未發(fā)現(xiàn)此類型變異[18-19]。通過不斷累積PAH新發(fā)變異，可進一步擴充PAH基因變異及致病性的數(shù)據(jù)量，有助于分子診斷報告的解讀。

綜上所述，本研究系統(tǒng)分析了近3年HPA篩查應(yīng)用情況，熒光法、串聯(lián)質(zhì)譜法、分子檢測相結(jié)合將是本地區(qū)新生兒HPA篩查的有效策略。綜合分析HPA發(fā)病率、家系基因驗證等最近相關(guān)數(shù)據(jù)，可進一步為新生兒遺傳代謝病篩查、診治和遺傳咨詢等提供相關(guān)參考依據(jù)。